マイクロ流体チャンバーを用いたストレス下での細菌増殖の顕微鏡解析

予熱した栄養培地で満たされたマイクロ流体プレートから始めます。

プレートをマニホールド システムに取り付け、セットアップを密閉します。媒体をチャネルに通して気泡を取り除きます。

セットアップを顕微鏡ステージに置き、イメージング中のプレートの膨張を防ぐために予熱します。

次に、培地を取り出し、細菌培養物を細胞入口に導入し、ストレス誘導培地を溶液入口に導入します。

ストレス誘導培地には、細胞量の増加を阻害することなく細胞分裂を停止する抗生物質が含まれています。

システムを密閉し、セルローディングを開始して、細菌をプレートの培養チャンバーに移します。

透過光を使用して、均等に分布した単一セルを含む視野を見つけます。

チャンバーにストレス誘発培地を注入して、細胞を抗生物質にさらします。

位相差モードを使用して、タイムラプス画像をキャプチャして、抗生物質を介した細胞分裂の阻害によって引き起こされるDNA含有量の増加を伴う細長い糸状細胞の形成を観察します。

まず、マイクロ流体プレートから保存溶液を取り出し、マイクロ流体ソフトウェアユーザーガイドの説明に従って摂氏37度に予熱した新鮮な培地と交換します。マイクロ流体プレートをマニホールドシステムに取り付けます。

そして、マイクロ流体ソフトウェアで、シールボタンをクリックして、プレートをマニホールドシステムにシールします。その後、 プライミング ボタン。マイクロ流体チャンバーの拡張を避けるために、マニホールドシステムを備えたマイクロ流体プレートを顕微鏡ステージに配置し、摂氏37度で2時間予熱します。

[シールオフ]ボタンをクリックして、マイクロ流体システムのマイクロ流体プレートをシールします。ウェル8の培地を150マイクロリットルの培養サンプルに交換し、ウェル1から5までの培地を、ストレス誘発試薬の有無にかかわらず目的の培地に交換します。マイクロ流体プレートを密封し、顕微鏡ステージに置きます。

マイクロ流体ソフトウェアで、セルローディング手順を実行します。透過光で顕微鏡下で観察して、セルの負荷が満足のいくものであることを確認します。透過光モードで慎重に焦点を合わせ、孤立した細菌を示し、過密になっていないいくつかの視野(100平方マイクロリットルあたり約10〜20個の細胞)を選択します。

マイクロ流体ソフトウェアで、[カスタムシーケンスの実行]ボタンをクリックし、2 PSIで10分間ストレス誘発培地の注入をプログラムし、その後、ストレス処理の必要な期間、1 PSIで注入します。透過光の位相差と、必要に応じてmCherry信号に560ナノメートルの励起光源を使用して、10分ごとに1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを実行します。顕微鏡画像取得とマイクロ流体注入プロトコルを同時に開始します。