Name: マウス膵島単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: 学ぶマウス膵島単離法。C3Hマウスの膵臓にコラゲナーゼを注入し、Ficoll密度勾配で精製してNODマウスに移植可能な膵島を調製する手法を解説。糖尿病治療研究に活用可能です。

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コラゲナーゼ準備<ol><li>下の表に示すように、最終濃度を、作るために50 mlコニカル及び追加の絶縁バッファにコラゲナーゼを秤量。ボルテックスによりコラゲナーゼを溶かす。 （12匹+ 2余分なマウス= 14マウス× 5 0.2ml /マウス= 70ミリリットルトータルコラゲナーゼ溶液） （70ミリリットル× 0.5 mg / mlまたはコラゲナーゼPの合計の0.3 mg / mlの= 35 mgまたは21 mg）を <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">ひずみ</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">年齢</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">コラゲナーゼP（mg / ml）を</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">時間（分） </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H、BALB / C、B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H、BALB / C、B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD、NOR、NON </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD、NOR、NON </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12週間</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li>氷の上でそれぞれのガラスバイアルと所定の位置にコラゲナーゼ溶液2 mlを分注する。コラゲナーゼを追加30gの針と氷の場所（フードで準備）3mlで各5mlシリンジをロードする。 </li></ol>膨張<ol><li>ちょうど解剖前に、頚椎脱臼により動物を生け贄に捧げる。それは完全に濡れており、ETOHの70％で全身にスプレーしてください。陰部から始まるV - insisionを行います。尾があなたから離れて向くようにマウスを回転させる。 </li><li>オープンマウスの左側の腸を削除します。これは、膵臓と総胆管を公開します。 </li><li>胆管が腸を入力するコラゲナーゼ溶液のための小さなポケットを残し、排水溝小腸のいずれかの側の止血クランプを、置きます。 </li><li>胆嚢から始まる、冷たいコラゲナーゼ溶液3 mlを入れた30グラムの針と5mlシリンジと胆管を介して膵臓を膨らませる。 </li><li>体から膵臓を削除し、コラゲナーゼ溶液2 mlを含むシリコン処理バイアルに入れてください。このステップは、脂肪と結合組織のコレクションを最小限に抑え、 迅速かつとしてきれいに可能な限り実行する必要があります。 </li><li>次のマウスを使って氷を繰り返し、手順3でバイアルを置きます。 </li></ol>消化<ol><li>各バイアルを密封し、37℃の水浴中に入れてください。 13〜17分（時間は、動物の系統と年齢によって異なります）インキュベートする。 </li><li>時間が経過した後、精力的にバイアルを振る。膵臓はバラバラになるはず。 </li><li>無菌1000 mlのビーカーに大規模な滅菌シンクストレーナーを通してそれぞれのダイジェストを注ぐと強制的に洗浄バッファーに画面をオフにピペット。 50ミリリットルconicals管（：N = 12は、最終容量を200 mlを加えると4x50 mlチューブに分注するために十分な洗浄バッファーを使用する場合は3 pancreata/50 mlのチューブ）にダイジェストを分注する。希釈が不要な膵島の消化を防ぐために迅速かつ氷上で行われる必要があります。 </li><li>スピンダウン：遠心分離機を開始します。それが1300回転に達すると、それをオフにしてください。 </li><li> 〜5 mLを残し、上清を吸引除去する。ペレットを吸引しないように非常に慎重である。 </li><li>あなたの手で激しくタップしてペレットを再懸濁しますが、その後、洗浄緩衝液50 mlを加える。 </li><li>スピンダウン：遠心分離機を開始します。それが1300回転に達すると、それをオフにしてください。 </li><li>ペレットを再懸濁し、洗浄バッファー5 mlで洗浄する。 </li><li> 15 mlコニカルに5 mlを転送し、上記のように、スピンダウン。 </li><li>できる限り完全に上清を吸引除去する。 （残りのバッファは、フィコール密度の変化を引き起こす可能性があります。） </li></ol>フィコール すぐに実行します。長期的フィコール曝露は小島に対して毒性が強い。 <ol><li>ペレットが完全に前に追加フィコール（切れ目のない組織は、フィコールで再懸濁することが困難である）に分割されていることを確認します。 </li><li>精力的にボルテックスでフィコール、密度1.108、7mlにペレットを再懸濁する。 </li><li>その後、1.096、1.069、1.037：この順序で残りの密度のそれぞれのフィコール2ミリリットルの各密度の上の層。 </li><li> OFF破ると 、4℃で1800rpmで15分間スピン！ </li><li> spoid（無菌pを使用して2番目の層からの膵島を選ぶラスチックスポイト）。冷緩衝液の50 mlコニカル含む〜25 mLにすべてのコレクションを転送する。 </li><li>洗浄バッファー（ステップ12から15を繰り返す）と、上記のように、3回洗浄する。 </li><li>再懸は20ミリリットルRPMI - 1640でレッツ（10％FCSおよびペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、HEPES、MEM - NEAA）、穏やかに混合する。カウントのためのサンプル100 ulを削除します。 </li><li>メディアと1 mlのジチゾン1 mlを含む、35 mmのグリッドプレートに100 ulを転送する。 </li><li>メディア/プレートを30mlの合計160 mmプレートで、37℃、7％CO 2インキュベータ内で、RPMI 1640に残っている島をインキュベートする。 <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="図1" width="220" height="194" /></li></ol>

