Name: マウス膵島単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: 学ぶマウス膵島単離法。C3Hマウスの膵臓にコラゲナーゼを注入し、Ficoll密度勾配で精製してNODマウスに移植可能な膵島を調製する手法を解説。糖尿病治療研究に活用可能です。

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コラゲナーゼ準備<ol><li>下の表に示すように、最終濃度を、作るために50 mlコニカル及び追加の絶縁バッファにコラゲナーゼを秤量。ボルテックスによりコラゲナーゼを溶かす。 （12匹+ 2余分なマウス= 14マウス× 5 0.2ml /マウス= 70ミリリットルトータルコラゲナーゼ溶液） （70ミリリットル× 0.5 mg / mlまたはコラゲナーゼPの合計の0.3 mg / mlの= 35 mgまたは21 mg）を <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">ひずみ</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">年齢</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">コラゲナーゼP（mg / ml）を</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">時間（分） </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H、BALB / C、B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H、BALB / C、B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD、NOR、NON </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD、NOR、NON </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li>氷の上でそれぞれのガラスバイアルと所定の位置にコラゲナーゼ溶液2 mlを分注する。コラゲナーゼを追加30gの針と氷の場所（フードで準備）3mlで各5mlシリンジをロードする。 </li></ol>膨張<ol><li>ちょうど解剖前に、頚椎脱臼により動物を生け贄に捧げる。それは完全に濡れており、ETOHの70％で全身にスプレーしてください。陰部から始まるV - insisionを行います。尾があなたから離れて向くようにマウスを回転させる。 </li><li>オープンマウスの左側の腸を削除します。これは、膵臓と総胆管を公開します。 </li><li>胆管が腸を入力するコラゲナーゼ溶液のための小さなポケットを残し、排水溝小腸のいずれかの側の止血クランプを、置きます。 </li><li>胆嚢から始まる、冷たいコラゲナーゼ溶液3 mlを入れた30グラムの針と5mlシリンジと胆管を介して膵臓を膨らませる。 </li><li>体から膵臓を削除し、コラゲナーゼ溶液2 mlを含むシリコン処理バイアルに入れてください。このステップは、脂肪と結合組織のコレクションを最小限に抑え、 迅速かつとしてきれいに可能な限り実行する必要があります。 </li><li>次のマウスを使って氷を繰り返し、手順3でバイアルを置きます。 </li></ol>消化<ol><li>各バイアルを密封し、37℃の水浴中に入れてください。 13〜17分（時間は、動物の系統と年齢によって異なります）インキュベートする。 </li><li>時間が経過した後、精力的にバイアルを振る。膵臓はバラバラになるはず。 </li><li>無菌1000 mlのビーカーに大規模な滅菌シンクストレーナーを通してそれぞれのダイジェストを注ぐと強制的に洗浄バッファーに画面をオフにピペット。 50ミリリットルconicals管（：N = 12は、最終容量を200 mlを加えると4x50 mlチューブに分注するために十分な洗浄バッファーを使用する場合は3 pancreata/50 mlのチューブ）にダイジェストを分注する。希釈が不要な膵島の消化を防ぐために迅速かつ氷上で行われる必要があります。 </li><li>スピンダウン：遠心分離機を開始します。それが1300回転に達すると、それをオフにしてください。 </li><li> 〜5 mLを残し、上清を吸引除去する。ペレットを吸引しないように非常に慎重である。 </li><li>あなたの手で激しくタップしてペレットを再懸濁しますが、その後、洗浄緩衝液50 mlを加える。 </li><li>スピンダウン：遠心分離機を開始します。それが1300回転に達すると、それをオフにしてください。 </li><li>ペレットを再懸濁し、洗浄バッファー5 mlで洗浄する。 </li><li> 15 mlコニカルに5 mlを転送し、上記のように、スピンダウン。 </li><li>できる限り完全に上清を吸引除去する。 （残りのバッファは、フィコール密度の変化を引き起こす可能性があります。） </li></ol>フィコール すぐに実行します。長期的フィコール曝露は小島に対して毒性が強い。 <ol><li>ペレットが完全に前に追加フィコール（切れ目のない組織は、フィコールで再懸濁することが困難である）に分割されていることを確認します。 </li><li>精力的にボルテックスでフィコール、密度1.108、7mlにペレットを再懸濁する。 </li><li>その後、1.096、1.069、1.037：この順序で残りの密度のそれぞれのフィコール2ミリリットルの各密度の上の層。 </li><li> OFF破ると 、4℃で1800rpmで15分間スピン！ </li><li> spoid（無菌pを使用して2番目の層からの膵島を選ぶラスチックスポイト）。冷緩衝液の50 mlコニカル含む〜25 mLにすべてのコレクションを転送する。 </li><li>洗浄バッファー（ステップ12から15を繰り返す）と、上記のように、3回洗浄する。 </li><li>再懸は20ミリリットルRPMI - 1640でレッツ（10％FCSおよびペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、HEPES、MEM - NEAA）、穏やかに混合する。カウントのためのサンプル100 ulを削除します。 </li><li>メディアと1 mlのジチゾン1 mlを含む、35 mmのグリッドプレートに100 ulを転送する。 </li><li>メディア/プレートを30mlの合計160 mmプレートで、37℃、7％CO 2インキュベータ内で、RPMI 1640に残っている島をインキュベートする。 <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="図1" width="220" height="194" /></li></ol>

