アンインビトロ皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

表皮は、マットテック社が開発したヒト表皮のin vitroモデルを再構築された正常なヒト細胞由来のものです。EC VM検証済み表皮皮膚刺激性試験プロトコルは、化粧品、原材料、工業用薬剤など、人間の皮膚と接触する製品の従来の動物ベースの試験に代わるものです。このテストは、皮膚刺激キットと表皮組織がラボに到着した0日目に開始され、その後、一晩のインキュベーション後にアッセイ培地に前処理されます。

1日目に、表皮組織の非定型表面を推定刺激性化合物で1時間露出させ、次に2日目に洗浄ステップで刺激物を取り除きます。24時間のインキュベーション後、培養インサートを新鮮な培地に入れ、古い培地を遊離したサイトカインとケモカインの分析に使用できます。この組織はMTTと呼ばれる化合物と反応し、ミトコンドリアレダクターゼによってマオズと塩の濃い紫色に変換されます。

細胞生存率の読み出しを提供します。サンプルに濃い紫色がないことは、生存率の低下の指標です。また、試験化合物のカロリー指標の読み取り値がネガティブコントロールの50%未満の場合、試験化合物は刺激物として分類できます。

こんにちは、マットコーポレーションのヘレナ・カヴァです。本日は、再構築されたヒト皮膚モデル表皮を用いたin vitro皮膚刺激性試験の手順をご紹介します。この手順は、規制要件に応じて、in vivo迅速皮膚刺激性試験の完全または部分的な代替として使用できます。

この新しいin vitro手順は、化学物質や化粧品原料の危険性同定やラベリングに使用できます。それでは始めましょう。表皮は、ヒト表皮のケラチノサイト培養に由来し、ヒト表皮の三次元、多層、高度に分化したモデルを形成します。

この組織は有糸分裂学的および代謝的に活性であり、構造的にも生化学的にもin vivoの対応物と密接に模倣しており、ヒトの表皮と同様に再現性が保証されています。表皮は、組織化された基底の棘状および顆粒状の層と、多層の角質層で構成されています。後者には、in vivoで見られるものと同様のパターンで配置された細胞間ラムミラー脂質層が含まれています。

これらの組織は無血清培地で培養されます。個々の細胞培養インサートで増殖した各組織。96ウェルのハイスループットフォーマットを含む他の構成も利用可能です。

組織の作製は、このプロセスの特定のポイントで完了するまでに約3週間かかり、組織は空気液体界面まで上昇し、すべての液体が組織のAPIC表面から除去されます。N Fedの組織は、mat tech独自の培養培地と接触したままの基底外側表面を介してのみ供給されます。一般的な表皮キットには、各組織に直径9mmの24の組織が含まれており、さらにこの皮膚刺激性試験を行うのに十分なアッセイ培地が含まれています。

24インサートは、標準的な24ウェルプレートの各ウェルに1つの組織を注入したAGAローズゲルにしっかりと固定されており、化学物質のテストに着手する前に、摂氏3〜4度の温度で一晩のキャリアによって出荷されます。EPIDERMテストシステムを使用して、書面によるプロトコルに記載されているように、アッセイで使用されるすべての機器とツールを準備し、滅菌します。綿棒などの材料の一部は、滅菌パッケージで提供されるか、オートクレーブ滅菌する必要があります。

70%エタノールは、鉗子などの器具を滅菌するために使用し、UVまたはガンマ線照射は、洗浄ボトルを滅菌するために使用する必要があります。アッセイで使用する2つの重要な溶液は、事前に調製されたDPBS溶液と5%SDS溶液である必要があります。蒸留水では、約 2 リットルの滅菌 DPBS pH 7 がアッセイで使用され、24 の表皮組織を含む 1 つのキットが使用されます。

滅菌DPBSは、洗浄液としてだけでなく、ネガティブコントロールとしても機能します。5%SDSを調製し、ポジティブコントロールとして使用する必要があります。皮膚刺激性アッセイは、EPIDERM EPI 200 SITキットの受領時に開始されます。

すべてのキットコンポーネントの完全性を確認し、すべてがそこにある場合はすぐにMat Techコーポレーションに連絡して、次のステップに進んでください。試験を開始するには、キットに付属のアッセイ培地を室温に戻します。層流フードで予熱しないでください。

表皮組織インサート3枚につき6ウェルプレートを1枚調製し、滅菌条件下でアッセイ培地0.9ミリリットルを各ウェルにピペットで移します。表皮組織が入った24ウェルプレートを保持しているビニール袋を無菌気流で開きます。滅菌ガーゼを取り外し、滅菌鉗子を使用して、表皮組織を含む各インサートを慎重に取り出します。

滅菌ガーゼまたは濾紙に優しく吸い取り、インサートの外側に付着した残りのアロを取り除きます。そして、次の5分以内に組織を空の滅菌24ウェルプレートに入れます。インサートを目視検査します。

表面の組織の欠陥や過剰な水分を記録します。欠陥のある組織やティッシュは使用しないでください。完全に液体で覆われています。

最適なティッシュインサート。表面は乾燥しており、表面に剥離、凹凸のある部分、または余分な液体がないようにする必要があります。次に、滅菌綿棒を使用して、ティッシュの表面を注意深く乾かします。