マウス膵島単離

Murine Pancreatic Islet Isolation

こんにちは、Greg Zottです。私はUCSF糖尿病センターのBluestoneラボに所属しています。本日は、マウス膵島を単離するプロセスをご紹介します。この手順では、ドナーとなるC3 Hマウスの膵臓にコラゲナーゼ溶液を注入し、その後、膵臓を摘出して消化し、密度勾配遠心法で膵島を精製します。そして、受容体となる糖尿病NODマウスの腎被膜へ移植するために、膵島を手作業で回収（ハンドピック）します。この手順を開始する前に、ATE溶液を修正ハンクス緩衝液で希釈し、使用しているマウス系統（C3H）に合わせて濃度を調整しました。0.8 mg/mLのコラゲナーゼ溶液でより良好に消化されることが分かったため、これを用いて総胆管に注入し、膵臓を拡張させます。本日の処置は、糖尿病センターのPavo codreが行います。彼はマウスを切り開き、腸管を露出させた後、総胆管への注入を行います。マウスの毛を寝かせるためにエタノールでスプレーし、その後、足指へのピンチ刺激によりマウスが適切に安楽死していることを確認します。次に、正中切開を行ってマウスを切り開き、腸と膵臓を露出させます。また、横隔膜を切断し、マウスが確実に安楽死していることを確認します。開始する前に、いくつかの重要な構造について説明します。胃がここにあり、その下に膵臓が十二指腸およびその上部に付着しています。こちらは肝臓で、ここに胆嚢と総胆管が確認できます。次にPavoが行うのは、小腸を単離し、総胆管が小腸に流入する箇所を特定することです。腸管が露出したら、蚊鉤鉗子を用いて総胆管の両側をクランプします。これにより、他のグループが総胆管の上にクランプを配置しようとする手法に比べ、より多くのコラーゲンが膵臓に流入することがわかりました。この手法の方が、酵素を膵臓に導入させるのに適していることがわかりました。これは低侵襲な手順です。腸管を損傷させないように注意してください。クランプを総胆管の両側にそっと配置します。次に胆嚢を探し、胆嚢を露出させた後、それをガイドにして総胆管にコラゲナーゼを注入します。パウエルは、3 mLのコラゲナーゼ溶液が入った5 ccシリンジと30ゲージの針を使用しています。総胆管に進入しながら、コラゲナーゼ溶液でその管を拡張させ、腸の近くに到達するまで総胆管を下ります。下降に伴い、酵素溶液が膵臓に注入されます。膵臓がコラゲナーゼ溶液で膨張したところで、Powell氏は止血鉗子を取り除き、腸から慎重に剥離させてマウスから膵臓を取り出します。彼はそれを胃から取り出します。次に、脾臓をハンドルとして使い、膵臓を持ち上げてから、総胆管でゆっくりと切断します。これで完了です。膵臓を広げ、その後、脾臓を除去します。さらに、腸間膜組織を取り除き、膵臓を2 mMのコラゲナーゼ溶液が入った滅菌済みのガラスバイアルに入れ、再び氷上に置きます。ガラスバイアルに入れた単離膵臓を、37°Cのウォーターバスに約17分間浸します。浮き上がらないように、50 mLコニカルチューブ用ラックに配置しました。ウォーターバスに浸すと同時にタイマーを開始し、消化工程に入ります。消化時間が経過したら、バイアルを取り出し、軽く振って破砕します。組織が崩れ始めたら、バイアルを氷上に置きます。洗浄バッファーを入れた400 mLビーカーの上に、滅菌スクリーンを設置します。次に、膵臓消化物をスクリーン越しに洗浄バッファーへと慎重に注ぎ入れます。デモンストレーションのため、フードの電源を切り、作業内容が見えるようにフードのガラスを上げています。膵臓消化物をビーカーに注ぎ終えたら、バイアルを同じ洗浄バッファーですすぎ、その洗浄バッファーをスクリーン上に配置します。