Name: アンインビトロ皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: 学ぶEpiDerm皮膚刺激性試験法。再構築ヒト表皮モデルを用いて化粧品原料や医薬品の安全性を評価するin vitro手法です。MTTアッセイで細胞生存率を測定し、動物実験に代わる信頼性の高い代替法として規制要件にも対応します。

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著者らは、変性表皮SIT（5の多施設国際検証研究に参加するためBfRは（ドイツ）、BASF SE（ドイツ）、IIVS社（米国）、ゼットイン- LSL（オーストリア）でZEBETに感謝したいと思います）。

I.ティッシュコンディショナー - 0日目<ol><li>表皮EPI - 200 - SITのキットを受け取ると、（キットの詳細については、特定の試薬と機器の表を参照）整合性のためにすべてのキットコンポーネントを確認してください。 </li><li> 、3表皮組織、ある滅菌6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mlをあらかじめ入力して準備する。 </li><li>無菌条件下で、表皮の組織を含む24ウェルプレートを含むビニール袋を開いて、滅菌ガーゼを取り除く。 </li><li>表皮の組織を含む各インサートを削除し、空の24ウェルプレートのインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。このステップの間、滅菌濾紙上にブロッティング穏やかでインサートの外側に付着している残りの出荷アガロースを削除します。 </li><li>次の5分以内に、視覚的に組織を検査する。完全に液体で覆われている欠陥のある組織や組織を使用しないでください。 </li><li>滅菌綿棒の綿棒を使用して、慎重に組織の表面を乾燥させる。直接組織に触れないようにしてみてください - 毛細管効果は、組織表面から水分を除去するのに十分です。 </li><li>組織表面を乾燥した後、6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mLであらかじめ入力の一番上の行に3つの組織を移す。インサートの下に閉じ込められた気泡を離します。 </li><li> 60用インキュベータへの挿入を含む6ウェルプレートを置き± 37℃で5分間プレインキュベーション± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH（相対湿度）。 </li><li> 60 ± 5分間プレインキュベーション期間の終了時に、6ウェルプレートの下側​​のウェルに上限井戸から挿入して転送する。バック一晩プレインキュベーション（18 ± 3時間）のためのインキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）にプレートを置きます。 </li><li>冷蔵庫（5 ± 3℃）にアッセイ培地の残りを置きます。プレインキュベーション一晩続いて、被験物質は、表皮の組織に適用することができます。 注：プレインキュベーションの手順は、後半に組織の配信の場合（組織が ​​水曜日の代わりに火曜日に到着する場合など）に短縮することができます。 </li></ol> II。化学物質の曝露 - 1日目<ol><li>わずか0.9 mlあたりウェルのアッセイ培地で上段を充填することにより被験物質ごとに、6ウェルプレートを準備します。 </li><li>約5分の化学物質への計画的な露出の前に、インキュベーターからプリエアコン組織を含む6ウェルプレートを取り外します。 </li><li>組織の面を評価し、滅菌綿のヒントを使用して水分を取り除く。 </li><li>試験物質のコードや名前を持つすべての6ウェルプレートの蓋にラベルを付けます。 </li><li>投与量1分間隔で被験物質を有する組織は、曝露後の被験物質の洗浄容易にする。最後の組織が投与されるまで、無菌フード内投与された組織でプレートを保管してください。 </li><li>液体化学薬品をテストするには、直接組織の上に溶液30μLを分注し、組織の表面にナイロンメッシュを配置。必要に応じて、そっとガラスパスツールピペットを率いる電球を使用してメッシュを配置します。組織表面に押さないでください。 </li><li>半固体をテストするため、直接組織の上に30μLを分注するために容積式ピペットを使用してください。パスツールピペットを持つ化学物質は、可能な限り組織の表面をカバーするために必要なスプレッド場合。 </li><li>固体材料の場合は、すぐに被験物質の適用前に、滅菌DPBSの25μLを組織表面を湿ら。これは、被験物質による組織表面の接触が改善されます。細かく粉砕された試料の約25 mgの25 mgのキャリブレーション鋭いアプリケーションのスプーン（または他の適切なツールを）埋める。