Name: Raccolta e lestrazione di campioni daria professionale per lanalisi del DNA fungoso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Impara a raccogliere campioni d'aria professionale ed estrarre DNA fungino per analisi ITS. Questo metodo sequenziazione identifica specie non rilevabili con tecniche tradizionali, migliorando la valutazione dei rischi sanitari occupazionali.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un accordo tra agenzie tra NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).

1. preparare il campionatore di aerosol NIOSH
Nota: Il campionatore di aerosol NIOSH è un campionatore di aerosol bistadio ciclone che raccoglie bioaerosols utilizzando due tubi di campionamento e di un filtro di politetrafluoroetilene (PTFE).
<ol><li>Prima del montaggio, ispezionare attentamente il campionatore. Controllare il campionatore per assicurarsi che non sia danneggiato, tutte le viti sono in atto e aderente e il nastro di sigillo intorno la giuntura formata dai due metà è intatto. Ispezionare il campionatore o-ring per garantire che non ha alcun Nick, crepe o rotture e che ha un molto leggero strato di grasso al silicone. Nota: Il campionatore include un filtro PTFE 3 µm di 37 mm in polistirolo o cassetto dei filtri tre pezzi in polipropilene.<ol>
<li>Montare la cassetta filtro inserendo una cellulosa o rilievo di supporto filtro in plastica (incluso con i filtri) sulla superficie del pezzo base griglia (Vedi Figura 1). Utilizzare filtro forcipe per appoggiare il filtro sopra il pad supporto filtro con il lato di raccolta rivolta verso l'alto.</li>
		<li>Sigillare le cartucce di filtro utilizzando una pressa manuale o pneumatica. Chiusura a mano consentirà di aria per una perdita intorno al filtro e ridurre l'efficienza di raccolta. Inserire il pezzo a forma di anello (il camino di estensione) e utilizzare la stampa per spingere saldamente e in modo uniforme. Premere verso il basso il camino di estensione sul filtro abbastanza saldamente per garantire aria non ci siano perdite intorno al filtro. Nota: La parte superiore della cassetta non viene utilizzata durante il campionamento ma deve essere salvata per coprire il filtro una volta che il campionamento è completo.</li>
		<li>Montare la cassetta montata sulla parte superiore del campionatore e spingerlo verso il basso, per quanto possibile. Avvolgere un pezzo di nastro di 19 mm (3/4 pollici) intorno alla parte esterna del cassetto dei filtri e sampler per tenere il cassetto dei filtri sul posto e di agire come un sigillo di backup per evitare perdite.</li>
		<li>Avvitare ogni tubo saldamente e completamente il sampler fino a fondo e avvolgere intorno a ciascuna provetta il nastro di sigillamento di agire come una tenuta secondaria contro le perdite. Nota: Il primo tubo, un tubo da 15 mL in polipropilene, raccoglie le particelle non respirabili con un diametro aerodinamico di > 4 µm. Il secondo tubo, un tubo di polipropilene microcentrifuga da 1,5 mL, raccoglie particelle respirabili tra 1 e 4 µm. Le rimanenti particelle più piccole, < 1 µm, sono raccolti su PTFE filtro (Vedi Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrare il flusso d'aria attraverso il campionatore NIOSH con un barattolo di calibrazione prima di ogni utilizzo come differenze nei filtri e campionatori farà sì che il flusso d'aria variare.<ol>
<li>Per utilizzare un vaso di calibrazione, inserire il raccordo Luer del vaso nella parte superiore della cassetta filtro, posizionare il campionatore nel vaso e sigillare il vaso.</li>
		<li>Collegare il vaso di taratura di un misuratore di portata di calibrazione e la pompa di campionamento. Accendere il misuratore di portata e lasciarla riscaldare per pochi minuti. Si noti che il misuratore di portata deve avere sempre un filtro attaccato alla sua presa per evitare di contaminare il flussometro e il campionatore.</li>
		<li>Accendere la pompa di campionamento e farlo girare per qualche minuto riscaldare e stabilizzare.</li>
