アンインビトロ皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

Epidermは、Matt Tech Corporation社によって開発された、正常なヒト細胞由来のin vitroで再構築されたヒト表皮モデルです。EC VMで検証されたEpiderm皮膚刺激性試験プロトコルは、化粧品、原料、工業剤など、ヒトの皮膚に接触する製品の従来の動物試験に代わるものです。この試験は、皮膚刺激性試験キットとEpiderm組織がラボに届いた0日目に開始され、その後、一晩のインキュベーションを経てアッセイ培地でプレコンディショニングが行われます。

1日目に、表皮組織の非定型表面を推定刺激化合物に1時間さらし、2日目に洗浄ステップで刺激物を取り除きます。24時間のインキュベーション後、カルチャーインサートを新鮮な培地に置き換え、古い培地を用いて放出されたサイトカインおよびケモキンの分析を行います。その後、組織をMTTとして知られる化合物と反応させ、ミトコンドリア還元酵素によって濃紫色に変換させて、mazozおよびsaltを測定します。

細胞生存率の読み取りを行います。サンプルに濃紫色が見られないことは、生存率の低下を示す指標となります。また、試験化合物の比色分析による読み取り値が陰性対照の50%未満である場合、その試験化合物は刺激性物質として分類されます。

こんにちは。Matt CorporationのHelena Kavaです。本日は、再構成ヒト皮膚モデルepidermを用いたin vitro皮膚刺激性試験の手順について説明します。この手順は、規制要件に応じて、in vivo急激皮膚刺激性試験の完全な代替または部分的な代替として使用することが可能です。

この新しいin vitro手順は、化学物質および化粧品原料の危険性確認および表示に使用できます。それでは、開始しましょう。Epidermは、ヒト表皮角化細胞の培養に由来し、ヒト表皮の三次元的で多層的、かつ高度に分化したモデルを形成しています。

これらの組織は有糸分裂および代謝的に活性であり、構造的および生化学的に生体内の対応組織を密接に模倣しており、ヒト表皮のように再現性が保証されています。Epidermは、組織化された基底層、有棘層、顆粒層、および多層の角質層で構成されています。後者には、生体内で見られるものと同様のパターンに配列された細胞間ラメラ脂質層が含まれています。

これらの組織は無血清培地で培養されます。各組織は個別の細胞培養インサート内で育成されます。96ウェルのハイスループット形式を含む、その他の構成も利用可能です。

組織の作製には約3週間かかります。このプロセスの特定の時点で、組織を気液界面（air liquid interface）まで上昇させ、組織の頂端側（APIC）表面からすべての液体を除去します。これにより、組織は基底外側表面のみから栄養供給を受け、この表面はMatTec社独自の培地と接触したままとなります。標準的なEpidermキットには、直径9 mmの組織がそれぞれ専用の組織培養インサートに入った状態で24個と、この皮膚刺激性試験を実施するのに十分なアッセイ用培地が含まれています。

24個のインサートは、標準的な24ウェルプレートの各ウェルに1組織ずつ、AGAローズゲル（中浸潤）上にしっかりと固定されています。化学物質の試験を開始する前に、3〜4°Cの温度で翌日配送便を用いて輸送します。EPIDERM試験システムを用いて、書面によるプロトコルに従い、アッセイに使用するすべての器具およびツールを準備し、滅菌してください。綿棒などの一部の材料は、滅菌済みパッケージで提供されるか、オートクレーブ処理されている必要があります。

ピンセットなどの器具の滅菌には70%エタノールを用い、洗浄瓶の滅菌にはUV照射またはガンマ線照射を用いる必要があります。本アッセイで使用する重要な2つの溶液は、あらかじめ調製したDPBSと5%SDS溶液です。蒸留水を用いて、24個の表皮組織を含む1キットにつき、pH 7の滅菌DPBSを約2 L使用します。

滅菌DPBSを陰性対照および洗浄液として使用します。5% SDSを調製し、陽性対照として使用してください。皮膚刺激性試験は、EPIDERM EPI 200 SITキットの受領後、直ちに開始します。

キットのすべての構成品の完全性を確認し、懸念がある場合は直ちにMat Tech社に連絡してください。すべて揃っていることを確認したら、次のステップに進みます。試験を開始するには、キットに付属のアッセイ培地を室温に戻してください。ラミナーフローフード内で予熱しないでください。

表皮組織インサート3つにつき1枚の滅菌済み6ウェルプレートを用意し、滅菌条件下で各ウェルにアッセイ培地を0.9 millilitersずつピペッティングします。表皮組織が入った24ウェルプレートを収めているプラスチック袋を、滅菌エアフロー下で開封します。滅菌ガーゼを取り除き、滅菌鉗子を用いて表皮組織を含む各インサートを慎重に取り出します。

滅菌ガーゼまたはフィルターペーパーで軽く押さえるようにして、インサートの外側に付着している残りのarosを除去します。その後、5分以内に組織を空の滅菌24ウェルプレートに配置してください。最後に、インサートを目視で確認します。