組織表面に固体の被験物質を適用します。必要に応じて、完全にスプーンを空にするパスツールピペットを率いる電球を使用してください。ゆっくりと表面に固体の拡散を改善するために挿入を振る。 </li><li>ろう状の粘度を持つ被験物質の場合は、直径で約8mm作品フラット"のようなクッキー"を形成し、以前に滅菌DPBSで濡らしていた組織、頂上に配置してみてください。被験物質と組織との間の接触を改善するために、ステンレス製またはプラスチック製の助けを借りて、"クッキー"を下に重量を量る。 </li><li>陰性コントロールとコントロールの組織に陽性対照として5％SDSなどのDPBSを適用します。 </li><li>最後のティッシュを投与した後、加湿インキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）。ために35のすべてのプレート± 1分を転送</li><li> 35後の± 37℃で1分間のインキュベーション℃のインキュベータからのすべてのプレートを取り外す。無菌フードにプレートを置き、60分の化学物質暴露の期間が最初に投与された組織のために完了するまで待ちます。 </li><li>その後（insurする分の時間間隔ごとにインサートを使用して洗浄操作を開始すべての挿入のための総露光時間が60分であることを電子）。 </li><li>滅菌DPBSで組織を洗浄する洗浄瓶を使用してください。 DPBSの定数ストリームを使用して15回インサート組織を記入し、（注、それを空にする：。ナイロンメッシュを有する組織のために、組織の表面を5回洗浄し、先の尖った、鋭いピンセットで慎重にメッシュを削除するには、その後、残りを続行10回洗浄）。 </li><li> 15日以降に150mlのDPBSで完全に水没挿入3回、洗浄瓶を用いて洗い、試験材料の残りの部分を削除するには振る。 </li><li>最後に、滅菌DPBSで一回内側からと一度外から組織のインサートをすすぐ。 </li><li>優しくインサートを振って、滅菌吸い取り紙の上にブロッティングにより組織からDPBSの余分を削除します。 </li><li>以前にアッセイ培地であらかじめ入力された新しい6ウェルプレートにブロット組織のインサートを移す。これらの手順はすべて、（14-18）、挿入のたびに1分以内に行う必要があります。 </li><li>最後の組織をリンスした後に、慎重に滅菌綿棒をチップソーで各組織の表面を乾燥させる。 </li><li>次の24 ± 2時間（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）のためにインキュベーターで組織をインキュベートする。 注：各アッセイの技術者は、下記のようにプロトコルに従うことができるように、単一のテストラン（セット）での陰性および陽性対照を含めて7つ以上の試験物質をテストしてはいけません </li></ol> III。培地の交換 - 2日目<ol><li> 24 ± 2時間後のインキュベーションの後、6ウェルプレート、メディア0.9 mlを事前に満たされたの下部に挿入して転送する。上段からのメディアは、追加のエンドポイント（サイトカイン、ケモカインなど）の分析用に収集することができます。二次エンドポイントの解析は任意です。 </li><li>ポストインキュベーションを続行します（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）さらに18 ± 3時間。 </li></ol> IV。 MTT生存率アッセイ - 3日目<ol><li>ラベル化学物質名またはコードを持つ2つの24ウェルプレート。一つのプレートには、MTTと抽出工程のための他に組織のインキュベーションのために配信されます。 </li><li> MTT濃縮物（5 mg / mL）を解凍し、MTTの希釈剤で希釈してMTT溶液を調製します。 MTT溶液の最終濃度は1 mg / mlである。 </li><li>ピペット24ウェルプレートの各ウェルにMTT溶液を300μL。 </li><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外す、吸い取り紙でインサートの底面を覆い隠す、そしてMTT付きプレフィルド24ウェルプレートにそれらを転送する。 </li><li>インキュベーター内で24ウェルプレートを配置する（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）と3時間インキュベート± 5分。厳密に3時間を厳守±異なるMTTの測定値との偏差を避けるために5分のインキュベーション時間を。 </li><li> MTTのインキュベーションが完了すると、静かに全ウェルのMTT培地を吸引する吸引ポンプを使用してください。 </li><li>リフィルは、DPBSで井戸と再び吸引。この洗浄をさらに2回繰り返し、組織の最後の吸引後乾燥していることを確認してください。 </li><li>洗浄後、新しい24ウェルプレートにインサートを移す。