Name: Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Scopri un metodo riproducibile per valutare la segnalazione Wnt paracrina non canonica in vitro utilizzando cellule C2C12 e O9-1. Questo protocollo consente analisi funzionali e molecolari del pathway Wnt/PCP.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F30HL154324 a O.T. e K08HL121191 e R03HL154301 a S.R.K. Gli autori desiderano riconoscere che lo schema nella Figura 1 di questo manoscritto è stato creato con biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

La via di segnalazione non canonica Wnt/polarità cellulare planare (PCP) è una via di segnalazione cellulare di importanza critica che è stata implicata nei processi di sviluppo multiplo 24,25 e malattia24,26. Durante lo sviluppo embrionale, la segnalazione Wnt non canonica coinvolge una vasta rete di segnali molecolari provenienti da cellule che inviano segnali che alla fine inducono cambiamenti...

La segnalazione Wnt non canonica è una via evolutivamente conservata che regola l'organizzazione dei filamenti cellulari e la migrazione direzionale. Questa via è stata implicata in molteplici processi biologici, tra cui la morfogenesi del tessuto embrionale 1,2,3, l'angiogenesi linfatica e vascolare 4,5,6,7 e la crescita e le metastasi del cancro 8,9,10 . A livello cellulare, la segnalazione Wnt non canonica viene effettuata attraverso interazioni paracrine coordinate tra cellule che inviano e ricevono il segnale. Queste interazioni si verificano frequentemente tra cellule di diversi lignaggi o tipi e coinvolgono una rete molecolare diversificata che comprende fino a 19 ligandi e recettori multipli, co-recettori ed effettori di trasduzione del segnale a valle11. A complicare ulteriormente questo processo di segnalazione, studi precedenti hanno dimostrato che le combinazioni ligando-recettore possono variare in modo dipendente dal contesto e dal tessuto 12,13 e che gli stessi ligandi sorgente che guidano la segnalazione Wnt non canonica nelle cellule riceventi del segnale possono essere prodotti da più tipi di cellule che inviano segnale 14,15 . Data la complessità cellulare e molecolare associata al segnale Wnt non canonico, la capacità di studiare in vivo meccanismi individuali e clinicamente rilevanti è stata limitata.
Sono stati fatti tentativi per studiare la segnalazione Wnt non canonica utilizzando tecniche di coltura cellulare in vitro. Ad esempio, sono stati utilizzati saggi di guarigione delle ferite eseguiti in monostrati cellulari per valutare funzionalmente la migrazione direzionale cellulare 4,16,17,18,19. Le tecniche di immunocolorazione sono state utilizzate per eseguire analisi spaziali dell'espressione proteica di superficie per valutare i cambiamenti non canonici indotti da Wnt nella morfologia cellulare 7,10, nell'architettura e nella polarizzazione asimmetrica18,19,20. Sebbene questi approcci abbiano fornito importanti strumenti per caratterizzare i fenotipi correlati a Wnt nelle cellule che ricevono il segnale, la mancanza di componenti di invio del segnale in questi protocolli limita la loro capacità di modellare accuratamente i meccanismi di segnalazione paracrina osservati in vivo. Di conseguenza, rimane una necessità critica di sviluppare sistemi in vitro che consentano una valutazione robusta e riproducibile delle interazioni di segnalazione paracrina tra le cellule mittenti e riceventi del segnale della via Wnt non canonica, in particolare quelle di diversi tipi cellulari.