洗浄バッファーを満たしたシリンジを用意します。これを用いて、組織をスクリーン越しに強力に洗浄します。この操作の目的は、マトリックスに結合していない緩いアイレットを分離させ、一方で膜組織と未消化の組織をスクリーン上に残すことです。組織の洗浄が終わると、通常、手順の最後にこのような状態になります。チューブの底にある膵臓組織を2本の50 mLコニカルチューブに移し、組織を洗浄して均一に混ぜ合わせた後、各チューブのペレットの体積が等しくなるように均等に分配します。その後、ビーカーをさらに洗浄バッファーで洗浄します。ビーカーの壁面をすすぎ、中に入った組織をすべて回収します。その後、2本の50 mLコニカルチューブに均等に分配し、洗浄バッファーを加えて満たします。組織を数回転倒混和し、遠心分離機に入れます。これは短時間の遠心操作です。遠心分離機を1,000 RPMまで加速させ、その後停止させます。この時点での組織は非常に繊細であるため、過剰に圧縮しないように注意してください。チューブを取り出し、この洗浄工程をさらに3回繰り返します。これで3回目の洗浄が終了します。50 mLコニカルチューブ内の成分を15 mLコニカルチューブに移し、1,000 rpmで遠心分離した後、停止させます。上清を除去し、FI Callの最初のステップを開始します。これで、ペレット化した膵臓ダイジェストが得られた段階になります。組織を再懸濁し、ペレットが十分に分散するようにします。最初の密度勾配液である1 1 0 8を添加します。各チューブに5 mLずつ加えます。次に、ペレットを各勾配溶液で十分に混合します。最も密度の高い勾配溶液において、組織が良好に分散していることが重要です。ここで、1.096密度の溶液を2 mL重ねます。その後、その上に1069密度の溶液を2ミル重ね、さらにその上に1037密度の溶液を重ねます。密度層を重ねる際は、混ぜないようにすることが重要です。これで、すべての層がチューブに追加されました。こちらが1108、91096、1069、および1037の上層であることがわかります。遠心分離を行わなくても、組織がすでに適切な密度に移行し始めていることが見て取れます。Fialグラジエントを1800 RPMで15分間回転させて加速させます。チューブを遠心分離機から取り出した後、ブレーキをオフにしたままにするようにしてください。0 0 9 6層と0 0 7層の間に、良好なアイレット組織のバンドが確認できます。次に、処理中に放出された可能性のある組織片やDNAを除去するため、0 3 7層を取り除きます。滅菌プラスチックパステールピペットを用いて、アイレット層を回収し、25 mLの洗浄バッファーが入った50 mLコニカルチューブに移します。folはアイレットに対して毒性があるため、このステップは迅速に行う必要があります。実際には、0 6 9および0 9 6層全体を除去しました。パヴォがプラスチック製パステアピペットの上部をカットし、洗浄バッファーで洗浄します。その後、アイレットを前と同様に遠心分離します。遠心分離機を1,000 RPMまで上げ、停止させてから上澄み液を吸引します。アイレットを洗浄液で3回洗浄します。これで、アイレット（膵島）の単離プロセスが完了しました。消化から密度勾配遠心分離を経て、3回目の洗浄バッファーによる洗浄後、精製されたアイレットを得ました。これらのアイレットをRPMI培地で再懸濁し、組織培養プレートに播種しました。これにより、アイレットはin vitroアッセイや、アイレット移植などのin vivo準備に使用可能な状態になりました。

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