軽く各インサートに2 mLの抽出液（イソプロパノール）をピペッティングすることによって、挿入を浸し。レベルは、このように完全に組織を水没、インサートの上端よりも高くなります。 </li><li>抽出剤の蒸発を抑制するために24ウェルプレートを（パラフィルムやシール袋を使用する場合の例）封印。プレートシェーカー（約120回転）で静かに撹拌しながら室温で少なくとも2時間のために組織からMTTを抽出する。振盪せずに一晩抽出を使用することもできます。 </li><li>抽出期間が完了したら、ピアス注射針や電球パスツールピペットをビーズと抽出液が、挿入が取得されたウェルに実行できるようにすると挿入。 </li><li>パンクしたインサートを破棄し、それが均一になるまで上下に三回ものソリューションをピペット。 </li><li>それぞれの組織の場合は、96ウェル平底マイクロタイタープレートに紫色のホルマザンのソリューションの2つの200μLのアリコートを移す。このビデオプロトコルに付随するスプレッドシートで指定された固定プレートのデザインに応じて複製を転送する。ブランクの場合は、イソプロパノールを使用してください。 </li><li>基準フィルタなしで570 nmの（540〜580）の波長を用いて96ウェルプレート分光光度計でMTTの抽出物の光学密度（OD）をお読みください。 </li><li>結果の自動計算（図1）のためのスプレッドシートに結果を入力してください。 </li><li> MTTアッセイによって決定されたパーセントの組織の生存率は陰性対照に対する相対的な&lt;50％の場合、試験物質は"刺激"（R38またはGHSカテゴリ2）ラベルが付いています。 注：MTTは有毒なので、取り扱う際には必ず手袋を着用してください。 MTTとそのように保護する軽いから、MTTからlutionsは敏感な光です。それは時間の経過とともに低下するので、調製後数時間以内にMTT溶液を使用してください。 </li></ol> V.アッセイの品質コントロール<ul><li>表皮EPI - 200 - SITキット承認基準： 体外 RHEモデルではなく、検証のプロセス（8）中、時間をかけて一貫性のある、高品質なデータを提供する必要があります。長期的なアッセイの再現性とパフォーマンスを確保するために推奨されるガイドラインは、"パフォーマンスのための各ロットのサンプリングを細胞または組織の完全な特性、...、及びアッセイのパフォーマンスの一貫性の保証を提供するコントロールとベンチマーク化学物質の定期的な使用"（9）が含まれ。以下に概説するアッセイの受け入れ基準に加えて、表皮の各製造ロットは、追加のベンチマークの化学物質（1％トリトンX - 100）に対して製造業者によってテストされた品質管理です。トリトンX - 100の50％（ET - 50）に組織の実行可能性を減らすために必要な露光時間が決定されます。表皮の場合は、年平均ET - 50値は5.9時間から7.5時間であったしている。ネガティブコントロール組織のための多くのCV（ベースラインの生存率の変動性をすなわち）の多くは、1996年から毎年7.5％の下に平均しています。順番に各製造ロットのET50値は、（上限許容限界= 8.7h;下限許容限界= 4.8h、すなわちET - 50 = 6.7時間）、1996年に設立された歴史的な平均的なトリトンX - 100 ET50の2標準偏差内に収まっている必要がありますメーカーによる使用のためにリリースされる。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準1：ネガティブコントロール： MTT試験でネガティブコントロール（NC）組織の絶対的なODは（滅菌DPBSで処理）の手順を出荷し、保管した後や特定の使用条件下での試験所で得られた組織の生存能力の指標です。 NC組織の平均OD 570は ≥1.0と≤2.5の場合アッセイは、受け入れ基準を満たしています。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準2：ポジティブコントロール 5％SDS（H 2 O中）ソリューションは、ポジティブコントロール（PC）として使用し、被験物質と同時にテストされています。 PCは、それぞれのアッセイで試験することではなく、複数のPCが一日のテストごとに必要とされていることを同時手段。陽性対照の生存率は、過去のデータの95％信頼区間内にある必要があります。ネガティブコントロール組織の％として表されるPCの組織の平均生存率が20％の場合、アッセイは、受け入れ基準を満たしています。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準3：標準偏差（SD） 皮膚刺激性は、3つの組織で決定されるため、組織の変動が許容可能な低いはず複製、平均生存率から予測される。同じ3個％の組織の生存率から算出したSDが複製処理された場合アッセイは、受け入れ基準を満たしている&lt;18％である。 </li></ul>代表的な結果<div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="図1"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="図2"> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="図3"> </div> 図1 6のテスト記事、NCとPC制御のために得られた結果- 結果の計算のための自動化されたスプレッドシートの一部。 NCを基準にして50％未満の組織の生存率を減少被験物質は刺激性として分類されます。テストは、このように検定の頑健性を高める分類カットオフ（50％生存率）から十分に離れている結果を提供するために最適化されています。 <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> 材料 </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="材料リスト">

<ol><li>Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. ngrid, Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li>
<li>Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li>
<li>Kandárová, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Skin+Irritation+Test%3A+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation%3A+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li>
<li>Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances. Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Schäfer, M. R., Schäfer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kandárová, H. 15th Congress on Alternatives to Animal Experimentation, 2008 September 19-21, Linz Austria, , (2008).</li>
<li>United Nations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labeling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS)</a>. , Second revised edition, UN. New York and Geneva. (2007).</li>
<li>ESAC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Statement+on+the+Scientific+Validity+of+In-Vitro+Tests+for+Skin+Irritation+Testing%22">Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing</a>. , ESAC. (2008).</li>
<li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Issues+and+answers%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li>
<li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods%3A+Current+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li>
</ol>

著者は、本記事で使用されている試薬およびツールを製造するMatTek社の従業員です。

