Name: に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ 15 N代謝標識および定量的質量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ多タンパク質複合体の比較分析手法。ラモナ細胞のチラコイド膜を分離し、スクロース密度勾配分画と定量質量分析でタンパク質組成変化を解析する。環境条件によるタンパク質動態の理解に貢献する。

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MHが「ドイツ学術振興」（DFG）からの支援を認めるものです。著者 寄付：MHが調査を設計し、KT、JSとMTは、研究を行い、データを分析し、KTとMHが論文を書いた。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

安定同位体標識を用いて、異なる定量的プロテオミクス研究は、過去数年に発表されている。これらの実験では、通常、2つの異なるサンプルは、1つのサンプルが安定同位体で標識された、比較される。その後、二つの試料からのタンパク質またはペプチドは、等しい比率で組み合わされ、一緒になって、さらに48を処理した。このような研究は、多くの場合、アップまたはダウンレギュレーション特異的タンパク質の調査する26,34,49異なるストレス条件にさらさ定義されて孤立した細胞区画（ 例えば葉緑体、ミトコンドリア、またはチラコイド膜）を比較していきます。記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチはチラコイド膜に多タンパク質複合体の組成を分析することを目的とし、前述の研究とは対照的に、前に同じクロロフィル濃度でロードチラコイド膜のスクロース密度分離後の試料の同じボリュームを混合に基づいているultracentrifugaTiONから。この方法は、効果的に比較的WT及びショ糖密度勾配でPSI-依存的移行タンパク質を同定するΔPSI株から単離されたCEF-supercomplexの組成を分析した寺島...