		<li>Regolare la pompa per impostare la corretta portata a 3,5 L/min. Nota: La portata per il campionatore di aerosol NIOSH è solitamente impostata su 3,5 L/min. Questa portata, il campionatore è conforme ai criteri ACGIH/ISO per particelle respirabili campionamento16. Altri tassi di flusso possono essere utilizzati se dimensioni differenti cut-off sono desiderati o per ridurre il livello di rumore, ma essere consapevoli che se viene utilizzata una portata differente, quindi il campionatore non sarà non più conforme ai criteri di campionamento respirabile.</li>
		<li>Quando la calibrazione è terminata, spegnere la pompa e misuratore di portata.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. campionamento di aerosol statica e personali
<ol><li>Impostare il campionatore di aerosol NIOSH per entrambi campionamento area personale o statico. Nota: Campionamento statico si riferisce a usando il campionatore di aerosol mentre è collegato a un treppiede o un altro dispositivo di tenuta (Vedi Figura 3), come contro personal campionamento quando il campionatore e pompa sono montati sulla persona in fase di studio (Vedi Figura 4).<ol>
<li>Per il campionamento di area statica, mantenere i campionatori più vicino possibile al settore specifico allo studio. Mantenere i campionatori lontano da prese d'aria, camera ingressi e posti che potrebbero essere nel percorso del flusso d'aria. Nota: Le concentrazioni di Aerosol possono variare considerevolmente anche su brevi distanze, soprattutto se l'origine di aerosol è nella camera17.</li>
		<li>Per il campionamento personale, è possibile impostare il campionatore all'interno della zona di respirazione della persona. Allegare il campionatore per il bavero, spalla o del torace e posizionare la pompa di campionamento in vita o in uno zaino. Nota: La zona di respirazione è presupposto comunemente per essere un emisfero di 30cm che circondano il naso di una persona dalla quale viene disegnata la maggior parte dell'aria durante l'inalazione17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assicurarsi che il campionatore della tubazione è ben chiaro delle entrate del campionatore e che nulla è che ostruisce le insenature o interferire con il flusso d'aria nel campionatore. Il campionatore della tubazione non deve essere schiacciato o piegato. Qualsiasi blocco causerà l'arresto della pompa.</li>
	<li>Attivare le pompe. Dopo un minuto o due, verifica se le pompe sono ancora in esecuzione. Nota: Condotta aria di campionamento per periodi di tempo che vanno da un minimo di 10 min per un turno di lavoro completo 8 h, a seconda l'ambiente10,18,19. I risultati presentati nella Figura 6 sono rappresentativi di un periodo di campionamento di 60 min in ambiente interno.</li>
	<li>Al termine del campionamento dell'aria, raccogliere le provette e filtro. Rimuovere il nastro di sigillamento, svitare i tubi e li di cap. Posizionare il terzo pezzo della cassetta filtro sopra il filtro. Conservare i campioni a 4 ° C fino al momento per l'elaborazione.</li>
</ol>3. estrazione del DNA genomico dai campioni d'aria
<ol><li>Estrarre il DNA genomico (gDNA) da ogni fase del campionatore NIOSH BC251. Elaborare l'aria tubi di raccolta di campionamento e filtrare separatamente per consentire la determinazione di aerosol microbici respirabile e non respirabile nel campione. Nota: In alternativa, le tre fasi possono essere combinate ed estratta in caso di inoculo del campione è troppo piccolo.<ol>
<li>In una classe II biologica sicurezza gabinetto o banco pulito laminare, rimuovere asetticamente il filtro. Pulire la cassetta di campionamento utilizzando etanolo al 70% e fare leva la cassetta di campionamento aprire utilizzando uno strumento di apertura cassetto. Utilizzare un sollevatore di filtro per spingere il cuscinetto di supporto e filtro verso l'alto. Afferrare il filtro utilizzando filtro forcipe e metterlo in una capsula di Petri sterile. Il filtro taglia in 6 parti uguali e metterli in una provetta da 2 mL rinforzata contenente microsfere di vetro 300 mg (0,2 - 0,5 mm).</li>