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発し、化粧品及び医薬品成分を含む化学物質のin vitroでの皮膚刺激性試験のための検証を実証した。プロトコルからの逸脱が異なる結果を引き起こす場合があるので、このメソッドを実行するとき、それは、無菌条件下で動作するようにし、厳密に検証プロトコルに従うことが重要です。アッセイのいくつかの変形が可能である、しかし、プロトコルへの変更は、著者と直接相談する必要があります。 この方法の唯一の制限は、MTTのエンドポイントとの被験物質の干渉の可能性があります。直接MTTを減少させる色の被験物質または1つの（そしてそれによって細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を模倣するには）MTTエンドポイントを妨げる可能性があります。しかし、これらの被験物質は、まだ（またはで）で組織を提示している唯一のMTT試験（すなわち42時間被験物質の暴露後の）被験物質の十分な量の時の場合の問題です。この万一の場合には、着色された試験物質や試験材料による（false）を直接MTTの還元により（本当の）代謝MTTの還元と貢献はで提供されるアッセイの標準操作手順で詳しく説明されている手順によって定量化することができるマテック株式会社

アンインビトロ</em表皮を使用して>皮膚刺激性試験（sit）は、ヒト上皮（rhe）モデルを再構築

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発した<sup&gt;（1,2,3）</sup&gt;と検証<sup&gt;（4,5）</sup&gt;のための<em&gt; in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の&gt;皮膚刺激性試験、。表皮のSITは、3Dを利用<em&gt; in vitroで</em&gt;再構築されたヒト上皮（RHE）モデルの表皮。このプロトコルで説明する手順では、GHSのカテゴリー2及び非刺激性物質の刺激性物質の区別を可能に<sup&gt;（6）</sup&gt;。試験はプレインキュベーション、60分露出、42時間のポストインキュベーションとMTT生存率アッセイから成る、4日間の期間の経過とともに行われます。組織の領収書と一晩プレインキュベーション（0日）した後、組織を局所的に液体、半固体、固体またはワックスすることができるテストの化学薬品（1日目）、にさらされている。三つの組織は、各被験物質のためだけでなく、ポジティブコントロール（5％水溶液。SDS溶液）、及びネガティブコントロール（DPBS）に使用されます。化学物質の曝露は、組織を37℃インキュベーター内に保持され、そのうち35分℃、60分間持続する被験物質は、広範な洗浄の手順で組織表面から削除されます。組織のインサートは、ブロットし、新鮮な培地に転送されます。 24時間の潜伏期間（2日目）後、培地を交換されます。培地は、サイトカインや関心のある他のエンドポイントのさらなる分析のために保存することができます。培地交換した後、組織を、さらに18時間インキュベートする。全体42hのポストインキュベーション（3日目）の終わりには、組織は、黄色のMTT溶液中に転送され、3時間インキュベートした。ミトコンドリア代謝を中心に形成された結果の青紫色のホルマザンの塩は、、イソプロパノールを使用して2時間抽出されます。抽出されたホルマザンの吸光度を分光光度計を用いて決定されます。化学物質は、陰性対照処置組織への相対的な組織の生存率が50％以下に下がっている場合刺激性として分類される。この手順は、EUの規制に沿って化学物質の危険有害性の特定とラベリングのためのin vivoでのウサギの皮膚刺激性試験での完全な代替として使用することができます<sup&gt;（7）</sup&gt;。

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）のために開発および検証を実証する<em&gt; in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の&gt;皮膚刺激性試験、。

アンインビトロ</em表皮を使用して>皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

EpiDerm皮膚刺激性試験（EpiDerm SIT）は、...を含む化学物質のin vitro皮膚刺激性試験のために開発（1,2,3）およびバリデーション（4,5）が行われました。

Epidermは、Matt Tech Corporation社によって開発された、正常なヒト細胞由来のin vitroで再構築されたヒト表皮モデルです。EC VMで検証されたEpiderm皮膚刺激性試験プロトコルは、化粧品、原料、工業剤など、ヒトの皮膚に接触する製品の従来の動物試験に代わるものです。この試験は、皮膚刺激性試験キットとEpiderm組織がラボに届いた0日目に開始され、その後、一晩のインキュベーションを経てアッセイ培地でプレコンディショニングが行われます。1日目に、表皮組織の非定型表面を推定刺激化合物に1時間さらし、2日目に洗浄ステップで刺激物を取り除きます。24時間のインキュベーション後、カルチャーインサートを新鮮な培地に置き換え、古い培地を用いて放出されたサイトカインおよびケモキンの分析を行います。