Classificazione dello stato di attivazione delle cellule staminali neurali in vitro mediante autofluorescenza
12 aprile 2024
Questo protocollo descrive le strategie per identificare e arricchire lo stato cellulare in colture primarie di cellule staminali neurali di topo adulto mediante imaging in autofluorescenza utilizzando i) un microscopio confocale, ii) un selezionatore cellulare attivato a fluorescenza per eseguire l'imaging dell'intensità o iii) un microscopio multifotone per eseguire l'imaging del tempo di vita in fluorescenza.
Questo protocollo fornisce un nuovo approccio per classificare lo stato di attivazione delle cellule staminali neurali con una coorte di vantaggi tecnici. Utilizzando questo protocollo, possiamo ottenere un'analisi della risoluzione di singole cellule vive e senza marcatura dello stato di attivazione delle cellule staminali neurali. Questo protocollo può essere utilizzato per far luce sui meccanismi che regolano la neurogenesi adulta.
L'autofluorescenza è molto più debole di quella di molti fluorofori con cui i ricercatori sono abituati a lavorare. Sii sicuro nell'uso di potenze laser più elevate per raccogliere i tuoi dati. A dimostrare la procedura sarà Chris Morrow, un ex studente laureato del mio laboratorio.
Iniziare configurando il microscopio confocale per l'imaging in autofluorescenza. Fare clic su 405 Laser e digitare nella finestra di emissione nel menu 405 laser. Procedere con il clic su TD per raccogliere un'immagine a luce trasmessa e impostare il valore HV per visualizzare il campione.
Regolare la potenza del laser al 3,5% e impostare il guadagno su 75. Impostare lo zoom su due. Per i parametri di scansione confocale, impostare la permanenza dei pixel su 0,5 e la risoluzione su 2048 per 2048 pixel.
Utilizzando l'obiettivo a immersione in olio 60X in campo chiaro, mettere a fuoco le cellule. Fare clic su Eye Port per passare alla modalità di scansione confocale. Assicurarsi che il percorso della luce sia diretto verso la testina di scansione e verificare che nessun cubo del filtro ostruisca il percorso della luce.
Fare clic su Scansione, quindi mettere a fuoco l'immagine e fare clic su Acquisisci per acquisire immagini dell'autofluorescenza nelle cellule staminali neurali quiescenti e nelle cellule staminali neurali attive. Assicurarsi di raccogliere immagini su un singolo piano con il citoplasma delle cellule a fuoco per una sezione trasversale rappresentativa di ciascuna cellula. Iniziare l'imaging con basse potenze laser e aumentare gradualmente la potenza fino a quando il segnale di autofluorescenza non è rilevabile senza causare saturazione.
Analizza le cellule staminali neurali quiescenti e le cellule staminali neurali attive con un citometro a flusso utilizzando un ugello da 130 micrometri. Applica le condizioni ottiche secondo le capacità dello strumento e rileva l'autofluorescenza puntata. Raccogliere almeno 10.000 qNSC e aNSC singoletto in un file di dati.
Utilizza questi dati per progettare porte per la raccolta di una popolazione arricchita di qNSC o aNSC. Quindi smistare le cellule singoletto in pozzetti rivestiti di laminina dell'OLP riempiti con terreno aNSC. Dopo il FACS, lasciare che le cellule staminali neurali incubino per tre ore.
Per fissare le cellule, aggiungere il 4% di paraformaldeide, assicurandosi che sia sufficiente coprire il fondo della capsula e incubare. Dopo 15 minuti, permeabilizzare le cellule con Tritone allo 0,25% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trattare le cellule con una soluzione colorante EdU a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi, lavare i campioni tre volte per 10 minuti ciascuno con PBS. Iniziare utilizzando gli oculari per individuare un campo visivo adeguato e regolare il percorso della luce verso il campione sul microscopio per consentire l'imaging al buio con il multifotone. Impostazione per la raccolta dell'immagine del canale uno.
Passare alla scheda del guadagno di potenza e regolare il guadagno sul PMT su 800. Fare clic sulla scheda Laser 2P e selezionare 750 nanometri per la lunghezza d'onda del laser e assicurarsi che venga utilizzato il cubo del filtro corretto. Per raccogliere l'immagine del canale uno, fare clic sulla scheda Guadagno di potenza e impostare i Pockels su 30.
Quindi procedi alla sezione di scansione dello schermo e fai clic su Live Scan per avviare la modalità di anteprima. Aumenta in modo incrementale i Pockels per ottenere un campo visivo adeguato a bassa potenza laser. Una volta identificato un campo visivo adatto, regolare la potenza del laser a 3,6 milliwatt.