		<li>Collocare la provetta contenente il filtro in azoto liquido per 30 s e metterlo immediatamente in un omogeneizzatore del mulino di tallone fissato a 4,5 m/s per 30 s.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.1.2 una o due volte fino a quando il filtro è tagliuzzato. Piccoli pezzi di filtro intatto possono rimanere. Aggiungere 0,5 mL di tampone di lisi (4 M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, acido etilendiamminotetracetico 200mm (ed), pH 7.4).</li>
		<li>Aggiungere 0,3 mL di tampone di lisi per la 15 mL e 1,5 mL aria campionatore tubi. Vortice del tubo per 10-15 s mentre in posizione verticale e poi un altro 10-15 s invertita. Trasferire il contenuto di ciascuna provetta provette 2 mL rinforzata contenente 300 mg microsfere di vetro. Nota: la maggior parte del materiale raccolto in ciascun tubo campionatore si accumulano nella parte superiore del tubo.</li>
		<li>Elaborare tutte le provette nell'omogeneizzatore del mulino di perlina a 4,5 m/s per 30 s e centrifuga li a 20.000 x g per 1 min a 22 ° C. Trasferire i surnatanti microcentrifuga sterile 1,5 mL e centrifugare le provette a 20.000 x g ancora per 1 min a 22 ° C. Ripetere questo passaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 30 µ l di reagente di lisi (Vedi Tabella materiali) a ciascuna provetta e incubare le provette a 37 ° C per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 0,2 mL di buffer obbligatorio (10 M urea, 6m guanidina-HCl, Tris-HCl 10 mM, 20% Triton X-100, pH 4.4) e proteinasi K (100 µ g/mL) a ciascuna provetta e incubare le provette a 70 ° C per 10 min. aggiungere 100 µ l di isopropanolo in ogni provetta.</li>
	<li>Trasferire le soluzioni Estratto in tubi filtro fibra di vetro (capacità di 700 µ l) collocati in provette di raccolta da 2 mL e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta da 2 mL.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone di rimozione dell'inibitore (5m guanidina-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% etanolo) in ogni provetta e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta da 2 mL.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di tampone di lavaggio (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanolo) in ogni provetta e centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta da 2 mL. Ripetere questo processo.</li>
	<li>Centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per un ulteriore 1 min a 22 ° C per rimuovere qualsiasi residuo di tampone. Scartare i tubi di raccolta e inserire i tubi del filtro in nuove provette di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l tampone di eluizione (≥ 70 ° C) (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) a ciascuna provetta di caldo e li Incubare a temperatura ambiente per 1-2 min. Centrifugare le provette di raccolta a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Trasferire i tubi filtro vuoto a un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL e ri-applicare eluati da passo 3.8. Incubare a temperatura ambiente per 1-2 min. centrifuga a 20.000 x g per 30 s a 22 ° C. Nota: Eluati possono essere utilizzati immediatamente per passaggio 4 o conservato a-20 ° C fino all'uso. Il DNA genomico può essere immagazzinato per fino ad un anno a-20 ° C. Si raccomanda che, se archiviazione a lungo termine è necessario, DNA essere conservati a-80 ° C.</li>
</ol>4. l'amplificazione del DNA ribosomiale fungo
<ol><li>Utilizzare universal primer fungine per amplificare le regioni 1 e 2 dal gDNA Estratto. Nota: Per questo protocollo, il primer coppia di Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') vengono utilizzati per fornire la massima copertura delle regioni ITS4,5. Altri set di primer, come quelli che amplificare regioni ITS1 e ITS2 da solo, può essere utilizzato.<ol>