その後、組織をMTTとして知られる化合物と反応させ、ミトコンドリア還元酵素によって濃紫色に変換させて、mazozおよびsaltを測定します。細胞生存率の読み取りを行います。サンプルに濃紫色が見られないことは、生存率の低下を示す指標となります。また、試験化合物の比色分析による読み取り値が陰性対照の50%未満である場合、その試験化合物は刺激性物質として分類されます。こんにちは。Matt CorporationのHelena Kavaです。本日は、再構成ヒト皮膚モデルepidermを用いたin vitro皮膚刺激性試験の手順について説明します。この手順は、規制要件に応じて、in vivo急激皮膚刺激性試験の完全な代替または部分的な代替として使用することが可能です。この新しいin vitro手順は、化学物質および化粧品原料の危険性確認および表示に使用できます。それでは、開始しましょう。Epidermは、ヒト表皮角化細胞の培養に由来し、ヒト表皮の三次元的で多層的、かつ高度に分化したモデルを形成しています。これらの組織は有糸分裂および代謝的に活性であり、構造的および生化学的に生体内の対応組織を密接に模倣しており、ヒト表皮のように再現性が保証されています。Epidermは、組織化された基底層、有棘層、顆粒層、および多層の角質層で構成されています。後者には、生体内で見られるものと同様のパターンに配列された細胞間ラメラ脂質層が含まれています。これらの組織は無血清培地で培養されます。各組織は個別の細胞培養インサート内で育成されます。96ウェルのハイスループット形式を含む、その他の構成も利用可能です。組織の作製には約3週間かかります。このプロセスの特定の時点で、組織を気液界面（air liquid interface）まで上昇させ、組織の頂端側（APIC）表面からすべての液体を除去します。これにより、組織は基底外側表面のみから栄養供給を受け、この表面はMatTec社独自の培地と接触したままとなります。標準的なEpidermキットには、直径9 mmの組織がそれぞれ専用の組織培養インサートに入った状態で24個と、この皮膚刺激性試験を実施するのに十分なアッセイ用培地が含まれています。24個のインサートは、標準的な24ウェルプレートの各ウェルに1組織ずつ、AGAローズゲル（中浸潤）上にしっかりと固定されています。化学物質の試験を開始する前に、3〜4°Cの温度で翌日配送便を用いて輸送します。EPIDERM試験システムを用いて、書面によるプロトコルに従い、アッセイに使用するすべての器具およびツールを準備し、滅菌してください。綿棒などの一部の材料は、滅菌済みパッケージで提供されるか、オートクレーブ処理されている必要があります。ピンセットなどの器具の滅菌には70%エタノールを用い、洗浄瓶の滅菌にはUV照射またはガンマ線照射を用いる必要があります。本アッセイで使用する重要な2つの溶液は、あらかじめ調製したDPBSと5%SDS溶液です。蒸留水を用いて、24個の表皮組織を含む1キットにつき、pH 7の滅菌DPBSを約2 L使用します。滅菌DPBSを陰性対照および洗浄液として使用します。5% SDSを調製し、陽性対照として使用してください。皮膚刺激性試験は、EPIDERM EPI 200 SITキットの受領後、直ちに開始します。キットのすべての構成品の完全性を確認し、懸念がある場合は直ちにMat Tech社に連絡してください。すべて揃っていることを確認したら、次のステップに進みます。試験を開始するには、キットに付属のアッセイ培地を室温に戻してください。ラミナーフローフード内で予熱しないでください。表皮組織インサート3つにつき1枚の滅菌済み6ウェルプレートを用意し、滅菌条件下で各ウェルにアッセイ培地を0.9 millilitersずつピペッティングします。表皮組織が入った24ウェルプレートを収めているプラスチック袋を、滅菌エアフロー下で開封します。滅菌ガーゼを取り除き、滅菌鉗子を用いて表皮組織を含む各インサートを慎重に取り出します。滅菌ガーゼまたはフィルターペーパーで軽く押さえるようにして、インサートの外側に付着している残りのarosを除去します。その後、5分以内に組織を空の滅菌24ウェルプレートに配置してください。最後に、インサートを目視で確認します。組織の欠損や表面の過剰な水分を記録します。欠損のある組織や、液体で完全に覆われた組織は使用しないでください。最適な組織インサート。表面が乾燥しており、剥離や不均一な箇所、または表面への過剰な液体の付着がない状態でなければなりません。次に、滅菌済みの綿棒を使用して、組織の表面を慎重に乾燥させます。組織に直接触れないようにしてください。表面を乾燥させた後は、毛細管現象によって表面の水分を十分に除去できます。6枚ごとの最上段に3枚の組織を移してください。0.9 mLのアッセイ培地をあらかじめ満たしたウェルプレートを用意します。インサートの下に溜まった気泡を取り除いてください。次に、インサートを入れた6ウェルプレートをインキュベーター内で1時間静置します。37 °Cで前インキュベーションを行います。