細胞間相互作用を操作するためのシリコンマイクロチップ

こんにちは、私はエリオット・フーです。私はここマサチューセッツ工科大学のティアの研究室の博士研究員です。今日は、シリコンマイクロメカニカルチップ上で細胞培養を調製します。このデバイスは、一緒にロックされる小さな櫛のように見え、2つの異なる細胞集団間の相互作用を正確に操作することができます。

今日は、肝臓の肝細胞と支持間質細胞との相互作用について研究します。具体的には、コームの上面で3つのT-3線維芽細胞を培養するため、コームフィンガーを移動させることで、細胞を動かしたり、細胞の空間配置を変更したりできます。各デバイスは2つの部分に分かれており、2つの可能な構成でスナップします。

1つ目は、2つの細胞集団を互いに接触させる方法です。2つ目は、細胞が触れないように2つの集団をわずかに分離します。ここでは、コンタクトのインタラクションは防止されますが、分泌されたファクターを介したインタラクションは保持されます。

ピンセットでのパーツの取り扱いについて話すことから始めましょう。私は、大きなテフロンピンセットと小さな丸い先端の金属ピンセットの両方を使用するのが好きです。大きなピンセットでは、このように端の部分を拾うことができますが、アームは非常に壊れやすいため、アームを壊さないように注意する必要があります。

だから、このようにパーツの後ろでそれらを拾い上げたいです。金属製のピンセットを使用すると、穴に手を伸ばしてチップを直接拾うことができます。大きいパーツは12ウェルプレートの壁に収まりますが、小さいパーツは24ウェルプレートに収まるか、大きいパーツと組み合わせることができます。

12ウェルプレートでは、通常、金属製のピンセットを使用します。プレート内のパーツを扱って2つのパーツをスナップするときは、通常、大きい方のパーツを最初にウェルに入れ、片側まで押します。次に、無料の修理品を井戸の反対側に置き、2本のピンセットを各穴に1つずつ入れて、それらを一緒に押し込みました。

これで、ギャップ構成または接触構成のいずれかでパーツを一緒にロックできます。パーツを分解したい場合は、パーツをギャップ構成に引っ張ってから、垂直に引き上げてパーツを取り外すのが好きです。現在、デバイスはシリコン製であるため、適切な細胞接着を可能にするためにコーティングする必要があります。

おそらく、ポリスチレンでコーティングされ、プラズマ処理されたデバイスを受け取ることになるでしょうので、それが出発点であると仮定します。まず、コラーゲンを使って肝細胞が付着する表面をコーティングします。肝細胞の櫛を50マイクログラム/ミルのコラーゲン(1つの溶液)に入れ、37°Cで45分間インキュベートします。

一方、線維芽細胞の櫛は、コーティングする必要はありません。インキュベーション後、コラーゲン溶液を吸引し、洗浄して水をまきます。次に、ESを補完部品と接触させてロックし、セルシーディング用の平らな面を形成します。

まず、いくつかの井戸に70%エタノールを充填します。各ウェルにペアを入れて、一緒にロックします。一緒にロックした後、顕微鏡で部品を見て、同一平面上にあることを確認します。

時々、パーツがずれて一緒にロックされることがあります。そして、顕微鏡では、それらが2つの異なる焦点面にあることがわかります。この場合、パーツを分離して押し戻すだけで、位置合わせに問題がないことを確認した後、パーツをエタノールにしばらく置いて滅菌します。

ことが多いので、10分だけ浸かるだけです。滅菌後、洗い流す必要があります。エタノールを徹底的に吸引して水で洗浄し、次に再び吸引して水で洗浄し、最後に水を吸引して培養培地と交換します。

次に、デバイスに細胞をシードしましょう。典型的には、我々は500, 000細胞/ミリリットルの濃度で細胞を懸濁し、我々は12ウェルプレートを使用して各コームペアに1ミリリットルの懸濁液をピペットで移します。そこで、2つのウェルに1ミリリットルあたり500,000個の細胞で線維芽細胞を播種しました。

同様に、井戸ごとに500,000個の肝細胞を懸濁液として取り、他の2つの井戸に播種しました。さて、インキュベートする前に、細胞を徹底的に振って、細胞が均一に分布していることを確認します。そして、私は縦に3回、横に3回振って、これを3回繰り返すのが好きです。

振とうした後、インキュベーターに入れ、細胞を15分間放置し、その後、再び細胞を振盪します。15分ごとに1時間振とうした後、細胞懸濁液を吸引し、新しい細胞懸濁液で遊んでみます。そして、細胞のコンフルエントな層ができるまで、これを繰り返します。

通常、線維芽細胞の場合、1つまたは2つの座席が必要です。また、肝細胞の場合は、2〜4席かかることがあります。コンフルエント単層を得るためには、細胞をかなり高密度で座らせ、振とうし、細胞が均等に分布することを確実にする。