Quindi procedere alla sezione di scansione e fare clic su scansione singola per acquisire un'immagine del canale uno in 60 secondi. Per raccogliere un'immagine del canale due, fare clic sulla scheda Laser 2P e selezionare 890 nanometri per il laser. Sostituire il cubo del filtro con il cubo di emissione del canale due.
Avvia la modalità di anteprima. Aumenta i Pockels fino a quando il misuratore di potenza mostra circa sette milliwatt e i conteggi CFD sono compresi tra 10.000 e 100.000. Fare clic su scansione singola e acquisire un'immagine del canale due per una durata di 60 secondi.
L'imaging confocale in autofluorescenza è stato impiegato per differenziare tra cellule staminali neurali quiescenti e cellule staminali neurali attivate. È stato riscontrato che le qNSC mostrano un numero maggiore di PAF rispetto alle aNSC, dimostrando l'uso dell'autofluorescenza come marcatore per l'identificazione dello stato cellulare. Utilizzando il FACS, gli stati cellulari delle NSC sono stati arricchiti in base all'autofluorescenza.
Le cellule selezionate dall'alto cancello di autofluorescenza hanno mostrato un tasso di proliferazione inferiore rispetto al campione misto, mentre quelle dal basso cancello di autofluorescenza erano più proliferative, confermando l'arricchimento degli stati di attivazione delle NSC. Inoltre, FLIM è stato utilizzato per valutare l'autofluorescenza delle NSC e discernere lo stato di attivazione delle NSC. In particolare, le qNSC hanno mostrato un tempo medio di fluorescenza più elevato nel canale uno, ma una percentuale inferiore del componente alfa della fluorescenza rispetto alle aNSC.
Un modello di regressione logistica che incorpora i dati provenienti da entrambi i canali ha prodotto una capacità predittiva quasi perfetta per gli stati di attivazione delle NSC, come indicato da una curva caratteristica dell'operatore ricevente che sottolinea il potenziale di FLIM nella classificazione degli stati NSC. Seguendo questa procedura, sarebbe bene convalidare i risultati utilizzando altri approcci per misurare lo stato di attivazione delle cellule staminali neurali.
Panoramica
Questo protocollo presenta tecniche per l'identificazione e l'arricchimento di stati cellulari in colture primarie di cellule staminali neurali da topi adulti, utilizzando l'immagine di autofluorescenza. Lo studio impiega microscopia confocale, citometria a flusso attivata da fluorescenza (FACS) e microscopia a fotoni multipli per analizzare gli stati di attivazione delle cellule staminali neurali, migliorando la comprensione della neurogenesi adulta.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecnologia dell’immagine
Sfondo
- Le cellule staminali neurali (NSCs) svolgono un ruolo cruciale nella neurogenesi e nella riparazione del cervello.
- Comprendere gli stati di attivazione delle NSC può fornire informazioni sul loro ruolo nella funzione cerebrale.
- I metodi attuali non disponevano di tecniche precise per valutare gli stati delle NSC a risoluzione monocellulare.
- L'imaging dell'autofluorescenza offre un approccio innovativo per analizzare cellule vive senza etichettatura.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'analisi in tempo reale, senza marcatura, degli stati di attivazione delle cellule staminali neurali.
- Arricchire le popolazioni di cellule staminali neurali quiescenti e attivate utilizzando l'autofluorescenza come marcatore.
- Studiare i meccanismi che regolano la neurogenesi adulta attraverso tecniche di imaging migliorate.
Metodi Utilizzati
- L'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale e un microscopio a effetto multiphotonico.
- Colture primarie di cellule staminali neurali di topo adulte sono state utilizzate come modello biologico.
- Nessuna analisi multiomica o metabolica è stata condotta in questo studio.
- Il protocollo prevedeva passaggi per l'allestimento del microscopio confocale, la FACS per la separazione cellulare e l'analisi dell'autofluorescenza.
- I passaggi critici includevano l'ottimizzazione delle impostazioni della potenza del laser e la separazione delle popolazioni cellulari in base all'intensità dell'autofluorescenza.
Risultati principali
- L'imaging dell'autofluorescenza ha differenziato con successo le NSC quiescenti e attivate in base all'intensità del segnale.
- La FACS ha permesso l'arricchimento delle NSC, dimostrando differenze nei tassi di proliferazione tra le popolazioni ordinate.
- L'imaging della vita media della fluorescenza (FLIM) ha rivelato differenze significative nella vita media e nei componenti della fluorescenza tra NSC quiescenti e NSC attivate.
- Un modello di regressione logistica ha indicato una forte capacità predittiva nell'identificare gli stati di attivazione delle NSC.
Conclusioni
- Questo studio permette un'identificazione e un'analisi avanzate degli stati di attivazione delle cellule staminali neurali, fondamentali per comprendere la neurogenesi.