A tal fine, l'obiettivo primario di questo studio è stato quello di stabilire un protocollo per modellare le interazioni di segnalazione Wnt paracrine non canoniche in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema di cocoltura senza contatto che ricapitola le componenti di invio e ricezione del segnale di queste interazioni e consente l'uso di approcci molecolari, genetici o farmacologici standard per studiare in modo indipendente specifici meccanismi ligando-recettore nel percorso Wnt non canonico. I meccanismi di segnalazione Wnt mediata da NCC sono stati esaminati nei mioblasti utilizzando linee cellulari murine stabilite. Come prova di principio, questo modello è stato utilizzato per corroborare i risultati di precedenti studi in vivo nei topi che implicano l'asse Wnt5a-ROR2 come una via di segnalazione Wnt non canonica rilevante tra NCC 21 e progenitori dei cardiomioblasti SHF 3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Supporto di montaggio antisbiadimento con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Conservato a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Conservato a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>C2C12 linea cellulare di mioblasti murini</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medio (DMEM), glicemia alta (4,5 g/L), L-glutammina (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Conservato a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Provette coniche per centrifuga Falcon, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Supporto permeabile Falcon per piastra a 24 pozzetti con 0,4 &; M membrana in PET trasparente</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Conservato in aliquote da 50 mL a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina, 0,1%</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Conservato a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Puntali per pipette graduati e sterili, 10 & micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia (LIF), 106 unità/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto antiaderenti per auto, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific HRTCG2455</td><td></td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare con cresta neurale O9-1</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide soluzione in PBS, 4%</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL di penicillina e 10.000 &mu; g/mL di streptomicina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Conservato in aliquote da 10 mL a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Conservato a -20 &deg; C, Tenere al riparo dalla luce</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS), 1x, senza calcio e magnesio, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Conservato a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinante-basico (rhFGF-basic)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Proteina Wnt5a ricombinante umana/di topo</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri quadrata con griglia</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO cellule di alimentazione di fibroblasti murini</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25%</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>Memorizzato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Zeiss Apotome.2</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico Zeiss invertito Axio Vert.A1</td><td>Software per microscopia Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012</td> Software di <td>imaging</td> <td>Carl Zeiss AG</td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione paracrina non canonica wnt signaling in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

La segnalazione Wnt non canonica regola l'organizzazione intracellulare del filamento di actina e la migrazione polarizzata delle cellule progenitrici durante l'embriogenesi. Questo processo richiede interazioni paracrine complesse e coordinate tra le cellule che inviano e ricevono il segnale. Dato che queste interazioni possono verificarsi tra vari tipi di cellule di diversi lignaggi, la valutazione in vivo dei difetti specifici delle cellule può essere difficile. Il presente studio descrive un metodo altamente riproducibile per valutare la segnalazione Wnt paracrina non canonica in vitro. Questo protocollo è stato progettato con la capacità di (1) condurre valutazioni funzionali e molecolari della segnalazione Wnt non canonica tra due tipi di cellule di interesse; (2) analizzare il ruolo delle molecole che inviano il segnale rispetto a quelle che ricevono il segnale nella via di segnalazione Wnt non canonica; e (3) eseguire esperimenti fenotipici di salvataggio con approcci molecolari o farmacologici standard.
Questo protocollo è stato utilizzato per valutare la segnalazione Wnt non canonica mediata dalle cellule della cresta neurale (NCC) nei mioblasti. La presenza di NCC è associata ad un aumento del numero di filopodi citoplasmatici e lamellipodi positivi alla falloidina nei mioblasti e a una migliore migrazione dei mioblasti in un test di guarigione delle ferite. L'asse Wnt5a-ROR2 è stato identificato come una via di segnalazione Wnt cruciale non canonica tra NCC e progenitori del secondo campo cardiaco (SHF). In conclusione, questo è un protocollo altamente trattabile per studiare i meccanismi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro.

Effetti dei NCC sulla capacità migratoria dei mioblasti murini Questo test è stato applicato per la prima volta per valutare l'impatto delle NCC sulla capacità migratoria dei mioblasti. La Figura 1 illustra il modello schematico del test. Per testare questo impatto, sono stati eseguiti saggi di scratch con mioblasti che sono stati coltivati in isolamento (senza inserti NCC) rispetto a quelli cresciuti in presenza di inserti. Come controllo positivo, 500 ng/mL di Wnt5a ric...

Il presente studio delinea un metodo altamente riproducibile e trattabile per studiare gli eventi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro. Questo protocollo è stato applicato per valutare l'impatto della segnalazione paracrina Wnt5a nelle cellule della cresta neurale murina e nei mioblasti.

Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Questo protocollo delinea un metodo altamente riproducibile per valutare funzionalmente e molecolarmente la segnalazione Wnt paracrina non canonica in qualsiasi popolazione cellulare di interesse. Le valutazioni funzionali e molecolari vengono eseguite nella stessa popolazione cellulare e possono essere applicate per studiare qualsiasi componente della via Wnt/PCP. Per iniziare, risospendere la cella C2C12 precedentemente pellettata in 10 millilitri di mezzo C2C12.Per diluire le cellule nel rapporto di 1:20, aggiungere 0,5 millilitri di sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri contenente 9,5 millilitri di terreno C2C12 fresco e mescolare delicatamente con una pipetta sierologica usando una pipetta P1000, aggiungere un millilitro della sospensione cellulare diluita a ciascun pozzetto di un nuovo pozzetto a quattro camere e posizionarlo nell'incubatore. Per placcare gli inserti delle cellule O9-1, risospendere il pellet cellulare O9-1 in 10 millilitri di terreno di coltura O9-1. E simile alla diluizione delle cellule C2C12, diluire le cellule O9-1 nel rapporto di 1:20.Quindi, posizionare un singolo inserto permeabile all'interno di ciascun pozzetto di un nuovo pozzo a quattro camere riempito con un millilitro di terreno di coltura O9-1. Aggiungere 300 microlitri di sospensione di cella O9-1 diluita a ciascun inserto e assicurarsi che l'inserto sia completamente sommerso. Quindi incubare il pozzo a 37 gradi Celsius.Per eseguire il knockdown del siRNA nelle cellule O9-1, diluire il siRNA e il reagente di trasfezione nel mezzo sierico ridotto secondo le raccomandazioni del produttore alle concentrazioni desiderate. Mescolare delicatamente il siRNA diluito e il reagente di trasfezione e incubare la miscela a temperatura ambiente per sette minuti. Dopo 18-24 ore di placcatura cellulare, aggiungere i complessi lipidici siRNA agli inserti cellulari O9-1 e incubare per circa 34-48 ore.Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, rimuovere bene il mezzo dalla camera C2C12 e lavare le cellule una volta con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, iniziare a grattare le celle facendo passare saldamente la punta di una pipetta P10 sterile in un'unica direzione per coprire l'intera lunghezza o larghezza del monostrato cellulare. Una volta che le celle sono graffiate, aggiungere rapidamente un millilitro di PBS.Quindi, accendere il computer e il microscopio. Posizionare la slitta della camera sul palco e ruotare la manopola dell'obiettivo fino all'ingrandimento 5X. Aprire il software di imaging.Fare clic sulla scheda della fotocamera, quindi fare clic sul pulsante Live per visualizzare le celle nella scheda AxioCam IC. Assicurarsi che il filtro luce sia tirato completamente verso l'esterno per consentire alla luce di passare alla fotocamera e allo schermo del computer, spostare o ruotare manualmente la slitta della camera per posizionare l'area della ferita al centro dell'immagine live nella scheda IC di AxioCam. Per scattare immagini, fare clic su Snap per aprire una nuova scheda accanto alla scheda AxioCam IC che contiene l'immagine.Per salvare questa immagine fissa, fare clic sul file, selezionare Salva con nome, selezionare desktop sulla barra a sinistra per salvare il file sul desktop, inserire il nome del file nella casella Nome file e salvare la figura in formato file CZI. Per salvare l'immagine come file tiff, fare clic su file, selezionare Salva con nome, immettere il nome del file nella casella Nome file. Fare clic sul pulsante Salva come tipo e selezionare tiff dal menu a discesa.Riposizionare manualmente il vetrino della camera per scattare altre due o tre immagini in altri punti della ferita nello stesso pozzetto. Dopo l'imaging, rimuovere il PBS da ciascun pozzetto e aggiungere un millilitro di mezzo C2C12. Assemblare il sistema di co-coltura degli inserti del pozzo posizionando manualmente gli inserti contenenti le celle O9-1 in ciascun pozzetto del pozzetto della camera.Spingere delicatamente gli inserti verso il basso nel pozzetto, in modo che il fondo dell'inserto