4.9: Coloranti FM nel riciclaggio delle vescicole

I coloranti FM sono coloranti a membrana ampiamente utilizzati per il riciclaggio delle vescicole. Questo è il processo mediante il quale una cellula forma vescicole dalla propria membrana per preservare le dimensioni delle cellule, riutilizzare proteine costose e trasportare consecutivamente le molecole nello spazio extracellulare. Questo processo è più comunemente studiato nelle sinapsi neuronali, dove è coinvolto nel rilascio di neurotrasmettitori. Oltre a esaminare il riciclaggio delle vescicole, i coloranti FM vengono utilizzati per studiare diversi altri fenomeni, come la secrezione nelle cellule cromaffini e la riparazione della membrana cellulare a seguito di lesioni.

Questo video si concentrerà sull'uso dei coloranti FM in un esperimento che studia il riciclaggio delle vescicole. Esamineremo un protocollo passo dopo passo che utilizza i coloranti FM per quantificare il processo di riciclaggio nei neuroni stimolati. Infine, esamineremo alcuni esempi di esperimenti, che utilizzano questa molecola unica in modi diversi.

Prima di addentrarci nella procedura, esaminiamo le proprietà biochimiche dei coloranti FM, che ci aiuteranno a capire la loro funzione negli esperimenti di riciclaggio delle vescicole.

Strutturalmente, i coloranti FM sono molecole di stirile che derivano il loro nome dallo scienziato che le ha sintetizzate? Fei Mao. Questi coloranti hanno tre caratteristiche strutturali principali: testa, coda e ponte. Il ponte è costituito da due anelli aromatici con una regione di doppio legame variabile tra di loro. L'intera sezione crea il fluoroforo.

È nella natura di qualsiasi fluoroforo che, quando viene colpito dalla luce in arrivo a una certa lunghezza d'onda di eccitazione, i suoi atomi assorbono quell'energia e sollevano i suoi elettroni a uno stato eccitato. Questi elettroni ritornano allo stato fondamentale emettendo energia vibrazionalmente e infine come luce di una lunghezza d'onda di emissione. La coda idrofoba consente alla molecola FM di dividersi nei doppi strati lipidici della membrana cellulare e la sua testa idrofila ha una carica che limita la sua localizzazione al foglietto esterno della membrana.

Pertanto, l'unico modo in cui può entrare nella cellula è attraverso l'endocitosi. I coloranti FM sono acutamente sensibili all'ambiente e mostrano una debole fluorescenza nei solventi polari, ma una forte fluorescenza in ambienti idrofobici come le membrane. In questo modo si crea una marcatura a membrana ad alto contrasto che può essere visualizzata e quantificata utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Queste proprietà rendono i coloranti FM particolarmente adatti per valutare il riciclaggio delle vescicole nelle sinapsi. In breve, il processo prevede l'incubazione delle colture con colorante FM. Alcune delle molecole FM si attaccano alle membrane, il che aumenta significativamente la loro intensità di fluorescenza. Successivamente, uno stimolo avvia il processo di internalizzazione della membrana. Pertanto, alcune molecole di FM sono intrappolate nella membrana della vescicola e il resto delle molecole di colorante localizzate esterne vengono lavate via.

Alla seconda stimolazione, le vescicole colorate internalizzate si fondono con la membrana cellulare per rilasciare il loro contenuto e il colorante si dedivide rapidamente, determinando una rapida diminuzione dell'intensità della fluorescenza. Questa decolorazione può essere quantificata con l'aiuto di un microscopio a fluorescenza.

Ora che hai familiarità con i principi biochimici dei coloranti FM, esaminiamo una procedura su come eseguire un esperimento esaminando il riciclaggio delle vescicole sinaptiche utilizzando questi coloranti.

Campioni puliti e sani di colture neuronali su vetrini coprioggetti vengono preparati in anticipo. Queste cellule vengono spostate in una soluzione di colorante FM, provocando l'etichettatura delle membrane. Il vetrino coprioggetti del campione viene quindi montato sulla camera di imaging del microscopio.