<li>Impostare le reazioni a catena della polimerasi (PCR) per ciascun campione in triplice copia 50 reazioni di µ l in provette per PCR sterile 0,5 mL o piastre PCR a 96 pozzetti come segue: 5 µ l di Estratto di DNA (dal passaggio 3), 33,3 µ l di acqua di grado PCR, 5 µ l di tampone di x PCR 10 , 1,5 µ l di MgCl2, 1 µ l di 10 mM 2'-deossinucleoside 5'-trifosfati, 0,5 µ l di 20 primer avanti di Fun18Sf µM, 0,5 µ l di 20 primer inverso di ITS4R µM e 0,2 µ l di Taq DNA polimerasi.</li>
		<li>Eseguire reazioni in un termociclatore: denaturazione a 95 ° C per 3 min; 6 cicli di denaturazione (96 ° C, 30 s) ricottura (50 ° C, 45 s) ed estensione dell'iniettore (72 ° C, min 3); 20 cicli di denaturazione (96 ° C, 30 s), ricottura (50 ° C, 45 s) e di estensione dell'iniettore (72 ° C, 1 min); ed estensione dell'iniettore a 72 ° C per 10 min. mantenere le miscele di reazione a 4 ° C fino al passo successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinare che le reazioni di PCR triplicate purificano utilizzando un kit di purificazione di membrana a base di silice. Nota: Questa procedura permette la rimozione di componenti PCR (primer, dNTP, enzimi, sali, ecc.) e altri contaminanti dai preparativi del DNA amplificati.<ol>
<li>Combinare le tre reazioni per ogni campione (150 µ l totale) in provette per microcentrifuga da 1,5 mL sterile. Aggiungere buffer obbligatorio (5m guanidina-HCl, 30% isopropanolo) ad un volume di 5x (750 µ l) e mescolare la soluzione pipettando su e giù per dieci volte.</li>
		<li>Aggiungere 450 µ l della miscela di spin colonne poste in provette per la raccolta e centrifugare le provette a 17.900 x g per 30 s. scartare i filtrati. Aggiungere il restante µ l 450 alle colonne e centrifugare a 17.900 x g per 30 s a 22 ° C. Nota: Le colonne di spin contengono una membrana di silice che permette per l'adsorbimento del DNA alle colonne.</li>
		<li>Scartare i filtrati e aggiungere 750 µ l di tampone di lavaggio (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanolo) per le colonne di spin. Centrifugare le colonne a 17.900 x g per 30 s a 22 ° C. Nota: Questo processo rimuove i contaminanti dalla reazione PCR di cui sopra.</li>
		<li>Scartare il filtrato e centrifugare le colonne vuote a 17.900 x g per 1 min a 22 ° C. Nota: Questo passaggio è quello di rimuovere qualsiasi residuo lavaggio tampone che potrebbe interferire con le applicazioni a valle.</li>
		<li>Trasferire le colonne di spin per microcentrifuga da 1,5 mL sterile. 45 µ l di tampone di eluizione (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) e incubare le provette a temperatura ambiente per 5 min. centrifuga le colonne di spin a 17.900 x g per 1 min a 22 ° C.</li>
		<li>Utilizzare immediatamente il DNA eluito per i passaggi 4 e 5 o conservare a-20 ° C fino a che pronto per l'uso. Nota: Gli ampliconi possono essere memorizzati per fino ad un anno a-20 ° C. Si raccomanda che, se archiviazione a lungo termine è necessario, DNA essere conservati a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Verifica dell'amplificazione di ITS fungina usando l'elettroforesi del gel dell'agarosi
<ol><li>Cast un 1% di agarosio gel contenente bromuro di etidio 1 µ g/mL. Sciogliere agarosio in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) 1x di ebollizione. Una volta che la soluzione è raffreddata a circa 50 ° C, aggiungere il bromuro di etidio e versare in gel il cast.</li>
	<li>Dopo il gel dell'agarosi è solidificato, immergere il gel in 1 x TAE e preparare gli ampliconi da caricare sul gel. 8 µ l di DNA amplificato, aggiungere 2 µ l di 5 x buffer di caricamento. Nota: Questi volumi possono essere regolati a seconda della concentrazione del buffer di caricamento desiderato.</li>
	<li>Caricare i campioni, tutti e 10 µ l, sul gel insieme con un DNA ladder per misure di riferimento. Esegua il gel a 75 V (6 V/cm) per circa 90 min e visualizzate le fasce, tipicamente osservati tra 750 e 1.000 paia di basi, usando ultravioletto luce (Vedi Figura 5).</li>
</ol>6. sequenziamento e analisi delle regioni ITS fungine
<ol><li>Sequenziare il gDNA estratto o regioni ITS fungine amplificate e analizzare le sequenze utilizzando metodi attuali e appropriati.</li>
</ol>