si trovi appena sopra le celle C2C12 sottostanti. Restituire i costrutti dell'inserto del pozzo all'incubatore e consentire alle celle di migrare per un totale di nove a 12 ore. Per determinare il tempo di migrazione ottimale, controllare le cellule sei ore dopo la creazione della ferita, quindi ogni due o tre ore dopo.Termina l'esperimento quando le cellule in condizioni di controllo coprono completamente la ferita. Iniziare la terminazione del test di migrazione e inserire bene la decostruzione del sistema rimuovendo gli inserti della cella O9-1 dopo nove o 12 ore del periodo di migrazione. Aspirare con cautela il mezzo C2C12.Aggiungere 0,5 millilitri di PBS ai pozzetti della camera e prendere le immagini finali delle cellule dopo la migrazione. Aspirare con cura tutto il PBS miscelato con il mezzo e rimuovere le camere di plastica dai pozzetti della camera utilizzando le istruzioni del kit. Lasciando la diapositiva sottostante contenente le celle C2C12.Per l'immunocolorazione, incubare immediatamente il vetrino con aldeide paraforme al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la paraformaldeide e lavare il vetrino con Triton X-100 contenente PBST allo 0,1% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, versare PBST e lavare il vetrino due volte con PBS per 10 minuti ciascuno.Quindi creare un bordo idrofobico con una penna idrofobica attorno al vetrino per evitare che le soluzioni fuoriescano dal vetrino impedendo l'interruzione delle celle di aderenza. Quindi, aggiungere circa 0,5 millilitri di soluzione bloccante BSA all'1% al vetrino all'interno del confine idrofobico e incubare il vetrino per un'ora a temperatura ambiente in una camera di vetrino umidificata. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo falloidina a questo vetrino all'interno del confine idrofobico e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, posizionare il vetrino in un supporto per vetrini protetto dall'esposizione alla luce. Lavare le cellule tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Aggiungere un mezzo di montaggio contenente DAPI, montare i vetrini con vetrini di copertura e acquisire le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza standard.Nel presente studio, l'aggiunta di Wnt5a ricombinante ai pozzi di co-coltura ha accelerato la migrazione dei mioblasti con il recupero completo di alcune aree di nove ore. I mioblasti migratori in tutte e tre le condizioni mostravano una normale morfologia cellulare migratoria, tra cui filopodi e lamellipodi ben formati e sporgenti e polarizzazione asimmetrica delle proiezioni citoscheletriche dell'actina. È stato studiato l'effetto paracrino di Wnt5a derivato da NCC sulla migrazione dei mioblasti.Il trattamento con siRNA nanomolare 50 contro Wnt5a ha ridotto l'espressione genica di Wnt5a del 64% rispetto al controllo negativo. La migrazione delle esplosioni di C2C12 miglia con significativamente ridotta in seguito all'abbattimento di Wnt5a nelle NCC e l'aggiunta di Wnt5a ricombinante esogeno hanno salvato questo deficit migratorio e difetto morfologico in questi mioblasti. Al fine di comprendere meglio i meccanismi cellulari di ricezione del segnale nel modello paracrino, il recettore ROR2 è stato abbattuto e l'espressione genica è stata ridotta del 54%Il knockdown di ROR2 nei mioblasti riduce la loro capacità migratoria nonostante la presenza di NCC.Il ricombinante esogeno Wnt5a non è riuscito a salvare la migrazione dei mioblasti dopo il knockdown di ROR2, suggerendo che la deplezione di ROR2 interrompe la capacità dei mioblasti di ricevere segnali Wnt5a. Le cellule di coltura a densità adeguata graffiano con punta P10 solo una volta assemblate e smontate il sistema di co-coltura con cura senza interrompere la cellula sottostante. Questa tecnica è stata utilizzata come prova di concetto per studiare uno specifico asse di segnalazione molecolare all'interno del complesso percorso Wnt / PCP con rilevanza per la biologia delle cellule della cresta neurale e del secondo campo cardiaco.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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