ティッシュに直接触れないようにしてください。毛細管現象は、表面を乾燥させた後、表面から水分を取り除くのに十分です。3つのティッシュを6つの組織の一番上の列に移します。

0.9ミリリットルのアッセイ培地を充填したウェルプレート。インサートの下に閉じ込められた気泡を放出します。次に、インサートを含む6つのウェルプレートをインキュベーターに1時間置きます。

摂氏37度でのプレインキュベーション。最初のインキュベーション前期間の終わりに、インサートを上部ウェルから6ウェルプレートの下部ウェルに移します。プレートをインキュベーターに戻し、一晩のインキュベーション前に置きます。

残りのアッセイ培地を冷蔵庫に入れます。一晩のプレインキュベーションの後、試験薬品を表皮組織インサートに塗布することができます。化学物質曝露アッセイを開始する前に、必要なすべてのデバイス、溶液、および試験化学物質を室温に置いてください。

滅菌フード内で、すべての非滅菌材料ボトルを70%エタノールで拭いてからフード内に入れます。.ネガティブコントロール滅菌DPBSポジティブコントロールと5%SDSおよび蒸留水もフードと室温に入れる必要があります。大きなバイアルは廃棄物のために取っておく必要があります。

6を1つ用意します。ウェルプレートは、ウェルごとに0.9ミリリットルのアッセイ培地のみを上段に充填することにより、各化学物質ごとにプレートします。各プレートに組織番号と化学名をラベル付けします。

化学物質への計画的な曝露の約5分前。プレコンディショニング組織を含む6枚のウェルプレートをインキュベーターから取り出します。次に、組織の表面を視覚的に評価します。

滅菌綿の先端を使用して水分を取り除き、ティッシュの表面を押さないでください。最後に、6つのウェルプレートの蓋に試験材料コードまたは名前をラベル付けします。1回の試験で陰性コントロールとポジティブコントロールをそれぞれ3回ずつテストするなど、6つ以上の化学物質をテストしないでください。

化学薬品を塗布し、既知の試験物質を取り扱うために1分間の洗浄間隔を使用してください。コード化されたサンプルまたは不明なサンプルについては、製品安全データシートまたはMSDSに記載されている指示に従ってください。化学物質の安全ガイドラインに従い、換気されたキャビネットを使用してください。

手袋を着用し、目と顔の投与組織を1分間隔で化学物質で保護し、曝露後の試験化学物質のすすぎを容易にし、最後の組織が投与されるまで、用量組織を含むプレートを層流フードに保ちます。ピペットのそばに向かった電球は、組織と試験化合物を操作するために手順全体で使用されます。ブンゼンバーナーの炎は、液体化学物質をテストするための球形の先端を生成するために使用できます。

30マイクロリットルの液体試験体を組織の上に直接分注し、すぐにタイマーを開始してカウントアップします。ナイロンメッシュをティッシュの表面に置きます タイマーが1分になったら、2番目の液体コンパウンドを追加します。テストケミカルごとに3つの組織を使用し、各化合物を1分間隔で追加することを覚えておいてください。

半固形物の試験には、容積式ピペットを使用して、組織の上に30マイクロリットルを直接分注します。必要に応じて、ティッシュのサイズに合わせてパスチャーピペットで化学薬品を広げます。固形物質を塗布する直前に、組織表面を25マイクロリットルの滅菌DPBSで湿らせて、組織表面と試験薬品との接触を改善し、25ミリグラムの鋭利な塗布スプーンに細かい粉砕試験材料を充填します。

固形試験薬品を組織表面に塗布します。必要に応じて、ピペットを通り過ぎた滅菌電球を使用して、スプーンを完全に空にします。インサートを静かに振って、表面上の固体の広がりを改善します。

また、ピペットの後ろに向かった電球を使用して、ティッシュのサイズに合わせることもできます。ティッシュの表面を押さないでください。最後に、陰性コントロールとしてDPBSを、ポジティブコントロールとして5%SDSを組織インサートに適用し、最後の組織を投与した後も三重で、すべてのプレートを35±1分間、加湿した摂氏37度のインキュベーターに移します。

このインキュベーション中は、洗浄ステップに必要なすべての材料をフードに入れてください。35分間のインキュベーション後、インキュベーターからすべてのプレートを取り出します。それらを滅菌フードに入れ、最初の投与組織の化学物質曝露が完了するまで60分待ちます。.