マウス膵島単離

Murine Pancreatic Islet Isolation

こんにちは、Greg Zottです。私はUCSF糖尿病センターのBluestoneラボに所属しています。本日は、マウス膵島を単離するプロセスをご紹介します。この手順では、ドナーとなるC3 Hマウスの膵臓にコラゲナーゼ溶液を注入し、その後、膵臓を摘出して消化し、密度勾配遠心法で膵島を精製します。そして、受容体となる糖尿病NODマウスの腎被膜へ移植するために、膵島を手作業で回収（ハンドピック）します。この手順を開始する前に、ATE溶液を修正ハンクス緩衝液で希釈し、使用しているマウス系統（C3H）に合わせて濃度を調整しました。0.8 mg/mLのコラゲナーゼ溶液でより良好に消化されることが分かったため、これを用いて総胆管に注入し、膵臓を拡張させます。本日の処置は、糖尿病センターのPavo codreが行います。彼はマウスを切り開き、腸管を露出させた後、総胆管への注入を行います。マウスの毛を寝かせるためにエタノールでスプレーし、その後、足指へのピンチ刺激によりマウスが適切に安楽死していることを確認します。次に、正中切開を行ってマウスを切り開き、腸と膵臓を露出させます。また、横隔膜を切断し、マウスが確実に安楽死していることを確認します。開始する前に、いくつかの重要な構造について説明します。胃がここにあり、その下に膵臓が十二指腸およびその上部に付着しています。こちらは肝臓で、ここに胆嚢と総胆管が確認できます。次にPavoが行うのは、小腸を単離し、総胆管が小腸に流入する箇所を特定することです。腸管が露出したら、蚊鉤鉗子を用いて総胆管の両側をクランプします。これにより、他のグループが総胆管の上にクランプを配置しようとする手法に比べ、より多くのコラーゲンが膵臓に流入することがわかりました。この手法の方が、酵素を膵臓に導入させるのに適していることがわかりました。これは低侵襲な手順です。腸管を損傷させないように注意してください。クランプを総胆管の両側にそっと配置します。次に胆嚢を探し、胆嚢を露出させた後、それをガイドにして総胆管にコラゲナーゼを注入します。パウエルは、3 mLのコラゲナーゼ溶液が入った5 ccシリンジと30ゲージの針を使用しています。総胆管に進入しながら、コラゲナーゼ溶液でその管を拡張させ、腸の近くに到達するまで総胆管を下ります。下降に伴い、酵素溶液が膵臓に注入されます。膵臓がコラゲナーゼ溶液で膨張したところで、Powell氏は止血鉗子を取り除き、腸から慎重に剥離させてマウスから膵臓を取り出します。彼はそれを胃から取り出します。次に、脾臓をハンドルとして使い、膵臓を持ち上げてから、総胆管でゆっくりと切断します。これで完了です。膵臓を広げ、その後、脾臓を除去します。さらに、腸間膜組織を取り除き、膵臓を2 mMのコラゲナーゼ溶液が入った滅菌済みのガラスバイアルに入れ、

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

膵島は、ランゲルハンス島とも呼ばれ、グルコース調節やその他の重要な生物学的機能のためのホルモンを産生する内分泌細胞のクラスターです。このプロトコルでは、最初にAmpulla of...

コラゲナーゼ灌流による膵島単離:膵島細胞を単離するための酵素的方法

ここでは、2型糖尿病のマウスモデルから膵島を分離するためのプロトコル、Leprdb、および2光子顕微鏡を利用した無傷の膵島からのインスリン分泌を測定するための生細胞アッセイの詳細を紹介します。...

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。...

ハイコンテンツ<em&gt;インビトロ</em&gt;膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム

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新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

この島分離プロトコルは、外分泌組織を消化するコラゲナーゼ注射の新しい経路と、マウスから島を精製するための簡略化された勾配手順を説明した。これは、酵素消化、勾配分離/精製、およびアイレット手摘みを含みます。分離に成功すると、マウスあたり250~350の高品質で完全に機能する島が生じます。...

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

ここで潜在的な糖尿病誘発異物化学物質を識別するために、化学物質によって ROS の帰納法をスクリーニングするためのマウスの膵島細胞を分離するためのプロトコルを提案する.

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

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マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。...

マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

学ぶマウス膵島単離法。C3Hマウスの膵臓にコラゲナーゼを注入し、Ficoll密度勾配で精製してNODマウスに移植可能な膵島を調製する手法を解説。糖尿病治療研究に活用可能です。

マウス膵島単離

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