植物や藻類のチラコイド膜での光合成のプロセスは、線状および環状モードで機能することができます。リニア電子流（LEF）の間に光化学I（PSI）、光化学系II（PSII）およびシトクロムB 6 / Fは、最終的には 、NADPHとATP 2の生成につながる、NADP + 1を水から電子を移動。対照的に、状態2 3 4及び嫌気的条件等の多様な環境条件下で誘導されることが知られている環状の電子流（CEF）は、バック電子伝達鎖に電子を注入することによって酸化PSIの再減少をもたらす。このプロセスは、チトクロームB 6 / F複合体1の間質側またはプラストキノンプール5のいずれかで行われるとATPを生成しますが、無NADPH 2することができます。 提示されたプロトコルの目的は、質量分析（MS）ベースのm個を実証することである（遺伝的に異なる株と比較することによって例示される）、さまざまな条件の下でこれらの複合体の組成物への洞察を得るためにクラミドモナスのチラコイド膜での多タンパク質複合体の比較、定量分析のためのethod。このアプローチは、寺島らによる刊行物に適用された。2012年にはC言語でのCEFののCa 2 +依存性の調節を示すクラミドモナスは、タンパク質、CAS、ANR1、およびPGRL1 6を含む多タンパク質複合体により媒介される。手順は、比較的重いことにより、標識窒素（15 N）を有する二つの株のいずれかを利用して二つ遺伝的に異なる菌株におけるCEF-supercomplexの組成を分析することによって説明される。簡単に説明すると、プロトコルは、界面活性剤可溶化し、ショ糖密度勾配における光合成複合体の分画、続いてチラコイド膜の調製を含む。勾配の分画後、FRACを選択した二つの株のtionsを混合し、等しい体積に基づいてゲル内消化およびその後の定量的MS分析に続いてSDS-PAGEによって分離されている。 上述したように、CEFは異なる環境条件の下で誘導され、2010年からの出版物は、機能的なCEF-supercomplex Cの状態2ロックされたセルからの隔離を示しています超遠心分離中にショ糖密度勾配上に可溶化されたチラコイド膜を分離することによって行われた、07 ラインハーディ 。岩井ら 7とは異なり、提示されたプロトコルは、C.成長嫌気から、CEF-supercomplexの単離を記載代替手順に従うことによって、 クラミドモナスの文化。これは、チラコイド分離プロトコルにおける変化ならびに可溶化工程及び超遠心分離によるタンパク質複合体の分離に関する差異を含む。現在のプロトコルでは、チラコイド膜バッファは、岩井らによるチラコイド調製のために使用しながら、チュアとBennoun 8によって発表された手順を適用することによって単離される文献 09記載のように、25mMのMES、0.33 Mスクロース、5mMのMgCl 2、1.5mMのNaCl液（pH6.5）を含有した。ここで説明可溶化法が0.9％の界面活性剤の使用に依存しながら可溶化は、岩井および共同研究者の場合には、氷上で30分間、0.7から0.8パーセントの界面活性剤（n-トリデシル-β-D-マルトシド）を用いて行った（nは-ドデシル-β-D-マルトシド（DM-β））と、氷上で20分間だけ実行される。両グループは、それぞれの洗剤で可溶化にミリリットルあたりのクロロフィル0.8mgのを使用していました。このプロトコルの作者が範囲の濃度を使用し、一方、可溶化したチラコイド膜からの光合成複合体を分離するための岩井ら 、0.1から1.3 mのショ糖濃度を適用0.4〜M.最後の差から比べても低い遠心分離速度は、あるEAへrlier出版。 ショ糖密度勾配分画に続いて非イオン性界面活性剤とのチラコイド膜の可溶化は、すでに1980年代から、タンパク質の代謝標識の適用はプロテオミクス分野で普及の方法で、今日7、9月14日まで、至るまで数多くの研究に適用されている。記載されたアプローチは、質量に至る全てのアミノ酸に組み込まれている15 N NH 4 Cl を 、の形の唯一の窒素源として重窒素の存在下で培養することにより、2つの比較した株のいずれかの15 N代謝標識を適用するペプチドのアミノ酸配列に応じてシフトする。 1 MSラン内の14 Nおよび15 Nの混合物を分析する場合、この質量シフトは、各ペプチドの試料の起源を決定するために使用することができ、ペプチドの相対存在量は、相当の相対存在量を表す計算することができる。タンパク質15を ING。 C上の多数の定量的プロテオミクス研究クラミドモナスは、実験条件（ 例えば 、栄養16〜19によるプロテオームの変化や光ストレス20,21）間のプロテオームの変化を分析するために、タンパク質の定義された量を比較した、利用可能です。これらの研究と比較して、現在提示アプローチにおいて試料の等容量を一緒にし、分析する。このセットアップでは、グラデーション内のタンパク質の移行挙動を研究するため、さらに調査した株に対して異なる複合体の組成を分析することができます。 このメソッドは、主に三つのタンパク質に集中して説明する。第一候補は、C.中の光馴化に関与することが示された葉緑体に局在するカルシウムセンサータンパク質のCASで、 クラミドモナス 22。カルシウムは、重要なシグナルであると考えられている最終的に遺伝子発現と細胞生理学23の変化につながるため、様々な生物的および非生物的ストレスに活性化され、それが葉緑体は、CASタンパク質22,24,25を介したシグナル伝達+携帯のCa 2に貢献するかもしれないことが提案された経路のためのイオンをING。第二のタンパク質はANR1（嫌気応答1 6）、Cで無酸素の成長条件下で誘導されることが示されたタンパク質であるクラミドモナス 26。とりわけ、CASならびにANR1はCEF-supercomplexのサブユニットとして同定され、また、逆遺伝学的ア ​​プローチを用いて、それが両方のタンパク質が、このタンパク質複合体の機能的なサブユニットとしての役割を支持し、 インビボ 6 に CEFに機能的に寄与することが実証された。第3のタンパク質は、 クラミドモナス 4,27においてだけでなく、 シロイヌナズナ 5,28にCEFに関与することが示されており、また、IDだったチラコイド蛋白PGR5様1（PGRL1）、ある岩井らの作品にentified。7 ΔPSI29株（対）対野生型（WT）、PSAB遺伝子の欠失を示す、またの一部であるサブユニットIは本質的な光化学系をコードする：このアプローチは、2つの異なる実験の結果を示すことによって提示されるCEF-supercomplex及びWT対A pgrl1ノックアウト株は4。これらの実験のそれぞれについて、15 Nおよび14 N標識株は、比較されている間、CEF-supercomplexの定量的組成物。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>アセトン</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>アセトニトリルオプグレードf&uuml;r LC-MS</td><td>Diagonal</td><td>9340</td><td>有害で、手袋をはめたまま作業してください。その他の注意事項については、プロトコルのテキストを参照してください。https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム 15N</td><td>ケンブリッジ同位体研究所</td><td>39466-62-1</td><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td></tr> 塩化<tr><td>アンモニウム 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ リン酸水素アンモニウム&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ 硫酸アンモニウム&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ Coomassie ブリリアントブルー R-250</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10041653</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td></tr><tr><td>n-ドデシル-&β;-D-マルトシド</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ ギ酸&nbsp;&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>塩化マグネシウム</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ メタノール</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ リン酸</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>リン酸水素二カリウム&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>リン酸二水素カリウム&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ スクロー</td>ス <td>AppliChem</td><td>A1125</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.applichem.com/home/ Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>トリプシン(シーケンシンググレードを変更)およびトリプシン</td><td>バッファーPromega</td><td>V5111</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.promega.de/機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ネブライザー(BioNeb細胞かく乱器)</td><td>Glas-Col</td><td></td><td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td></tr><tr><td>遠心分離管(14 mm x 89 mm)&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td>高橋スタイルグラデーションの調製に
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>遠心チューブ 25 mm x 89 mm </td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>チラコイド単離グラジエントの調製用。
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>コールター アバンティ遠心分離機 J-20 XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.beckmancoulter.de/ フックス・ローゼンタール細胞 カッティングチャンバー</td><td>ダイアゴナル</td><td>449/72</td><td>https://www.diagonal.de/</td></tr> <tr><td>ホモジナイザー (ポッター) 50 ml&nbsp;</td>ホ<td></td><td></td>モジナイザー用<td>フィッシャーブランド</td>10618242 http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</tr><tr><td>雌しべ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>105252220</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>超遠心分離機(オプティマXPN-80超遠心分離機)</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>のウェブサイト:http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体&nbsp;</td><td>アグリセラ</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; n代謝標識および定量的質量分析

