Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

L'obiettivo generale di questa metodologia di campionamento dell'aria e di estrazione del DNA è quello di ottenere DNA genomico fungino che possa essere amplificato, sequenziato e posizionato tassonomicamente per identificare potenziali rischi fungini all'interno di contesti professionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della valutazione dell'esposizione professionale, ad esempio a quali pericoli fungini sono esposti i lavoratori che possono avere effetti negativi sulla salute. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le specie fungine che rimangono non rilevate utilizzando metodi basati sulla coltura o sulla microscopia possono essere chiarite utilizzando approcci basati sul sequenziamento.

Per assemblare la cassetta del filtro di campionamento dell'aria, posizionare un tampone di supporto del filtro in cellulosa sulla superficie grigliata del pezzo di base, quindi, con l'aiuto di una pinza del filtro, posizionare un filtro sopra il cuscinetto di supporto del filtro con il lato di raccolta rivolto verso l'alto. Dopo il montaggio, sigillare la cassetta del filtro inserendo la calandra di prolunga e premendola saldamente e uniformemente con una pressa manuale o pneumatica. Quindi, montare la cassetta assemblata sopra il campionatore di aerosol NIOSH e spingere verso il basso il più possibile.

Utilizzare un pezzo di nastro adesivo da 19 millimetri per avvolgere l'esterno della cassetta del filtro e del campionatore, tenendo la cassetta del filtro in posizione e fungendo da guarnizione di riserva per evitare perdite. Avvitare saldamente e completamente le provette di raccolta nel campionatore fino a quando non toccano il fondo e avvolgere il nastro sigillante attorno alle provette che funge da tenuta secondaria contro le perdite. Per eseguire il campionamento personale di aerosol, posizionare il campionatore all'interno della zona di respirazione della persona.

Fissare il campionatore al risvolto, alla spalla o al torace, quindi tenere la pompa di campionamento all'altezza della vita o in uno zaino. Accendere le pompe e controllare dopo un minuto se la pompa funziona. Al termine del campionamento dell'aria, raccogliere il campionatore d'aria dal soggetto.

Rimuovere il nastro sigillante, svitare i tubi e quindi mettere un tappo su di essi. Posizionare il terzo pezzo della cassetta del filtro sopra il filtro. Innanzitutto, pulire la cassetta di campionamento con etanolo al 70%, quindi utilizzare uno strumento di apertura della cassetta per aprire la cassetta di campionamento mentre si lavora in una cappa di sicurezza biologica di Classe II.

Quindi, utilizzare un sollevatore del filtro per sollevare il cuscinetto di supporto e il filtro verso l'alto. Quindi, utilizzare una pinza filtrante per rimuovere il filtro e metterlo in una capsula di Petri sterile. Tagliare il filtro in sei pezzi uguali con un bisturi sterile e poi metterli in un tubo rinforzato da due millilitri contenente 300 milligrammi di perle di vetro da 200 a 500 micrometri.

Immergere il tubo contenente il filtro in azoto liquido per 30 secondi, quindi posizionarlo rapidamente in un omogeneizzatore a graniglia a una velocità di 4,5 metri al secondo per 30 secondi. Aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lisi alle provette contenenti i piccoli pezzi rimanenti di filtro intatto, quindi aggiungere 0,3 millilitri di tampone di lisi alle provette di raccolta del campionatore d'aria da 15 e 1,5 millilitri e agitare le provette in posizione verticale e capovolta rispettivamente per 10-15 secondi. Trasferire il tampone di lisi da ciascuna provetta di raccolta in provette rinforzate da due millilitri contenenti 300 milligrammi di perle di vetro.

Lavorare le provette nell'omogeneizzatore per 30 secondi, quindi centrifugare i campioni a 20.000 volte la gravità per un minuto a 22 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare nuovamente il surnatante a 20.000 volte la gravità per un minuto a 22 gradi Celsius. Dopo aver aggiunto 30 microlitri di reagente di lisi, incubare le provette a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi, aggiungere 0,2 millilitri di tampone legante e 100 microgrammi per millilitro di proteinasi K alla provetta, quindi lasciare le provette per l'incubazione in un riscaldatore a blocchi a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Infine, aggiungere 100 microlitri di isopropanolo a ciascun tubo. Quindi, posizionare i tubi filtranti in fibra di vetro con una capacità di 700 microlitri in tubi di raccolta da due millilitri e trasferire le soluzioni di estratto al loro interno.