- L'uso dell'autofluorescenza e della FACS offre prospettive promettenti per la ricerca futura sulla plasticità neurale e sulla biologia delle cellule staminali.
- Le conoscenze acquisite potrebbero orientare strategie terapeutiche nelle condizioni neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo fornisce un metodo senza etichette e con risoluzione a singola cellula per classificare gli stati di attivazione delle cellule staminali neurali mediante autofluorescenza, consentendo una riduzione dei rischi meccanicistica nella validazione degli obiettivi per i percorsi legati alla neurogenesi. Distinguendo gli stati quiescenti e attivati senza l'uso di etichette esogene, esso supporta una previsione più affidabile nella fase iniziale della scoperta e riduce l'ambiguità biologica nelle strategie terapeutiche basate sulle cellule staminali. L'approccio migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla ricerca preclinica offrendo uno strumento riutilizzabile e scalabile per valutare la dinamica degli stati cellulari in sistemi rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche classificando gli stati di attivazione delle NSC in base a marcatori di autofluorescenza endogeni.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante analisi senza etichette su cellule vive, preservando la funzionalità cellulare nativa durante la discriminazione degli stati.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio quantificando le differenze nella proliferazione e nel tempo di vita della fluorescenza tra qNSC e aNSC mediante FACS e FLIM.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del Saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi arricchendo le popolazioni di qNSC o aNSC mediante selezione FACS basata sull'intensità della autofluorescenza.
- Riproducibilità: Standardizza la valutazione dello stato di attivazione attraverso misurazioni quantitative dell'intensità della autofluorescenza e del tempo di vita della fluorescenza.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma in diversi studi stabilendo un metodo senza marcatura, compatibile con imaging confocale, FACS e a fotoni multipli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si allinea ai meccanismi di neurogenesi adulta, offrendo un sistema compatibile con biomarcatori traslazionali per lo studio dell’uscita dalla quiescenza delle cellule staminali neurali in modelli preclinici.
- De-risking predittivo: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sul rischio collegando le firme di autofluorescenza a esiti funzionali come la velocità di proliferazione e il reingresso nel ciclo cellulare.
- Continuità traslazionale: Collega la fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo un segnale di lettura uniforme e senza etichette attraverso diverse modalità di imaging e di selezione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi delle ipotesi all'identificazione di composti promettenti, sostenendo lo sviluppo del saggio e l'analisi con output quantitativi e privi di marcatura, che guidano le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi mirati alle cellule staminali.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici consentendo la classificazione in tempo reale degli stati di attivazione delle NSC senza alterare i segnali endogeni.
- Screening: Garantisce prontezza per saggi mediante arricchimento basato su FACS di popolazioni purificate di qNSC o aNSC, utile per applicazioni di screening di composti.
- Analisi: Fornisce letture quantitative, inclusi intensità di autofluorescenza, tempo di vita della fluorescenza e analisi dei componenti, per confrontare gli stati di attivazione in diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo il monitoraggio longitudinale della dinamica di uscita dalla quiescenza mediante FLIM in modelli pertinenti alle malattie.
- Riutilizzo Aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile in diversi progetti grazie alla sua natura senza marcatori e alla compatibilità con le comuni infrastrutture di microscopia e citometria a flusso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle transizioni dello stato delle NSC.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità attraverso metriche di autofluorescenza indipendenti dagli strumenti, applicabili in diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione consentendo la rilevazione precoce di modulatori inefficaci dell'attivazione delle NSC, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio identificando composti che modulano in modo affidabile la transizione da qNSC a aNSC con firme di fluorescenza misurabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale, citometria a flusso e FLIM a fotoni multipli per una corretta rilevazione e interpretazione del segnale.
- Dipende dalla taratura del laser e dalla sensibilità del rivelatore a causa della debole intensità intrinseca della autofluorescenza endogena.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei parametri di acquisizione (potenza del laser, guadagno, lunghezza d'onda) per garantire una classificazione riproducibile dello stato di attivazione.
- Richiede considerazioni adattative nell’applicare il metodo a diverse fonti di cellule staminali neurali o condizioni di coltura che influenzano il fondo di autofluorescenza.
- È limitato dalla necessità di un’attenta ottimizzazione per evitare danni da fototossicità pur raggiungendo un rapporto segnale-rumore sufficiente per la discriminazione degli stati cellulari.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Imaging Autofluorescence in Live qNSCs and aNSCs Using Confocal Microscope
2:13
Autofluorescence Based FACS Enrichment for NSC Activation State in Cultured NSCs
3:36
Using Multiphoton Microscope to Perform Fluorescence Lifetime Imaging on NSCs In Vitro
5:20
Results: Deciphering Neural Stem Cell Activation States Through Advanced Fluorescence Imaging Techniques
6:45
Conclusion