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

導入されたプロトコルは、異なる条件下での複雑な組成物への洞察を明らかにすることによって、チラコイド膜内の多タンパク質複合体の分析のためのツールを提供しています。このプロトコルではアプローチは、遺伝的に異なる株から単離されたコナミドリムシ環状電子流（CEF）に関与するタンパク質複合体の組成を比較することによって実証される。手順は、差動代謝標識（14 N / 15 N）に基づいて、ショ糖密度勾配遠心分離、SDS-PAGE、免疫検出および比較、定量的な質量分析（MS）による多タンパク質複合体へのそれらの分離を行い、チラコイド膜の単離を含む株を分析した。洗剤可溶化したチラコイド膜は、等しいクロロフィル濃度のショ糖密度勾配にロードされます。超遠心分離後、勾配は、質量spectrometによって分析される画分に分離されるRY同体積に基づく。このアプローチは、さらに勾配画内の組成の調査と、特にANR1、CAS、およびPGRL1に焦点を当て、異なるタンパク質の移行挙動を分析することができます。さらに、この方法は、（イムノブロットの結果を確認することにより、さらに、以前の研究からの知見を支持して、以前にCEF-supercomplex例えばPGRL1、FNRなどの一部であると記載されたタンパク質の同定およびPSI-依存性遊走を示しており、 CYT F）。注目すべきことに、このアプローチは、このプロトコルを採用することができ、 例えば、異なる環境条件から単離された多タンパク質複合体組成物の比較分析のために使用される質問の広い範囲に対処するために適用可能である。

導入された定量的プロテオミクスのアプローチは、遺伝的に異なる温度でのCEF-supercomplexコンポーネントの比較分析によって実証チラコイド膜内の多タンパク質複合体の組成物を特徴づけることを目的クラミドモナス株 。 。メソッドが正常寺島らにより適用された6記載の洗剤可溶化に続いて、嫌気性成長した培養物からのチラコイド膜の単離を含む。次いで、サンプルを、同じクロロフィル量に基づいて、ショ糖密度勾配上にロードされ、複合体は、超遠心分離によって分画する。定量的MS分析のために、異なる株から2勾配画分の等容量を混合し、比較的（ 図1）分析する。提示された結果は、WT cw15-arg7とΔPSIだけでなく、それぞれのWT cc124とpgrl1、間、CEF-supercomplex画分の比較が含まれています。 <p c小娘= &quot;jove_content&quot;&gt;イムノブロット分析によって明らかにされたCEF-supercomplex WT及び分13に...

