Identificazione di acidi grassi a Bacillus cereus

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare gli acidi grassi dai batteri e identificare la posizione della ramificazione metilica e dei doppi legami. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della batteriologia, come il ruolo degli acidi grassi nel modo in cui i batteri si adattano al loro ambiente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è richiesta la prolificazione degli acidi grassi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'identificazione batterica a causa dell'importanza della composizione degli acidi grassi nella tassonomia batterica. Sebbene questo metodo sia stato sviluppato sul batterio Bacillus cereus, è anche molto rilevante per studiare altre specie contenenti acidi grassi a catena ramificata. In generale, nello sviluppo di questo metodo, abbiamo faticato.

Perché l'attuale metodo di identificazione per gli acidi grassi non identifica la ramificazione metilica in posizione di doppio legame. Per iniziare questa procedura, preparare un prato dei batteri spargendo 100 microlitri di una coltura notturna del ceppo, incubato a 30 gradi Celsius in LB sulla superficie della piastra di terreno di agar LB. Incubare la piastra per una notte a 30 gradi Celsius.

Per ottenere gli acidi grassi lipidici, raccogliere le cellule batteriche raschiando le colonie dalla piastra di agar. E trasferendo circa 40 milligrammi in un tubo di vetro da dieci millilitri con tappo a vite e guarnizione in PTFE. Per eseguire la transesterificazione, aggiungere cinque millilitri di idrossido di potassio 0,2 molare in metanolo alle cellule batteriche fresche.

Vortice e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, aggiungi un millilitro di acido ascetico molare per abbassare il pH a sette. Ora, aggiungi tre millilitri di esano e agita un minuto per estrarre gli esteri metilici degli acidi grassi o FAME.

Trasferire la fase superiore in provette pulite e concentrare per evaporazione a temperatura ambiente sotto un flusso continuo di azoto fino ad ottenere circa 200 microlitri di estratto di FAME. Quindi, trasferire gli estratti in fiale GC con inserti. Iniettare gli estratti in un sistema di spettrometria di massa gascromatografica o GC-MS dotato di colonna capillare.

Impostare la temperatura della porta di iniezione a 250 gradi Celsius. Mantieni la temperatura del forno a 50 gradi Celsius per un minuto. Aumentare a 190 gradi Celsius a una velocità di 20 gradi Celsius al minuto e aumentare a una temperatura finale di 230 gradi Celsius a una velocità di due gradi Celsius al minuto.

Per la MS, registrare gli spettri di massa mediante ionizzazione elettronica, o EI, a 70 elettronvolt, e impostare l'acquisizione della corrente ionica totale tra 50 e 400 unità di massa atomica, o AMU. Sciogliere un campione dell'estratto secco di FAME in un millilitro di diclorometano secco. Quindi, aggiungere la soluzione di estratto e 0,2 millilitri di 3-piridinemetanolo a 0,1 millilitri di un molare di terz-butossido di potassio in tetraidrofurano.

Riscaldare la soluzione a 40 gradi Celsius per 30 minuti in una fiala chiusa. Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere due millilitri di acqua deionizzata purificata e quattro millilitri di esano. Mescolare la soluzione per un minuto con un miscelatore a vortice.

Dopo aver lasciato separare le fasi, raccogliere la fase organica superiore. Quindi, aggiungi solfato di sodio anidro fino a quando la fase organica non è limpida. Trasferire la fase organica in una provetta pulita, quindi far evaporare la fase organica sotto un flusso di azoto fino a raggiungere un volume di circa 200 microlitri.

Aggiungere 250 milligrammi di 2-ammino-2-metil-1-propanolo al campione di estratto secco di FAME. Sciacquare il tubo con azoto e chiuderlo con un tappo. Quindi, riscalda la soluzione a 190 gradi Celsius per una notte.

Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere tre millilitri di diclorometano e cinque millilitri di acqua deionizzata purificata. Agitare il composto e lasciare che le fasi si separino. Quindi, rimuovere la fase acquosa.

Successivamente, lavare la fase organica con cinque millilitri di acqua. Aggiungere solfato di sodio anidro fino a quando la fase organica non è limpida. Dopo aver trasferito la fase organica in una nuova provetta, farla evaporare sotto un getto di azoto fino a raggiungere un volume di circa 200 microlitri.

Lo spettro di massa derivato picolinario I16 conferma la ramificazione metilica. Il divario di 28 AMU tra gli ioni a 304 e 332 corrisponde ai frammenti creati prima e dopo il carbonio ramificato. Gli ioni diagnostici, 113 e 126, caratteristici dei derivati DMOX, sono mostrati qui.

Lo ione molecolare 307 è caratteristico dell'isomero 16:1 e un gap di 12 AMU tra 196 e 208 indica un doppio legame al carbonio. Il gap di 12 AMU non si osserva più quando il doppio legame è prima del carbonio 7. L'intenso ione 153, caratteristico di un doppio legame al carbonio 5, e lo ione molecolare 307 nello spettro di massa derivato DMOX hanno identificato questo composto come n16 one delta five.

Lo ione 307 del derivato DMOX e lo ione 345 del derivato picolinario indicano un isomero di acido grasso 16:1. Un gap di 28 AMU indica la posizione di ramificazione e un gap di 12 AMU per DMOX e 26 AMU per l'estere picolinario identifica il doppio legame. Gli acidi grassi e i corrispondenti ioni diagnostici identificati nel Bacillus cereus sono elencati qui.

Gli ioni diagnostici identificano le posizioni di ramificazione metilica e di doppio legame sulla catena di carbonio per il DMOX e i derivati dell'estere picolino. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni, se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, gli acidi grassi possono essere quantificati mediante GC-MS e il rilascio dei derivati FAME.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della batteriologia per esplorare la diversità batterica e i meccanismi di adattamento batterico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare gli acidi grassi nei batteri, inclusi gli acidi grassi ramificati in metile e insaturi. Non dimenticare che lavorare con i reagenti può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare con una cappa da laboratorio e indossare guanti.