Saggio comportamenti alimentari predatori in Pristionchus E altri nematodi

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di analizzare in modo affidabile i comportamenti alimentari complessi nei nematodi predatori utilizzando diversi nuovi saggi. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia comportamentale, come la regolazione di nuovi comportamenti complessi e, in effetti, anche l'evoluzione. Il principale vantaggio di queste tecniche è che forniscono metodi rapidi e facilmente ripetibili, al fine di osservare e quantificare i comportamenti alimentari predatori nei nematodi, incluso l'organismo modello satellite, Pristionchus pacificus.

Per visualizzare i morph della bocca del nematode, immobilizzare prima i vermi con un trattamento anestetico delicato su un tampone di agarosio al 2% appena fatto. Per fare un tampone, aggiungere con cura 10 microlitri di una soluzione di azoturo di sodio al 10% a tre millilitri di agarosio fuso e mescolare accuratamente. L'azoturo di sodio è reattivo e tossico, quindi prendi le dovute precauzioni.

Quindi, versare almeno 300 microlitri di miscela al centro di un vetrino da microscopio standard e utilizzare un altro vetrino per appiattire l'agarosio. Lasciare il cursore superiore in posizione fino a quando il cuscinetto sta per essere utilizzato. Per preparare il pad per l'uso, rimuovere la slitta superiore e aggiungere una goccia di M9. Quindi raccogli due o tre vermi, mettili nella goccia e applica con cura un vetrino coprioggetti.

Osserva i vermi con l'ottica Nomarski 63x per classificare le loro identità di metamorfosi. Un dente dorsale allargato, un dente subventrale aggiuntivo o un'apertura della bocca larga e allargata sono tutte caratteristiche di un animale euristomatoso. Mentre un singolo dente dorsale e un'apertura della bocca più stretta indicano un animale stenostomatoso.

Entro cinque minuti, rimuovere i nematodi dal tampone anestetico. Sfilare delicatamente il vetrino coprioggetto e trasferirli su una nuova piastra MGM. Attendi fino a quando non mostrano un comportamento mobile prima di qualsiasi ulteriore analisi.

Con una maggiore esperienza, il morph può essere analizzato senza trattamento anestetico. Trasferire da 10 a 20 nematodi da una piastra di coltura standard su una piastra fresca seminata con un prato batterico di OP50 per una rapida fenotipizzazione della forma orale utilizzando uno stereomicroscopio ad alto ingrandimento. Quindi rilevare le differenze nelle dimensioni e nella larghezza della bocca.

A questo ingrandimento, non sono osservabili strutture simili a denti, quindi identifica i morph della bocca in base alla loro larghezza. Quindi distingui le bocche larghe da quelle strette. Realizzare le piastre di analisi coltivando una grande quantità di larve di nematodi prede selezionate, come C.elegans allo stadio larvale, o una preda ecologicamente rilevante appropriata.

Affamare quattro o più piastre della specie di prede per raccogliere le larve L1. Successivamente, lavare le piastre con M9 e passare la raccolta attraverso due filtri da 20 micron. Nella soluzione dovrebbero rimanere solo le piccole larve.

Pellettare le larve a 377 g per un minuto. Rimuovere il surnatante M9 in un becher di scarto e prelevare un'aliquota da tre microlitri di pellet di verme puro. Depositate i vermi al centro di una piastra MGM di sei centimetri senza E.coli e lasciateli stendere per circa mezz'ora.

Successivamente, utilizzare le larve per il test del morso. Trasferire i predatori sulla piastra di analisi con la minor quantità possibile di batteri OP50. Per P.pacificus, aggiungi cinque predatori al piatto.

Attendere 15 minuti per consentire agli animali trasferiti di riprendersi dallo stress. Dopo 15 minuti, i vermi dovrebbero muoversi normalmente o potrebbero essere stati danneggiati. Ora osserva e registra eventi distinti da uno dei predatori per 10 minuti.

Il morso è caratterizzato dal fatto che il predatore limita il movimento della preda. L'uccisione avviene quando la cuticola della preda è aperta. L'alimentazione è caratterizzata da un consumo osservabile delle interiora delle prede.

Osservare almeno 10 singoli nematodi predatori per garantire la precisione. Il pompaggio faringeo e il movimento dei denti possono essere osservati con l'ottica Nomarski con un ingrandimento da 40 a 63x e registrati con una telecamera ad alta velocità a 50 hertz. Dopo aver registrato clip di 15 secondi di almeno 20 animali, i video possono essere analizzati in modo affidabile.

Il pompaggio si osserva nel corpo, situato al centro della faringe. Il movimento dei denti è rilevabile nell'apertura della bocca e si osserva solo dal dente dorsale. Dopo due ore di predazione, controllare la lastra per i cadaveri vuoti.

Identificare i cadaveri in base alla loro assenza di motilità e agli evidenti difetti morfologici, tra cui perdite di interiora o frammenti di vermi mancanti. A seguito dell'identificazione del morph della bocca appropriato in P.pacificus, sono state osservate chiare differenze tra animali euristomatosi e stenostomatosi. Solo gli animali euristomatosi si impegnavano in comportamenti di uccisione.

Inoltre, sono evidenti anche le differenze nell'attività dei denti e nel pompaggio faringeo degli animali euistamatici su batteri e prede. Durante l'alimentazione predatoria, la velocità di pompaggio è ridotta al di sotto di quella osservata durante l'alimentazione batterica e il movimento dei denti è uniforme con il pompaggio faringeo. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come combinare questi diversi saggi al fine di caratterizzare i complessi comportamenti alimentari predatori nei nematodi, incluso l'organismo modello satellite Pristionchus pacificus.