Editing del genoma CRISPR-Cas9 di embrioni di ratto utilizzando il virus adeno-associato (AAV) e l'elettroporazione di embrioni a 2 cellule

Gli strumenti di editing genomico basati su CRISPR hanno notevolmente facilitato la produzione di modelli rep geneticamente modificati. Il sistema CRISPR è composto da un singolo complesso di RNA guida a una nucleasi Cas9 e può essere programmato per mirare a una sequenza di interesse all'interno del genoma per creare una rottura del DNA a doppio filamento. Attraverso la co-consegna di un modello di riparazione del DNA, questa rottura del DNA può essere ripristinata con precisione insieme all'aggiunta di qualsiasi sequenza di DNA ingegnerizzata desiderata attraverso un processo chiamato Homology Directed Repair.

È attraverso questo processo che siamo in grado di generare modelli di ratto knock-in con inserzioni o sostituzioni di DNA mirate. Utilizzando questo protocollo, presentiamo un approccio modificato che utilizza un virus adeno-associato per fornire un modello di riparazione del DNA agli embrioni di ratto, insieme a una successiva somministrazione di complessi CRISPR Cas9 attraverso l'elettroporazione embrionale a due cellule. I sierotipi AAV 1 o 6 sono confezionati con un modello di riparazione del DNA ingegnerizzato progettato per essere integrato nel genoma del ratto attraverso il processo di riparazione diretta all'omologia mediato da CRISPR.