最初の着座後、細胞のまばらな層が形成される。細胞は、ポリスチレンとコラーゲンでコーティングされた指にのみ付着することに注意してください。新鮮な細胞を播種し、さらに1時間インキュベートした後、再び15分ごとに振とうすると、細胞層は密度が高くなります。

3回目の播種後、細胞密度が良好になり、細胞が櫛に播種された後に停止できるようになりました。細胞を目的の実験構成に操作したいと考えています。現在、デバイスは補完的な部分から分離され、24時間インキュベートされています。

24時間後、細胞は広がり、コームの表面上に合流性単層を形成します。今、私たちは共文化を形成したいと考えています。肝細胞コームと線維芽細胞コームは、同じウェルに移され、目的の初期構成に一緒にロックされます。

必要に応じて。一定時間が経過すると、構成を変更できます。たとえば、18時間後にギャップ構成に移行し、部品を同じ場所に配置し、ギャップ構成に達するまでしっかりと押し合わせてから、ギャップ構成に接触するように押し戻すことができます。

そして今、私たちは1つの櫛を取り除きます。これからやろうとしていることは、ポリスチレンの古いコーティングを剥がし、チップを洗浄し、新しいポリスチレンコーティングを施して細胞培養の準備をするプロセスを行うことです。繰り返しになりますが、古いポリスチレンコーティングを剥がし、新しいコートを塗ることで、以前の実験の歴史が新しい実験を妨げないようにします。

ですから、実験が終わったら、まず最初にしたいことは、細胞を漂白し、次に櫛と水を洗い流すことです。したがって、チップをつま先に入れる前に、チップが完全に乾いていることを確認する必要があります。そこで、ここには、しばらく自然乾燥させておいて、完全に乾いていることを確認したばかりの櫛がいくつかあります。

それでは、このガラススピーカーにつま先をつま先で入れます。ここではガラスピペットを使用して、溶かさないようにします。ハロウィンはプラスチックを溶かすので、一般的なポリスチレンピペットは使えません。

さて、それで十分です。そして今、これらの部品をいくつか取り、つま先に入れ、シェーカーをオンにして攪拌し、トルエンが蒸発しないようにアルミホイルで覆います。したがって、2時間後、トルエンは櫛のポリスチレンのほとんどを溶かしているはずであり、それらを引き出して櫛を風乾することができます。

ハロウィーンのすすぎ後、部品はポリスチレンが比較的少なく、比較的きれいであるべきです。ただし、ポリスチレンの新しい層が極端にきれいでない場合でも良好な接着性を形成するために、部品は非常にきれいである必要があります。ポリタイは、細胞が引っ張り始めると、実験の途中で剥がれる傾向があります。

そこで、これからやろうとしているのは、ピラニア酸のクリーンです。部品をガラススピーカーに入れたので、これを加熱します。そこで、ホットプレートを載せます。

そして、ここには硫酸と過酸化水素があります。最初に硫酸を注ぎ、ここでは、すべてのチップが液体の下に浸されていることを確認します。時々、彼らは浮く傾向があります。

また、腐食性の高い化学物質を扱っているため、適切な防護服を着用していることを確認してください。ここは。ニトリル手袋をはめています。次に、過酸化水素を酸に注ぎますが、これは発熱反応であるため、ここでは注意してください。

ですから、反応すると少し煙が出ているのがわかりますが、システムにエネルギーを追加して、さらに反応性を高めたいと考えています。では、120°Cまで加熱し、10°Cで加熱しますので、細胞培養の残り物がチップから完全に除去されるので安心してください。したがって、この時点では、過酸化水素がすべて消費されるまで、反応が完全に進行するのを待つ必要があります。

そして、その時点で、混合物の泡立ちは止まります。したがって、反応が進行するのに約30分かかります。そして、泡が見えなくなったら、ホットプレートをオフにして冷ますことができます。

そして、それらをBAKカーブ水に移します。そして、ここで金属ではなくテフロンピンセットを使用していることを確認し、それらを拾って移し替えることができます。だから今、私たちはちょうどDDH 2 O.Iの安定した流れの下でそれをすすぐつもりです、私は通常、マイネから直接それを取り、我々はここで少なくとも10分間実行したままにします。

そして、そうすることで、水の流れの下で10分間ミンチした後、酸の痕跡をすべて洗い流すことになります。酸はチップから再度取り除かれるべきであり、我々はポリスチレン45、000分子量ポリスチレンをコーティングする準備ができるまで、我々はちょうどシグマから得た分子量ポリスチレンを水中に保管するつもりです。そして、ここでは少量の重量を量ります。

400ミリグラムがあり、それをトルエンに1ミリグラム/ミリリットルで溶解します。そのため、トルエンはボンネットで取り扱う必要があります。そしてもう一つは、ポリスチレンを溶かすためにトルエンを使用するので、ポリスチレンから作られた実験服を使わないように