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<li>Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+and+rrn+gene+copy+number+on+PCR+amplification+of+16S+rRNA+genes+from+a+mixture+of+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).</li>
<li>Vesper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Environmental+Relative+Moldiness+index+for+US+homes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Med%22%5BJournal%5D)">Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes.</a> J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).</li>
</ol>

Le risultanze e le conclusioni in questo rapporto sono quelle degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dell'Istituto nazionale per salute e sicurezza sul lavoro, centri per controllo e la prevenzione.

Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente di lavoro utilizzando approcci basati su sequenziamento è migliorata individuazione ed esposizione di pericolosità fungine. Utilizzando questo approccio ha permesso per la rilevazione di molte altre specie fungine che spesso non vengono rilevati utilizzando metodi basati su microscopia di valutazione o di cultura. Qui viene presentato un metodo per campionamento bioaerosols da ambienti professionali e coperto e l'estrazione del DNA genomico dai campioni d'aria p...

Fungine esposizioni in ambienti indoor e sul lavoro possono causare morbidità respiratoria, compresa la sensibilizzazione allergica e asma1. Identificazione dei pericoli fungini è importante per la valutazione del rischio e prevenire l'esposizione del lavoratore. Questi pericoli fungini possono essere un risultato di contaminazione interna, intrusione di aria esterna o disturbi ambientali che provocano il trasporto di materiali fungine in aree dove i lavoratori sono presenti2. Metodi per valutare l'esposizione fungina hanno incluso campionamento cultura vitale, come pure l'identificazione microscopica delle spore fungine. Questi approcci hanno diverse limitazioni e spesso si affacciano molte specie fungine che potrebbero contribuire al generale fungine onere3. Approcci basati sulla cultura è in grado di distinguere solo quegli organismi fungine vitali che possono essere coltivate su terreni di coltura. Identificazione di spore fungine a livello di specie tramite microscopia può essere confuso dalle spore simili morfologie di condivisione. Entrambi i metodi sono altamente dipendenti micologi per analizzare ed identificare le specie fungine, con molti restanti non identificato.
Per migliorare le metodologie esistenti utilizzate nell'identificazione di rischio professionale e valutazioni dell'esposizione, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologie molecolari. Approcci basati sul sequenziamento per la valutazione della diversità microbica all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro hanno rivelato un ampio spettro di specie fungine incontrato rispetto ai metodi quali microscopia e vitale cultura3,4 ,5. Il metodo presentato qui descrive il campionamento dell'aria di ambienti di lavoro e l'estrazione del DNA genomico per l'identificazione di potenziali pericoli fungini. Identificazione del pericolo avviene mediante sequenziamento il distanziatore trascritto interno ribosomal nucleare o ITS, regioni che sono altamente variabili tra funghi e sono stati comunemente utilizzate per differenziare le specie fungine6,7, 8,9. Molte specie si trovano in ambienti di lavoro, come alcune specie appartenenti al phylum Basidiomycota, non sono identificabili nella cultura vitale e sono difficili da differenziare microscopicamente. Questi funghi sono stati osservati in alta abbondanza relativa all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro, valutata dal sequenziamento fungine ITS regioni3,4,10. IL sequenziamento ha fornito una maggiore conoscenza della varietà di funghi all'interno di ambienti interni ed occupazionali rilevata.
Il protocollo descritto qui dettagli i metodi utilizzati per raccogliere, estrarre e amplificare fungine ITS regioni da bioaerosols per l'analisi di sequenza. Questo approccio utilizza il National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) campionatore di aerosol di ciclone bistadio raccogliere le particelle nell'aria. Questo sampler è stato sviluppato per raccogliere bioaerosols e separato respirabile (≤ 4 µm di diametro aerodinamico) e non respirabile (> 4 µm di diametro aerodinamico) particelle, che consente per l'identificazione di organismi fungosi all'interno di ambienti che sono i più probabilità di essere inalato da un lavoratore11. Altri campionatori di aria, tra cui i campionatori di ciclone, sono disponibili sul mercato che hanno la capacità di raccogliere le particelle all'interno della gamma respirabile (< 4 µm) usando filtri12,13. Al contrario, il campionatore di aerosol NIOSH bistadio ciclone separa specie fungine basato sul loro diametro aerodinamico nelle provette monouso, in polipropilene che possono essere elaborati immediatamente per applicazioni a valle14.
I processi di estrazione del DNA genomico e amplificando le regioni ITS fungine sono dettagliati nel presente protocollo. Le metodologie di estrazione presentate sono state sviluppate specificamente per l'estrazione del DNA genomico da funghi e batteri, come molti kit commerciali di destinazione in particolare lieviti15, batteri o cellule di mammifero. I primers utilizzati in questo studio sono selezionati basati sulla loro copertura complessiva del 1 ITS fungine e ITS 2 regioni4,5. Sequenziamento di queste regioni consente il confronto di molte sequenze ITS sopraelevate, compresi quelli quella sequenza della regione 1 ITS, ITS 2 regione o regioni ITS 2 sia il suo 1. La diversità fungosa di campioni di aria raccolti in un'impostazione interna utilizzando che questi metodi sono illustrati, rivelando un sostanza numero di sequenze inseriti nei phyla Ascomycota e Basidiomycota, nonché altre sequenze appartenendo a phyla fungoso meno dominante, come Zygomycota. La grande diversità delle sequenze fungine identificati utilizzando questo approccio sarebbe non essere catturata utilizzando metodologie di identificazione di rischio tradizionali come coltivazione o microscopia. Sequenziamento delle regioni ITS fungine fornisce un metodo avanzato per identificare i pericoli fungini e consentire una migliore comprensione delle esposizioni fungine indoor e sul lavoro.

