マウス膵島単離

こんにちは、グレッグ・ゾットです。私はUCSF糖尿病センターのブルーストーン研究所に所属しており、今日はマウスアイレットを分離するプロセスを紹介します。この手順では、C3 Hドナーマウスの膵臓にコラゲナーゼ溶液を注入し、その膵臓を切除して消化し、アイレットをフィアルグラデーションで精製した後、最終的にレシピエントである糖尿病性NODマウスの腎臓カプセルに移植するためにそれらを厳選します。

この手順を開始する前に、ATE溶液を改変されたハンクスバッファーで希釈し、マウスの系統に固有の濃度を調整しましたC3 H.Weは、0.8 mgs per milのコラゲナーゼ溶液で消化が優れていることを発見しました。実行。今日の手続きは、糖尿病センターのパボコドレになります。彼は注射し、マウスを開き、腸を露出させてから、総胆管に注射します。

エタノールをマウスにスプレーして毛を抑え、その後、つま先をつまんでマウスが適切に犠牲になったことを確認します。Pavoはマウスを開き、正中線切開で腸と膵臓を露出させます。また、マウスが犠牲になることを確認するために、横隔膜もカットされます。

始める前に、重要な構造のいくつかを指摘したいと思います。胃はここに横たわっており、膵臓は十二指腸の下と上に付着しています。これは肝臓で、胆嚢と総胆管があり、ここで見ることができます。

そこでパヴォが次に行うことは、小腸を分離し、総胆管が小腸に入る場所を見つけることです。腸が露出したら、蚊のクランプで総胆管の両側をクランプします。これにより、より多くのコラーゲンが膵臓に入ることができ、他のグループはクランプを総胆管の上に向けようとすることがわかりました。

これは、酵素が膵臓に入るのを可能にするためのより良い技術であることがわかりました。これは穏やかな手順です。腸を引き裂きたくない。

クランプが総胆管の両側に穏やかに横たわるようにする必要があります。次に、胆嚢を見つけ、胆嚢が露出したら、それをガイドとしてコラゲナーゼを総胆管に注入します。パウエルは、30ゲージの針と3ミルのコラゲナーゼ溶液を含む5ccの注射器を使用しています。

総胆管に入るとき、彼はコラゲナーゼ溶液でその管を膨張させ、次に総胆管を下って腸の近くに到達します。そして、彼が下がると、酵素溶液が注入されて膵臓に注入されます。膵臓をコラゲナーゼ溶液で膨らませたので、パウエルは止血剤を取り除き、マウスから膵臓を取り出して腸から慎重に引き離します。

彼はそれを胃から取り除きます。さて、それから脾臓をハンドルとして使って、彼は膵臓を持ち上げ、それを総胆管でゆっくりと切り取ります、それで終わりです。膵臓を広げ、次に脾臓を切除し、そこで腸中膜組織を切除し、次に膵臓を2ミルのコラゲナーゼ溶液と滅菌ガラスバイアルに入れ、氷の上に戻します。

ガラスバイアルに入れた分離された膵臓は、37度のウォーターバスに約17分間入れられます。浮かび上がらないように、50ミルの円錐形ラックに入れました。入浴中にタイマーが始まり、消化が始まります。

消化時間が完了したら、バイアルを取り出し、バイアルを振って穏やかに乱します。そして、組織がバラバラになり始めたら、バイアルを氷の上に置きます。滅菌スクリーンは、洗浄バッファーを含む400ミルのビーカーの上に置かれます。

次に、膵臓の消化物をスクリーン上に注意深く注ぎ、洗浄バッファーに注ぎます。デモンストレーションの目的で、フードをオフにし、フードのガラスを持ち上げて、何をしているのかを確認できるようにしました。膵臓の消化物がビーカーに注がれると、バイアルは同じ洗浄バッファーですすがれ、洗浄バッファーはスクリーン上に置かれます。

洗浄バッファーを充填したシリンジをご用意しております。それを使用して、画面を通してティッシュを強制的に洗います。これは、マトリックスに付着していないゆるいアイレットを放出することですが、メンブレンと未消化の組織は画面上に残ります。

そして、ティッシュペーパーの洗浄が終わったら、通常、手順の最後にこれが表示されます。チューブの底にある膵臓組織は、2つの50ミル円錐形に移され、組織を洗浄し、組織を均等に混合してから、各チューブ内のペレット体積が等しくなるように均等に分配されます。ビーカーは、より多くの洗浄バッファーですすいでいます。

側面はすすぎているので、ビーカーに再び入ったすべての組織が得られます。次に、2つごとに均等に分配され、どちらも50ミルになります。次に、コニカルにウォッシュバッファーをトッピングします。

組織を数回反転させた後、遠心分離機に入れます。これはクイックスピンです。遠心分離機は1000RPMに達することを許可され、その後オフになります。

このときの組織は非常にSで、アイレットは非常に敏感で、過度に圧縮することは望ましくありません。チューブを取り外し、この洗浄ステップをさらに3回行います。これで3回目の洗濯は終了です。

50ミルのコニカルチューブの成分は、15コニカルチューブに移され、1000RP Mの遠心分離機にかけられ、その後停止します。スーパーナットが削除され、FI コールの最初の部分が開始されます。私たちは、ペレット化された膵臓を消化する段階にいます。

その組織を再懸濁して、ペレットに緩くします。最初の密度グラデーション (1 1 0 8) を追加します。各チューブに5ミルを追加します。

次に、ペレットを各勾配で完全に混合します。最も重い勾配で組織分布を良好にすることが重要です。次に、密度1 0 9 6の2ミルを重ねます。

次に、その上に1 0 6 9密度の2ミルを重ね、その上に1 0 3 7密度を重ねます。密度を重ねる際には、混ぜないことが重要です。次に、すべてのレイヤーがチューブに追加されました。

そして、これが 1 1 0 8 の上部、9 1 0 9 6 の上部、1 0 6 9 の上部、および 1 0 3 7 の上部であることがわかります。そして、組織はすでに中心融合がなくても適切な密度に移動し始めていることがわかります。フィアルグラディエントは1800RPMで15分間速度を上げ、チューブを遠心分離機から取り外した後はブレーキをオフに保つことを忘れないでください。

0 0 9 6 と 0 0 7 の層の間には、パブロのアイレット組織の素敵な帯があることがわかります。次に、0 3 7層を取り外して、処理中に放出された可能性のある組織の破片とDNAを取り除きます。滅菌プラスチック製の牧草地ピペットを使用して、彼は今、膵島の層を取り除き、25ミルの洗浄バッファーを含む50ミルの円錐形に移します。

この手順は、folがアイレットに対して有毒であるため、迅速に行う必要があります。実際には、0 6 9 と 0 9 6 のレイヤー全体を削除しました。Pavoはプラスチック製の牧草地ピペットの上部を切断し、ウォッシュバッファーですすいでください。

その後、アイレットは、以前に遠心分離したのと同じように遠心分離されます。遠心分離機は千回転まで上げられ、その後、それを停止して吸引します。上澄みアイレットは、洗浄剤で3回洗浄します。

そこで、3回目の洗浄後、洗浄バッファーによる3回目の洗浄後、消化物からfolグラジエント、精製アイレットまでのまぶたの分離プロセスを完了し、アイレットをRPMI培地に再懸濁し、組織培養プレートで再生しました。これらのアイレットは、in vitroアッセイやアイレット移植などのin vivo調製の準備が整いました。