ここでは、ポリプロピレン、コニカル、ガラスピペットを使用しています。だから、私はポリスチレンの400ミリグラムを持っているので、私はトーイングの4ミリリットルを入れるつもりです、そして今、私たちはポリスチリンが溶解するまで30分間それを渦巻くつもりです。では、チューブを最低速度で約20分から30分ほど渦巻くだけです。

そこで、チューブをボルテックスに取り付けます。ずっとそこに置いている必要はありません。20〜30分後、ポリスチレンが溶解し、コーティングする準備が整います。

次に、施設でポリスチレンをスピンコートします。当社のスピンコーダーはクリーンルーム施設にあります。そのため、ここではキャップゴーグル、ガウン、ブーツ、手袋を着用する必要がありますが、それはあなたの施設では同じではないかもしれません。

このチャックを使用する前に、ポリスチレンから保護したいと思います。そこで、アルミホイルで覆い、チップが表面と同じ高さに収まるように、これをできるだけ表面に対して平らにしたいと思います。チップを真空に保つことができるように、中央に小さな穴を開けます。

スピンコーダーは2、400 RPM、30秒に設定されています。これで、チップの1つを取り出して、チップの中央が穴を覆うように置き、ポリスチレンを装着するときに最初にバキュームをオフにし、バキュームをオンにしてからスピンを開始します。したがって、小さな部品の場合、10滴未満を置くことができます。

また、大きな部品の場合は、ポリスチレンを10滴以上必要とします。そして、2、400RPMで30秒間回転させます。次に、ポリスチレンコーティングされたチップを取り、120°Cのオーブンに入れます。

そのため、表面をリフローして少し滑らかにし、プラスチックを緻密化して硬化させます。だから通常、私はそれをオーブンで一晩置いておきます。プロセスが完了するまでに、おそらく少なくとも数時間かかります。

そのため、一晩でベーキングした後、チップはプラズマ処理の準備が整います。次に、ポリスチレンを酸素プラズマにさらすと、表面エネルギーが変化し、タンパク質や細胞がポリスチレンに付着しやすくなります。そこで、チップをプラズマチャンバーにロードし、真空にポンプダウンします。

使用するのに適した設定は、200ミル、真空のツアー、酸素ガスの流れの下で1分間の200ワットの電力です。システムがポンプダウンされたので、酸素を導入します。さて、これでRF電源をオンにし、プラズマを1分間打つことができます。

ですから、プラズマが動いているとき、実際には光っています。蛍光灯のような感じです。プラズマへの曝露が1分間続いた後、圧力を大気中に戻し、部品を抜き出すことができます。

これで、パーツはタンパク質コーティングと細胞供給の準備が整いました。このデバイスを設計した目標は、組織のマイクロアーキテクチャをダイナミックに操作できるようにすることでした。したがって、体内の組織の微小な組織化、特に細胞が互いにどこに配置されているかは、実験室培養における各特定の細胞の機能を決定する上で非常に重要です。

最近まで、私たちはそれを再現する上で良い仕事をすることができませんでしたが、過去5年または10年で、人々は組織培養基板上に細胞をマイクロパターン化できるようになり始め、それによって細胞を組織培養プレートの目的の場所に正確に置くことができるようになりました。そして、そうすることで、ミクロスケールでの細胞細胞相互作用の基礎生物学のいくつかの重要な側面を発見することができました。さて、これまでできていなかったのは、それをダイナミックに行うことです。

それは、実験の途中で細胞培養の組織を変えることです。これは重要なことで、体内では組織が実際には静的な環境ではないからです。私たちは、特に創傷治癒や創傷発生において、動き回って再編成する細胞を持っています。

しかし、恒常性にある正常な器官でさえ、たくさんのものが動き回っています。学ぶのが最も難しい技術的側面は、部品を物理的にどのように食べるかです。そして、最初にシステムで作業を開始すると、パーツの壊れやすさや、作成する必要がある感情がどれほど小さいかに脅かされるかもしれません。

でも、少しだけ練習すれば、それほど苦労することはないと思います。このデバイスが役割を果たしていると思われる場所のいくつか、たとえば、胚発生では、細胞がさまざまな胚層を通って出芽するにつれて、細胞は一連の異なる細胞環境と接触します。そして、各層が順番に接触するときの相互作用は、私たち全員を特定の分化経路に沿ってさらに押し進めることが知られています。

ですから、このタイプのデバイスは、実験室でそのタイプのイベントを再現しようとするのに適しているのではないかと考えています。私たちが特に注目したかったマイクロオーガナイゼーションの側面の1つは、細胞膜が互いに接触できる接触相互作用を通じて通信する細胞と、周囲の培地に分泌され、少し離れた細胞に拡散する可溶性因子との違いでした。そして、多くの場合、細胞が共培養され、互いに影響を及ぼし合っていますが、それが接触相互作用なのか、分泌因子なのかは明らかではありません。