Dopo il trasferimento, centrifugare le provette di raccolta a 20.000 volte la gravità per 30 secondi a 22 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, inserire la fibra filtrante di vetro in provette di raccolta fresche e gettare la provetta di raccolta. A ciascuna provetta aggiungere 0,5 millilitri di tampone di rimozione dell'inibitore ed eseguire la centrifugazione a 20.000 volte la gravità per 30 secondi a 22 gradi Celsius.

Eliminare la provetta di raccolta dopo la centrifugazione e posizionare le provette filtranti in nuove provette di raccolta. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lavaggio a ciascuna provetta e nuovamente sottoporla a centrifugazione a 20.000 volte la gravità per 30 secondi a 22 gradi Celsius. Eliminare la provetta di raccolta e sostituirla con altre nuove dopo la centrifugazione.

Anche in questo caso, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di lavaggio a ciascuna provetta e centrifugare a 20.000 volte la gravità per 30 secondi a 22 gradi Celsius. Per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio, centrifugare infine le provette di raccolta a 20.000 volte la gravità per un minuto a 22 gradi Celsius e gettare le provette di raccolta e sostituirle con altre nuove. Dopo aver aggiunto 100 microlitri di tampone di eluizione caldo, incubare le provette sul banco da laboratorio a temperatura ambiente per uno o due minuti e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 volte la gravità per 30 secondi a 22 gradi Celsius.

Posizionare le provette filtranti in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e riapplicare gli eluati per un'altra centrifugazione circolare. Utilizzare provette PCR da 0,5 millilitri per impostare reazioni da 50 microlitri in triplicato con cinque microlitri di DNA già estratto per ogni reazione, quindi programmare il termociclatore e avviare il ciclo. Mescolare tutte e tre le reazioni PCR in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere 750 microlitri di tampone legante e mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte. Aggiungere 450 microlitri della miscela totale alle colonne di centrifugazione inserite nelle provette di raccolta e iniziare a centrifugare a 17.900 volte la gravità per 30 secondi, quindi scartare il filtrato e aggiungere i restanti 450 microlitri della miscela per un secondo ciclo di centrifugazione. Anche in questo caso, scartare il filtrato e aggiungere 750 microlitri di tampone di lavaggio alle colonne di centrifuga e centrifugare a 17.900 volte la gravità per 30 secondi a 22 gradi Celsius.

Infine, scartare il filtrato e far girare nuovamente le colonne vuote a 17.900 volte la gravità per un minuto a 22 gradi Celsius. Dopo aver trasferito le colonne di centrifuga in provette sterili per microcentrifuga da 1,5 millilitri, pipettare 45 microlitri di tampone di eluizione e incubare le provette sul banco da laboratorio a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, centrifugare le colonne a 17.900 volte la gravità per un minuto a 22 gradi Celsius.

Immergere un gel di agarosio all'1% in un tampone TAE in una camera di elettroforesi, quindi mescolare due microlitri di tampone di carico cinque volte con otto microlitri di DNA amplificato. Infine, caricare tutti i 10 microlitri del campione sul gel insieme alla scala del DNA. Far funzionare il gel a 75 volt per circa 90 minuti.

Un gel di agarosio rappresentativo dimostra l'amplificazione delle regioni spaziatrici trascritte interne del DNA genomico fungino derivato da campioni di aria professionale. La corsia all'estrema sinistra rappresenta la corsia del marcatore del DNA. Le bande a destra rappresentano le regioni spaziatrici trascritte internamente amplificate da diversi campioni d'aria professionale con dimensioni che vanno da 750 a 1.000 paia di basi.

Un grafico rappresentativo di Krona mostra la presenza di diverse specie fungine tassonomiche in un ambiente interno. Il campionatore a ciclone per bio-aerosol NIOSH è stato utilizzato nelle case per raccogliere bio-aerosol per un'ora per determinare le specie fungine presenti. I dati tabulari rappresentano gli indici di diversità e ricchezza delle specie fungine negli ambienti interni.

I dati mostrano indici di ricchezza di Chao-1 più elevati, indici di diversità di Shannon e coefficienti di dissimilarità di Bray-Curtis in ambienti raffreddati con aria condizionata ed evaporativi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere campioni di aria interna e professionale ed estrarre il DNA genomico per l'analisi delle popolazioni microbiche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare i migliori metodi asettici per prevenire la contaminazione microbiologica dei campioni.