組織の欠損や表面の過剰な水分を記録します。欠損のある組織や、液体で完全に覆われた組織は使用しないでください。

最適な組織インサート。表面が乾燥しており、剥離や不均一な箇所、または表面への過剰な液体の付着がない状態でなければなりません。次に、滅菌済みの綿棒を使用して、組織の表面を慎重に乾燥させます。

組織に直接触れないようにしてください。表面を乾燥させた後は、毛細管現象によって表面の水分を十分に除去できます。6枚ごとの最上段に3枚の組織を移してください。

0.9 mLのアッセイ培地をあらかじめ満たしたウェルプレートを用意します。インサートの下に溜まった気泡を取り除いてください。次に、インサートを入れた6ウェルプレートをインキュベーター内で1時間静置します。

37 °Cで前インキュベーションを行います。最初の前インキュベーション期間が終了したら、インサートを6ウェルプレートの上部ウェルから下部ウェルへと移します。プレートを再びインキュベーターに戻し、一晩前インキュベーションを行います。

残りのアッセイ培地を冷蔵庫に入れます。一晩のプレインキュベーション後、試験化学物質を表皮組織インサートに適用できます。化学物質曝露アッセイを開始する前に、必要なすべての器具、溶液、および試験化学物質を室温に戻しておきます。

滅菌フード内で、非滅菌の試薬ボトルはすべて70% ethanolで拭いてからフード内に配置します。陰性対照用の滅菌DPBS、陽性対照、5% SDS、および蒸留水も同様に、室温でフード内に配置してください。また、廃棄物用の大きなバイアルを別途用意しておきます。

化学物質ごとに6ウェルプレートを1枚用意し、上段のウェルのみにアッセイ培地を1ウェルあたり0.9 millilitersずつ分注します。各プレートに組織番号と化学物質名を記載してください。

化学物質への曝露予定時刻の約5分前に、前処理済みの組織が入った6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。その後、組織の表面を目視で評価します。

滅菌綿棒を用いて水分を完全に取り除きます。この際、組織表面を圧迫しないでください。最後に、6ウェルプレートの蓋にテスト物質のコードまたは名称を記載します。1回の試験につき、陰性対照および陽性対照をそれぞれ3連（triplicate）で含め、合計6種類を超える化学物質をテストしないでください。

既知の試験物質を扱う場合は、薬剤の塗布および洗浄の間隔を1分としてください。コード化されたサンプルまたは未知のサンプルについては、化学物質等安全データシート（MSDS）の指示に従ってください。化学物質安全ガイドラインを遵守し、換気キャビネットを使用してください。

手袋を着用し、目と顔を保護してください。試験化学物質への曝露後に洗浄しやすくするため、1分間隔で組織に化学物質を投与します。最後の組織への投与が完了するまで、投与用組織を載せたプレートはラミナーフローフード内に保持してください。本手順全体を通じて、組織および試験化合物の操作にはバルブヘッド付きのパスツールピペットを使用します。液体化学物質を試験するためのバルブ形状のチップは、ブンゼンバーナーの炎を用いて作成できます。

30 µLの液体試験物質を組織の直上に滴下し、直ちにタイマーを開始してカウントアップさせます。組織の表面にナイロンメッシュを配置します。タイマーが1分に達した時点で、2番目の液体化合物を添加します。1つの試験化学物質につき3枚の組織を使用し、各化合物を1分間隔で添加してください。

半固形物を試験する場合、ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、組織の上に直接 30 µL を分注します。必要に応じて、パステールピペットで化学物質を広げ、組織の大きさに合わせます。固体物質を適用する直前に、組織表面を 25 µL の滅菌 DPBS で湿らせて、組織表面と試験化学物質との接触を改善します。次に、微粉砕した試験材料を 25 mg のシャープアプリケーションスプーンに充填します。

固形のテスト化学物質を組織表面に塗布します。必要に応じて、ピペットの先に滅菌済みのバルブを装着し、スプーンの中身を完全にしごき出してください。インサートを軽く振って、固形物が表面に広がるようにします。

また、組織のサイズに合わせて、ピペットの先端にバルブヘッドを装着して使用しても構いません。組織の表面を圧迫しないでください。最後に、最後の組織への投与後、陰性コントロールとしてDPBSを、陽性コントロールとして5% SDSを、それぞれ組織インサートに3連で添加します。その後、すべてのプレートを、加湿された37 °Cのインキュベーターに35 ± 1分間移します。

このインキュベーションの間に、洗浄工程に必要なすべての材料をフード内に準備してください。35分間のインキュベーション後、すべてのプレートをインキュベーターから取り出します。それらを滅菌フード内に置き、初回投与組織の化学物質曝露が完了するまで60分間待機します。

次に、洗浄の手順を開始します。組織を滅菌済みのDPBSで15回すすぎます。残留した試験物質を除去するため、組織表面から1.5 centimeters離れた位置からDPBSを絶えず流し入れて組織インサートを満たし、その後、液を捨てます。