次に、洗濯手順を開始します。滅菌DPBSで組織を15回すすいでください。残留試験材料を除去するには、組織表面から1.5センチメートル離れたところに供給されるDPBSの一定の流れを使用して組織インサートを充填し、空にします。

DPBSストリームが弱すぎないか、試験物質が除去されないことを確認してください。ナイロンメッシュウォッシュで4つのティッシュを5回洗浄するための1分間隔を維持し、先のとがった鋭利な鉗子でメッシュを慎重に取り外すことを忘れないでください。その後、15回目以降は残りの10回の洗浄を続け、インサートを3回と150ミリリットルのDPBSを完全に沈めたウォッシュボトルを使用してすすぎ、残りの試験材料を除去して振とうします。

最後に、ティッシュをすすぎます。滅菌DPBSで内側から1回、外側から1回挿入します。インサートを静かに振って滅菌済みあぶらとり紙に吸い取り、組織から余分なDPBSを取り除きます。

次に、ブロッティングした組織インサートを、アッセイ培地をあらかじめ充填した新しい6ウェルプレートに移します。繰り返しになりますが、これらの手順はすべて、露光されるたびに60分の露光時間を維持するために、1分間隔で実行する必要があることを忘れないでください。最後のティッシュをすすぎた後、滅菌綿の先端スワブで各ティッシュの表面を注意深く乾かします。

化学物質の痕跡が表面にまだ残っている場合は、滅菌済みの既婚綿棒を使用してそれらを取り除いてみてください。最後に、次の24時間、インキュベーター内で組織をインキュベートします。インキュベーションの開始時間をメソッドのドキュメンテーションシートに記録します。

また、メソッドドキュメンテーションシートにすべての異なるアプリケーションを記録します。マットテックコーポレーションが提供する標準操作手順の付録で、フード内のプレートを移動します。インサートを、0.9ミリリットルのメディアで事前に充填された6ウェルプレートの下部に移します。

上の列から培地を採取し、編集部をあらかじめラベル付けした24ウェルプレートにパイプで入れ、マイナス20°Cでセットします。分析までは、培地に放出されたサイトカインやケモカインの分析は任意のステップです。さらに18時間から±3時間のインキュベーションを続けて、化学名またはコードを含むMTTアッセイラベル2 24ウェルプレート

MTTは有毒であるため、必ず保護手袋を着用してください。お取り扱いの際。MTT濃縮液を解凍し、MTT希釈剤で希釈してMTT溶液を調製します。

MTTは光に敏感であるため、光から保護し、2〜3時間以内に使用してください。MTTは経時的に劣化するため、24ウェルプレートの各ウェルに300マイクロリットルのMTT培地をピペットで取り付けます。次に、インキュベーターから6つのウェルプレートを取り外します。

インサートの底部をあぶらとり紙でブロットし、MTTをあらかじめ充填した24ウェルプレートに移します。24ウェルプレートをインキュベーターに置き、3時間インキュベートします。MDSでMTTインキュベーションの開始時間を記録することを忘れないでください 厳密に3時間のインキュベーション時間を遵守して、異なるMTT測定値を取得しないようにします MTTインキュベーションが完了したら、有毒廃棄物トラップ付きの吸引ポンプを使用して、すべてのウェルからMTT培地を穏やかに吸引します。

ウェルにDPBSを補充し、吸引します。再度、このすすぎをさらに2回繰り返し、最後の吸引後に組織が乾いていることを確認してください。洗浄後、インサートを新しい24ウェルプレートに移し、2ミリリットルの抽出液を各インサートに静かにピペッティングしてインサートを浸します。

レベルはインサートの上端より上に上昇するため、両側から組織を完全に覆います。ヒートシーラーまたはパラフォームを使用して24ウェルプレートをシールし、抽出物と蒸発を抑制します。抽出の開始時間をメソッドドキュメンテーションシートに記録し、プレートシェーカーで穏やかに振とうしながら室温で少なくとも2時間抽出します抽出期間が完了したら、ピペットを過ぎた注射針または球根でインサートを突き刺し、抽出物をインサートが採取されたウェルに流し込みます。

穴の開いたインサートを廃棄し、溶液が均一になるまでウェル内で溶液を上下に3回ピペットで動かします。120 RPMに設定されたプレートシェーカーも、各組織ごとに使用できます。青色のフォルマと溶液の2つの200マイクロリットルアリコートを96ウェル平底マイクロ力価プレートに移します。

ブランクのこのビデオプロトコルに付属するスプレッドシートに記載されている固定プレートデザインに従って、複製を転送します。ISOプロパノールを使用し、光学濃度またはODを読み取り、参照フィルターを使用せずに波長570ナノメートルの96ウェルプレート分光光度計を読み取ります。結果をスプレッドシートに入力すると、結果が自動的に計算されます。

付属のプロトコルで概説されているように、試験化学物質の干渉による修正を考慮し、試験化学物質には刺激性ラベルが付けられています。分光測光分析の結果、組織生存率が50%以下である場合、NC組織のOD 5 70は1以上2.5以下です。そして、ネガティブコントロール組織の割合として表されるPC組織の平均生存率は20%未満であり、そして、同一に処理された3つのレプリカントの個々のパーセンテージ組織変動から計算されたSDは18%未満であり、50%未満の細胞生存率値をもたらす化合物は刺激物と見なすことができる。

人間の皮膚モデルを使用して、検証された60分、42時間の皮膚刺激性試験を実行する方法を示しました。表皮。この手順を実行するときは、テストの大部分が滅菌条件下で、または敗血症条件下で行われることを覚えておくことが重要です。メソッドの変更が必要な場合、または手順のいずれかについてより適切な説明が必要な場合は、遠慮なくお問い合わせください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。