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

本手順の全体的な目的は、異なる条件下における thal 索膜中の MultiPro コンプレックスの組成を比較分析することである。これは、まず嫌気条件下に置かれた lamona 細胞から thal 膜を単離し、次に th 索膜を可溶化してスクロース密度勾配で分画することによって達成される。次に、目的の分画を等量ずつ混合し、SDS-PAGEで分離します。最後に、クマシー染色されたバンドをトリプシンで消化します。最終的に、定量質量分析を用いてサンプルを解析し、調査した分画間でのタンパク質存在量の変化を観察します。定量プロテオミクス研究のように一定量のタンパク質を比較する既存の手法に対する本手法の主な利点は、分画されたサンプルの等量ずつを混合して分析する点にあります。これにより、勾配内におけるタンパク質の移動挙動を調査できるだけでなく、第三群膜における異なる非タンパク質複合体の組成を分析することが可能になります。使用する株に関しては、テキストプロトコルに従ってChlamydomonas reinhardtii株を培養した後、2 M sucrose、10% beta DM (in water)、および 0.5 M Tris pH 8.0のストック溶液を使用してください。14×89 mm遠心チューブを用いてショ糖密度勾配を調製するために、まず1.3 M溶液1 mLをゆっくりと注ぎ、次に1.0 M溶液1 mLを注ぎます。続いて、0.85 M、0.7 M、0.65 M、そして最後に0.4 Mの各溶液を2 mLずつ注ぎます。嫌気条件を誘導するため、調製した密度勾配はコールドルームで一晩保存してください。クラミドモナス培養液にガラスピペットを挿入し、アルゴンガスを4時間通気しながら、絶えず攪拌および照明を行い、チラコイド膜を単離します。インキュベーション後、まず細胞を 2,500 ×g、4 °C で5分間遠心分離してペレット化します。その後、細胞ペレットを 30 mL の H1 バッファーに再懸濁します。遠心分離を繰り返し、再度懸濁させる。細胞をH oneバッファーで懸濁して細胞を破砕し、1,500 Pascalsの窒素圧でネブライザーに通す。細胞が破砕されるよう、セラミックボールと金属の間の距離が十分に小さいことを確認する。次に、細胞を2,500 ×g、4 °Cで7分間遠心分離します。上清は薄い緑色になります。細胞の破砕が成功していれば、細胞を50 mLのH2バッファーで再懸濁し、32,800 ×g、4 °Cで10分間遠心分離してペレット化します。その後、細胞を10 millilitersのH three bufferで再懸濁し、ポッターホモジナイザーを用いて再懸濁したペレットを均質化します。次に、サクロース密度勾配を調製します。H three bufferに含まれる12 millilitersの細胞から開始してください。次に、H4バッファー12 mLをゆっくりと層状に注ぎ、最後にH5バッファー12 mLを加えます。H5バッファーを用いてローターのバランスを調整し、勾配を70,700 ×gで1時間遠心分離します。勾配からTHバンドを回収し、適切な量のH6バッファーを用いて希釈します。細胞を4°Cで37,900 ×gで20分間遠心分離します。ペレットが十分に凝集していない場合は、遠心分離のステップにH6バッファーを追加してください。その後、再懸濁します。フォトシステム・スクロース密度勾配にロードするために、チラコイドを少量のH6バッファーに懸濁させます。まず、各勾配に必要なチラコイド、β-DM、およびH6バッファーの量を計算します。これらのガイドラインに従い、各勾配は0.9% β-DM中のクロロフィル濃度が0.8 mg/mLとなり、最終的にH6バッファーで全量を700 µLまで調整します。チラコイドを可溶化するために、各グラジエント用にチラコイドβ-DMおよびH6緩衝液を含む個別の溶液を調製します。サンプルを氷上で20分間インキュベートし、数分おきに転倒混和します。その後、サンプルを4°Cで14,000 ×gで10分間遠心分離します。ペレットは小さく白っぽくなり、上清は濃い緑色になります。上清をH six bufferで調整してグラジエントバランスにロードし、134,470 ×gで14時間、4 °Cで超遠心分離します。遠心後、グラジエントの写真を撮影してから分画を行います。針を用いてチューブの底に穴を開け、分画を500 µLチューブに回収します。あるいは、96ウェルプレートを用いた処理を行います。ここで示したテキストプロトコルに従い、野生型の免疫血液分析分画6およびdelta PS1の分画13を用いたサンプルを、SDS-PAGE、ゲル消化、および質量分析に供します。本図では、環状電子伝達スーパーコンプレックス成分の解析のために、AおよびR1のピーク画分を選択しました。いくつかのPS Iコアタンパク質、PS Iの光捕集タンパク質、および環状電子伝達スーパーコンプレックスに割り当てられたタンパク質について、野生型とΔPS I 14 N/15 Nの比として描かれた相対的なタンパク質比を示しています。野生型とΔPS Iの画分6および13におけるNDH1とCASの含有量の差は、これらがこのコンプレックスの新規成分であることを示唆しています。ここでは、野生型とpgl1ノックアウト株の間でのこの環状電子伝達スーパーコンプレックスの定量的比較の結果を示しています。興味深いことに、HCF136、シトクロムb6、シトクロムb6fサブユニット4、およびPETCは野生型で濃縮されているようである一方、FTSH2、シトクロムf、およびPETOはpgl1で濃縮されているようです。このビデオを視聴することで、異なる条件下における膜上のMultiPro複合体の組成を比較する方法について深く理解することができます。膜の作製およびサイクリック電子伝達の分離を成功させるには、スーパー複合体を含む細胞の破砕、細胞のホモジナイズ、および膜の安定化が極めて重要なステップとなる点に留意してください。さらに、光合成複合体を完全に分離させるためには、ショ糖密度勾配遠心分離を少なくとも12時間行う必要があります。

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