DPBSのストリームが弱すぎると試験物質が除去されないため、注意してください。ナイロンメッシュを用いて4つの組織を5回洗浄する際、1分間の時間間隔を維持し、尖端の鋭いピンセットで慎重にメッシュを取り除いてください。その後、残り10回の洗浄を継続し、15回目の洗浄後に洗浄ボトルを用いてインサートを完全に浸しながら3回すすぎ、150 millilitersのDPBSを用いて振盪し、残存する試験物質を除去します。

最後に、組織を洗浄します。滅菌済みのDPBSを用いて、内側から1回、外側から1回挿入します。インサートを軽く振り、滅菌済みの吸水紙で吸い取ることで、組織から過剰なDPBSを取り除きます。

次に、ブロット処理した組織インサートを、あらかじめアッセイ培地を満たしておいた新しい6ウェルプレートに移します。ここでも、各曝露検体の曝露時間を60分に維持するため、これらすべての工程を1分以内に完了させる必要があることに注意してください。最後の組織を洗浄した後、滅菌綿棒を用いて各組織の表面を慎重に乾燥させます。

表面に化学物質の痕跡がまだ残っている場合は、滅菌済みの綿棒を使用して除去してください。最後に、組織をインキュベーターでさらに24時間培養します。培養開始時間をメソッド記録シートに記入してください。

また、手法の記録シートにすべての異なるアプリケーションを記録してください。Mat Tech Corporationから提供された、フード内でのプレート移動に関する標準作業手順書の付録に従ってください。インサートを、0.9 milliliterの培地があらかじめ充填された6ウェルプレートの下部に移します。

上段の培地を回収し、あらかじめラベルを貼った24ウェルプレートに分注して、-20 °Cで保存します。培養液中に放出されたサイトカインおよび/またはケモキンの解析は、任意の手順です。そのままさらに18 ± 3時間インキュベートした後、MTTアッセイ用に2枚の24ウェルプレートに化学物質名またはコードを記入します。

MTTは毒性があるため、取り扱う際は必ず保護手袋を着用してください。MTT濃縮液を融解し、MTT希釈液で希釈してMTT溶液を調製します。

MTTは光に敏感であるため遮光し、2〜3時間以内に使用してください。MTTは時間とともに分解するため、24ウェルプレートの各ウェルにMTT培地を300 microlitersずつ分注します。次に、6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。

ブロッティングペーパーでインサートの底部を吸い取り、MTTを予め満たした24ウェルプレートに移します。24ウェルプレートをインキュベーターに入れ、3時間インキュベートします。MTT読み取り値にばらつきが出るのを避けるため、MTTインキュベーションの開始時間をMDSに記録し、3時間のインキュベーション時間を厳守してください。MTTインキュベーションが完了したら、有害廃棄物トラップ付きの吸引ポンプを使用して、すべてのウェルからMTT培地を静かに吸引します。

ウェルにDPBSを満たし、吸引します。この洗浄工程をさらに2回繰り返し、最後の吸引後に組織が乾燥していることを確認してください。洗浄後、インサートを新しい24ウェルプレートに移し、各インサートに抽出液2 mLを穏やかにピペッティングして、インサートを浸します。

液面がインサートの上端より高くなり、組織の両側が完全に浸されます。抽出液の漏出と蒸発を防ぐため、ヒートシーラーまたはパラフィルムを使用して24ウェルプレートを密封します。抽出開始時間をメソッド記録シートに記入し、プレートシェーカーで緩やかに振盪しながら、室温で少なくとも2時間抽出します。抽出期間の終了後、注入針またはバルブ付きピペットでインサートを突き刺し、抽出液をインサートを回収したウェル内に流し込みます。

穿孔したインサートを廃棄し、ウェル内の溶液を均質になるまでピペッティングで3回混ぜ合わせます。また、組織ごとに120 RPMに設定したプレートシェーカーを使用することも可能です。ブルーフォルマ溶液を200 µLずつ2回、96ウェル平底マイクロタイタープレートに分注します。

このビデオプロトコルに付属するスプレッドシートに記載されたブランク用の固定プレートデザインに従って、重複サンプルを移送します。ISOプロパノールを用い、96ウェルプレート分光光度計を使用して、リファレンスフィルターを使用せずに波長570 nanometersで吸光度（OD）を読み取ります。結果をスプレッドシートに入力し、結果を自動計算させてください。

付属のプロトコルに記載されている通り、試験化学物質による干渉に起因する補正を行い、試験化学物質を刺激性と判定します。分光光度分析の結果、組織生存率が50%以下であり、NC組織のOD 570が1以上2.5以下である場合。また、陰性対照組織に対するPC組織の平均生存率（パーセント表記）が20%未満であり、かつ同一条件で処理した3つの複製試料の個別の組織生存率から算出されたSDが18%未満である場合。細胞生存率が50%未満の値を示す化合物は、刺激性とみなすことができます。

以上で、再構築ヒト皮膚モデルEpidermを用いた、検証済みの60分および42時間の皮膚刺激性試験の実施方法について解説しました。この手順を行う際は、試験の大部分が無菌または無菌に近い条件下で実施されることを忘れないでください。手法の変更が必要な場合や、手順の各ステップについてより詳細な説明が必要な場合は、お気軽に弊社までお問い合わせいただき、サポートやアドバイスをご活用ください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。