Per consentire manipolazioni dei fluidi come i lavaggi, le linee di ingresso e uscita del fluido sono collegate per formare una camera di perfusione sigillata. Montare la camera sul tavolino di un microscopio a fluorescenza. Collegare i fili alla camera e collegarli allo stimolatore elettrico. Una volta collegati, i filtri di eccitazione e di emissione vengono impostati in base al colorante FM utilizzato.

Il carico di colorante nelle vescicole tramite endocitosi viene indotto utilizzando una stimolazione elettrica. Dopo la stimolazione, le terminazioni nervose possono riprendersi. Quindi, il colorante extracellulare viene lavato via con tampone; Questo riduce anche al minimo la fluorescenza di fondo. È importante mantenere l'intensità di eccitazione minima perché i coloranti FM sono inclini al fotosbiancamento, che è l'indebolimento dell'intensità della fluorescenza a causa dell'eccitazione prolungata. Dopo la breve incubazione, si ottengono le immagini iniziali. Successivamente, l'esocitosi viene indotta con un secondo segnale elettrico.

Dopo aver misurato la fluorescenza in diversi punti temporali dopo la stimolazione, alla fine, le terminazioni nervose possono essere stimolate in modo esaustivo per scaricare tutto il colorante rilasciabile. La fluorescenza rimanente dopo è considerata come l'intensità della fluorescenza di fondo. Quindi, la fluorescenza intrinseca di ciascuna immagine viene misurata utilizzando il ? Regione di interesse? in un'area non sinaptica dell'immagine. La fluorescenza di fondo e la fluorescenza intrinseca vengono quindi sottratte dall'intensità di fluorescenza di ciascun punto temporale per ottenere un'intensità di fluorescenza normalizzata, che viene quindi tracciata rispetto al tempo. La diminuzione dell'intensità nel tempo rappresenta la decolorazione, che è una misura indiretta del riciclo delle vescicole.

Ora che abbiamo esaminato la metodologia, diamo un'occhiata a come i coloranti FM vengono utilizzati in esperimenti specifici.

Abbiamo discusso il protocollo che utilizza i coloranti FM nei neuroni stimolati. Qui, gli scienziati erano interessati a studiare il riciclaggio spontaneo delle vescicole. Lo hanno fatto utilizzando il protocollo stabilito in combinazione con un sistema di imaging abbastanza sensibile da rilevare piccoli cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. I risultati rappresentano una diminuzione dell'intensità della fluorescenza che è direttamente dovuta al rilascio sinaptico spontaneo.

All'interno del neurone presinaptico, le vescicole sono divise in due pool: un pool di riserva o RP e un pool facilmente rilasciabile o RRP. Qui, gli scienziati hanno usato i coloranti FM per analizzare la frazione di ciascun tipo nella popolazione di vescicole. Attraverso l'applicazione sequenziale di stimoli elettrici di intensità crescente, questi scienziati sono stati in grado di quantificare le percentuali relative di ciascun tipo di pool di vescicole.

Infine, i biologi cellulari utilizzano anche coloranti FM per sezionare i fattori coinvolti nella riparazione esocitaria delle membrane plasmatiche ferite. In questo esperimento, i ricercatori si sono concentrati in particolare sul ruolo della fingomielinasi, un enzima che modifica i lipidi, nel processo di risigillatura della membrana. In primo luogo, hanno generato cellule carenti dell'enzima sfingomielinasi con l'aiuto del trattamento con silenziamento dell'RNA. Successivamente, hanno trattato queste cellule e un gruppo di controllo con colorante FM esogeno e una tossina che crea lesioni della membrana plasmatica. Infine, hanno esaminato tutti i campioni utilizzando un microscopio confocale. I risultati hanno mostrato che le cellule carenti di sfingomielinasi mostravano un robusto accumulo di molecole di FM intracellulare. D'altra parte, le cellule di controllo hanno mostrato un afflusso minimo di FM, suggerendo un ruolo della sfingomielinasi nella riparazione della membrana plasmatica.

Hai appena visto il video di JoVE sui coloranti FM nel riciclaggio delle vescicole. Il video descriveva la biochimica dei coloranti FM, descriveva in dettaglio un protocollo per colorare e quantificare il riciclo delle vescicole sinaptiche e infine delineava gli esperimenti in corso che utilizzano questi coloranti in modi diversi. Come sempre, grazie per la visione!