に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ ¹⁵ N代謝標識および定量的質量分析

この手順の全体的な目標は、さまざまな条件下でのタルコードメンブレン内のMultiPro複合体の組成を比較分析することです。これは、まず嫌気性条件に曝露されたラモーナ細胞からthal膜を単離することによって達成されます。次に、thコード膜を可溶化し、ショ糖密度勾配で分画します。

次に、必要な画分を等量混合し、SDSページで分離します。最後に、クマシで染色されたバンドをトリプシンで消化します。最終的に、サンプルは定量的質量分析によって分析され、調査された画分間のタンパク質存在量の変化が観察されます。

この手法は、規定量のタンパク質を比較する定量的プロテオミクス研究などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、私たちのアプローチでは、同量の分画サンプルを組み合わせて分析することです。これにより、グラジエント内のタンパク質の移動挙動を研究することができ、さらに、第3グループの膜におけるさまざまな非タンパク質複合体の組成を解析することができます。適用された株に関して chlamydomonas 手綱丈夫な株を培養した後、テキスト プロトコルに従って、2 モルのスクロース、水中の 10% ベータ DM、および 0.5 モルの 3 液 pH 8.0 のストック溶液を使用します。

14 x 89ミリメートルの遠心分離管を使用してグラジエントを設定するためのショ糖密度勾配の以下の溶液を調製するには、まず1ミリリットルの1.3モル溶液をゆっくりと注ぎ、続いて1ミリリットルの1.0モル溶液を注ぎます。次に、0.85、0.7、0.65、そして最後に0.4モル溶液をそれぞれ2ミリリットル注ぎます。勾配を冷蔵室で一晩保存して、嫌気性条件を誘発します。

クラミドモナスの培養では、ガラスピペットを培養フラスコに挿入し、アルゴンヌで4時間泡立て、連続的に攪拌し、照明でタールコード膜を分離します。インキュベーション後、重力の2,500倍、摂氏4度で細胞を5分間ペレット化することから始めます。次いで、細胞ペレットを30ミリリットルのH 1緩衝液中に懸濁する。

遠心分離を繰り返し、再度、resus。細胞をH 1つの緩衝液に懸濁して細胞を破壊し、窒素圧1,500パスカルのネブライザーにそれらを通過させます。セラミックボールと金属の間の距離が、セルが壊れるのに十分小さいことを確認してください。

次に、セルを重力の2,500倍、摂氏4度で7分間スピンダウンします。上清の色は薄緑色でなければなりません。細胞の破損が成功した場合は、細胞を50ミリリットルのH 2バッファーに懸濁し、32、800倍の重力、摂氏4度で10分間ペレット

次に、Resusが細胞を10ミリリットルのH 3バッファーに懸濁した後、陶芸器を使用して再懸濁した口蓋を均質化します。次に、タールコードスクロース密度勾配を調製します。H 3バッファー中の12ミリリットルの細胞から始めます。

次に、12ミリリットルのH4バッファーの層をゆっくりと注ぎ、12ミリリットルのHファイブバッファーで仕上げます。H 5を使用してローターのバランスを取り、重力の70倍、700倍で1時間勾配を遠心分離します。グラジエントからTHバンドを除去し、適切な量のH sixバッファーを使用して希釈します。

細胞を重力の37,900倍で摂氏4度で20分間スピンダウンします。ペレットがきつい場合は、遠心分離ステップにH sixバッファーを追加します。その後、復活します。

タルコードを少量のH 6バッファーに懸濁して、フォトシステムのショ糖密度勾配をロードします。まず、各グラジエントに必要なタールコード、ベータDMおよびH 6バッファーの量を計算します。これらのガイドラインに従って、各グラジエントには0.9%β DMとH 6 Bufferに0.8ミリグラム/ミリグラムのクロロフィルが含まれ、最終容量は最大700マイクロリットルになります。

thysを可溶化するために、各グラジエントに対してThylakoids beta DMおよびH sixバッファーを別々にEloquaを調製します。サンプルを氷上で20分間インキュベートし、数分ごとに反転させて混合します。サンプルを14,000倍の重力で10分間、摂氏4度で遠心分離した後。

ペレットは小さくて白っぽく、上清は濃い緑色になります。上清をH 6バッファーと超遠心分離機でグラジエントバランスにロードし、重力の470倍、14時間、摂氏4度で行います。スピン後、勾配の写真を撮り、分画します。

針を使用してチューブの底に穴を開け、500マイクロリットルのチューブにフラクションを収集します。または96ウェルプレートプロセス。ここに示されているように、野生型からの免疫血液分析画分6とデルタPS oneからの画分13の結果を使用して、ここに示すテキストプロトコルに従ってゲル消化および質量分析のSDSページ

この図では、環状電子の流れの超複雑成分の分析のために、AとRのピーク分率が選択されました。デルタPS1に対する野生型、いくつかのPS、1コアおよびPSワンの光収集タンパク質、およびサイクリカル電子フロースーパーコンプレックスを割り当てられたタンパク質に対する野生型、デルタPSワンに対する14N、15Nとして描かれた相対タンパク質比が示され、野生型とデルタPSワンのフラクション6および13におけるNRワンとCASの存在量の差が示され、これらはこの複合体の新規成分であることを示唆しているこれは、野生型とPG L oneノックアウト株との間のこの周期的な電子の流れの超錯体の定量的比較の結果です。興味深いことに、HCF1 36、シトクロムB6、シトクロムB6、Fサブユニット4、PET Cは野生型で豊富に見られるようですが、FTSH2、シトクロムF、PET OはPG Lで豊富に豊富に含まれているようです。

このビデオを見た後、さまざまな条件下でのDi液体膜のMultiPro複合体の組成を比較する方法をよく理解できます。液体膜の調製に成功し、環状電子の流れを分離するためには、超複雑な細胞破壊、細胞のポタリング、および液体膜の化が重要なステップであることに注意してください。さらに、光合成複合体を完全に分離するためには、ショ糖密度勾配を少なくとも12時間遠心分離する必要があります。