最初の前インキュベーション期間が終了したら、インサートを6ウェルプレートの上部ウェルから下部ウェルへと移します。プレートを再びインキュベーターに戻し、一晩前インキュベーションを行います。残りのアッセイ培地を冷蔵庫に入れます。一晩のプレインキュベーション後、試験化学物質を表皮組織インサートに適用できます。化学物質曝露アッセイを開始する前に、必要なすべての器具、溶液、および試験化学物質を室温に戻しておきます。滅菌フード内で、非滅菌の試薬ボトルはすべて70% ethanolで拭いてからフード内に配置します。陰性対照用の滅菌DPBS、陽性対照、5% SDS、および蒸留水も同様に、室温でフード内に配置してください。また、廃棄物用の大きなバイアルを別途用意しておきます。化学物質ごとに6ウェルプレートを1枚用意し、上段のウェルのみにアッセイ培地を1ウェルあたり0.9 millilitersずつ分注します。各プレートに組織番号と化学物質名を記載してください。化学物質への曝露予定時刻の約5分前に、前処理済みの組織が入った6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。その後、組織の表面を目視で評価します。滅菌綿棒を用いて水分を完全に取り除きます。この際、組織表面を圧迫しないでください。最後に、6ウェルプレートの蓋にテスト物質のコードまたは名称を記載します。1回の試験につき、陰性対照および陽性対照をそれぞれ3連（triplicate）で含め、合計6種類を超える化学物質をテストしないでください。既知の試験物質を扱う場合は、薬剤の塗布および洗浄の間隔を1分としてください。コード化されたサンプルまたは未知のサンプルについては、化学物質等安全データシート（MSDS）の指示に従ってください。化学物質安全ガイドラインを遵守し、換気キャビネットを使用してください。手袋を着用し、目と顔を保護してください。試験化学物質への曝露後に洗浄しやすくするため、1分間隔で組織に化学物質を投与します。最後の組織への投与が完了するまで、投与用組織を載せたプレートはラミナーフローフード内に保持してください。本手順全体を通じて、組織および試験化合物の操作にはバルブヘッド付きのパスツールピペットを使用します。液体化学物質を試験するためのバルブ形状のチップは、ブンゼンバーナーの炎を用いて作成できます。30 µLの液体試験物質を組織の直上に滴下し、直ちにタイマーを開始してカウントアップさせます。組織の表面にナイロンメッシュを配置します。タイマーが1分に達した時点で、2番目の液体化合物を添加します。1つの試験化学物質につき3枚の組織を使用し、各化合物を1分間隔で添加してください。半固形物を試験する場合、ポジティブディスプレイスメントピペットを使用して、組織の上に直接 30 µL を分注します。必要に応じて、パステールピペットで化学物質を広げ、組織の大きさに合わせます。固体物質を適用する直前に、組織表面を 25 µL の滅菌 DPBS で湿らせて、組織表面と試験化学物質との接触を改善します。次に、微粉砕した試験材料を 25 mg のシャープアプリケーションスプーンに充填します。固形のテスト化学物質を組織表面に塗布します。必要に応じて、ピペットの先に滅菌済みのバルブを装着し、スプーンの中身を完全にしごき出してください。インサートを軽く振って、固形物が表面に広がるようにします。また、組織のサイズに合わせて、ピペットの先端にバルブヘッドを装着して使用しても構いません。組織の表面を圧迫しないでください。最後に、最後の組織への投与後、陰性コントロールとしてDPBSを、陽性コントロールとして5% SDSを、それぞれ組織インサートに3連で添加します。その後、すべてのプレートを、加湿された37 °Cのインキュベーターに35 ± 1分間移します。このインキュベーションの間に、洗浄工程に必要なすべての材料をフード内に準備してください。35分間のインキュベーション後、すべてのプレートをインキュベーターから取り出します。それらを滅菌フード内に置き、初回投与組織の化学物質曝露が完了するまで60分間待機します。次に、洗浄の手順を開始します。組織を滅菌済みのDPBSで15回すすぎます。残留した試験物質を除去するため、組織表面から1.5 centimeters離れた位置からDPBSを絶えず流し入れて組織インサートを満たし、その後、液を捨てます。DPBSのストリームが弱すぎると試験物質が除去されないため、注意してください。ナイロンメッシュを用いて4つの組織を5回洗浄する際、1分間の時間間隔を維持し、尖端の鋭いピンセットで慎重にメッシュを取り除いてください。その後、残り10回の洗浄を継続し、15回目の洗浄後に洗浄ボトルを用いてインサートを完全に浸しながら3回すすぎ、150 millilitersのDPBSを用いて振盪し、残存する試験物質を除去します。最後に、組織を洗浄します。滅菌済みのDPBSを用いて、内側から1回、外側から1回挿入します。インサートを軽く振り、滅菌済みの吸水紙で吸い取ることで、組織から過剰なDPBSを取り除きます。