<table><tbody><tr><td>Campionatore a ciclone per bioaerosol NIOSH BC251</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>Il campionatore NIOSH non è ancora disponibile in commercio. Si prega di contattare William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) per informazioni su come ottenere il campionatore NIOSH</td></tr><tr><td>Fisherbrand Provette sterili per microcentrifuga con tappi a vite</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-373</td><td>Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 mL per il campionamento dell'aria; la filettatura della parte superiore della vite deve corrispondere alla filettatura del campionatore NIOSH</td></tr><tr><td>Provette per centrifuga coniche Falcon da 15 mL</td><td>Provette in polipropilene Corning</td><td>352096</td><td>da 15 mL per il campionamento dell'aria</td></tr><tr><td>Nastro in vinile per camera bianca, facile da rimuovere, larghezza 1/4"</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td> nastro <td>sigillante</td></tr><tr><td>Cassetta filtro, stirene trasparente, 37 mm</td><td>SKC Inc.</td><td>225-3LF</td><td>Cassetta di campionamento in 3 pezzi (senza filtro). Contiene: base a cassetta, cappuccio di prolunga, tappo a cassetta e tappi di ingresso/uscita Filtri</td></tr> a <tr><td>membrana fluoropori idrofobici in PTFE, 3.0 e micro; m, 37 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>Contiene: 37 mm, 3.0 &micro; m Filtri in PTFE e tamponi di supporto</td></tr><tr><td>Pinze filtranti Fisherbrand Pinze</td><td>filtranti</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-50</td></tr><tr><td>Modello 502 Precision PanaPress</td> La pressa pneumatica <td>a cassetta PanaVise</td><td>502</td><td>è costruita con questa pressa ad albero di precisione</td></tr><tr><td>Nastro isolante in vinile Scotch Super 33+</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>Nastro da 19 mm</td></tr><tr><td>Barattolo di calibrazione multiuso, SKC grande</td><td> Inc.</td><td>225-112</td><td>Vaso di calibrazione</td></tr><tr><td>Pompa per campioni universale PCXR4</td><td>SKC Inc.</td><td>224-PCXR4</td><td>pompa di campionamento</td></tr><tr><td>Misuratore di portata massica 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>Misuratore di portata</td> <td>4140</td></tr><tr><td>Kit modello PCR ad alta purezza Roche</td> Kit di 11796828001 <td>diagnostico Roche</td> utilizzato per <td>l'estrazione</td><td>del DNA genomico. Contiene: Tampone di lisi, tampone di legame, proteinasi K, tampone di rimozione degli inibitori, tampone di lavaggio, tampone di eluizione, provette filtranti in fibra di vetro e provette di raccolta da 2 ml</td></tr><tr><td>Fisherbrand Provette con tappo a vite in polipropilene rinforzato da 2 ml Fisherbrand con tappi Fisher</td><td>Scientific</td><td>15340162</td><td>Provette rinforzate da 2 mL per l'omogeneizzazione delle perle</td></tr><tr><td>Perle di vetro, lavate con acido, 212-300 e micro; m</td><td>Perle di vetro Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Bead Mill 24 Omogeneizzatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>Omogeneizzatore di perline</td></tr><tr><td>CelLytic B Reagente per lisi cellulare, 10X</td><td>Reagente di lisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td></tr><tr><td>Platinum Taq polimerasi</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>Contiene: Platino Taq polimerasi, tampone PCR 10X (senza MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Kit utilizzato per purificare gli ampliconi fungini. Contiene: Buffer PB (tampone legante), Buffer PE (tampone di lavaggio), Buffer EB (tampone di eluizione), colorante indicatore di pH (opzionale) e colorante di caricamento GelPilot</td></tr><tr><td>Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo</td><td>Fisher</td><td>B1 o B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td><td>DNA</td></tr></tbody></table> ladder

raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del dna fungoso

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Tradizionali metodi di identificazione fungine esposizioni negli ambienti di lavoro, quali la cultura e gli approcci basati su microscopia, presentano alcune limitazioni che hanno provocato l'esclusione di molte specie. Gli avanzamenti nel campo negli ultimi due decenni hanno condotto i ricercatori di salute professionale a cui rivolgermi approcci molecolari per identificare i pericoli fungini. Questi metodi hanno portato nella rilevazione di molte specie all'interno degli ambienti indoor e sul lavoro che non sono stati rilevati utilizzando metodi tradizionali. Dettagli di questo protocollo un approccio per determinare la diversità fungina all'interno aria campioni attraverso estrazione del DNA genomico, amplificazione, sequenziamento e identificazione tassonomica di fungine interno trascritto regioni distanziale (ITS). I risultati di sequenziamento nella rilevazione di molte specie fungine che sono non rilevato o difficile da identificare a livello di specie mediante coltura o microscopia. Mentre questi metodi non forniscono misure quantitative dell'onere fungine, offrono un nuovo approccio all'identificazione del pericolo e può essere utilizzati per determinare la complessiva ricchezza di specie e la diversità all'interno di un ambiente di lavoro.

La distribuzione delle specie all'interno di un ambiente può essere valutata mediante la determinazione del numero di cloni di ogni OTU identificato nei campioni di aria abbondanza relativa. Nella figura 6 è un grafico di corona che rappresenta la specie tassonomicamente posizionata all'interno di un ambiente interno dopo 60 min di campionamento dell'aria. Si può osservare che l'ambiente contiene una varietà di specie all'interno di due principali phyla fungo...

Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente è un metodo utilizzato in studi di salute sul lavoro per identificare i pericoli per la salute. Questo protocollo descrive estrazione del DNA dai campioni d'aria professionali per l'amplificazione e sequenziamento delle regioni ITS fungine. Questo approccio rileva molte specie fungine che possono essere trascurati dai metodi tradizionali di valutazione.

Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

L'obiettivo generale di questa metodologia di campionamento dell'aria e di estrazione del DNA è quello di ottenere DNA genomico fungino che possa essere amplificato, sequenziato e posizionato tassonomicamente per identificare potenziali rischi fungini all'interno di contesti professionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della valutazione dell'esposizione professionale, ad esempio a quali pericoli fungini sono esposti i lavoratori che possono avere effetti negativi sulla salute. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le specie fungine che rimangono non rilevate utilizzando metodi basati sulla coltura o sulla microscopia possono essere chiarite utilizzando approcci basati sul sequenziamento.Per assemblare la cassetta del filtro di campionamento dell'aria, posizionare un tampone di supporto del filtro in cellulosa sulla superficie grigliata del pezzo di base, quindi, con l'aiuto di una pinza del filtro, posizionare un filtro sopra il cuscinetto di supporto del filtro con il lato di raccolta rivolto verso l'alto. Dopo il montaggio, sigillare la cassetta del filtro inserendo la calandra di prolunga e premendola saldamente e uniformemente con u

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Ambiente

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Impara a raccogliere campioni d'aria professionale ed estrarre DNA fungino per analisi ITS. Questo metodo sequenziazione identifica specie non rilevabili con tecniche tradizionali, migliorando la valutazione dei rischi sanitari occupazionali.

Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

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