次に、ブロット処理した組織インサートを、あらかじめアッセイ培地を満たしておいた新しい6ウェルプレートに移します。ここでも、各曝露検体の曝露時間を60分に維持するため、これらすべての工程を1分以内に完了させる必要があることに注意してください。最後の組織を洗浄した後、滅菌綿棒を用いて各組織の表面を慎重に乾燥させます。表面に化学物質の痕跡がまだ残っている場合は、滅菌済みの綿棒を使用して除去してください。最後に、組織をインキュベーターでさらに24時間培養します。培養開始時間をメソッド記録シートに記入してください。また、手法の記録シートにすべての異なるアプリケーションを記録してください。Mat Tech Corporationから提供された、フード内でのプレート移動に関する標準作業手順書の付録に従ってください。インサートを、0.9 milliliterの培地があらかじめ充填された6ウェルプレートの下部に移します。上段の培地を回収し、あらかじめラベルを貼った24ウェルプレートに分注して、-20 °Cで保存します。培養液中に放出されたサイトカインおよび/またはケモキンの解析は、任意の手順です。そのままさらに18 ± 3時間インキュベートした後、MTTアッセイ用に2枚の24ウェルプレートに化学物質名またはコードを記入します。MTTは毒性があるため、取り扱う際は必ず保護手袋を着用してください。MTT濃縮液を融解し、MTT希釈液で希釈してMTT溶液を調製します。MTTは光に敏感であるため遮光し、2〜3時間以内に使用してください。MTTは時間とともに分解するため、24ウェルプレートの各ウェルにMTT培地を300 microlitersずつ分注します。次に、6ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。ブロッティングペーパーでインサートの底部を吸い取り、MTTを予め満たした24ウェルプレートに移します。24ウェルプレートをインキュベーターに入れ、3時間インキュベートします。MTT読み取り値にばらつきが出るのを避けるため、MTTインキュベーションの開始時間をMDSに記録し、3時間のインキュベーション時間を厳守してください。MTTインキュベーションが完了したら、有害廃棄物トラップ付きの吸引ポンプを使用して、すべてのウェルからMTT培地を静かに吸引します。ウェルにDPBSを満たし、吸引します。この洗浄工程をさらに2回繰り返し、最後の吸引後に組織が乾燥していることを確認してください。洗浄後、インサートを新しい24ウェルプレートに移し、各インサートに抽出液2 mLを穏やかにピペッティングして、インサートを浸します。液面がインサートの上端より高くなり、組織の両側が完全に浸されます。抽出液の漏出と蒸発を防ぐため、ヒートシーラーまたはパラフィルムを使用して24ウェルプレートを密封します。抽出開始時間をメソッド記録シートに記入し、プレートシェーカーで緩やかに振盪しながら、室温で少なくとも2時間抽出します。抽出期間の終了後、注入針またはバルブ付きピペットでインサートを突き刺し、抽出液をインサートを回収したウェル内に流し込みます。穿孔したインサートを廃棄し、ウェル内の溶液を均質になるまでピペッティングで3回混ぜ合わせます。また、組織ごとに120 RPMに設定したプレートシェーカーを使用することも可能です。ブルーフォルマ溶液を200 µLずつ2回、96ウェル平底マイクロタイタープレートに分注します。このビデオプロトコルに付属するスプレッドシートに記載されたブランク用の固定プレートデザインに従って、重複サンプルを移送します。ISOプロパノールを用い、96ウェルプレート分光光度計を使用して、リファレンスフィルターを使用せずに波長570 nanometersで吸光度（OD）を読み取ります。結果をスプレッドシートに入力し、結果を自動計算させてください。付属のプロトコルに記載されている通り、試験化学物質による干渉に起因する補正を行い、試験化学物質を刺激性と判定します。分光光度分析の結果、組織生存率が50%以下であり、NC組織のOD 570が1以上2.5以下である場合。また、陰性対照組織に対するPC組織の平均生存率（パーセント表記）が20%未満であり、かつ同一条件で処理した3つの複製試料の個別の組織生存率から算出されたSDが18%未満である場合。細胞生存率が50%未満の値を示す化合物は、刺激性とみなすことができます。以上で、再構築ヒト皮膚モデルEpidermを用いた、検証済みの60分および42時間の皮膚刺激性試験の実施方法について解説しました。この手順を行う際は、試験の大部分が無菌または無菌に近い条件下で実施されることを忘れないでください。手法の変更が必要な場合や、手順の各ステップについてより詳細な説明が必要な場合は、お気軽に弊社までお問い合わせいただき、サポートやアドバイスをご活用ください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功をお祈りいたします。

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