三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

この手順の全体的な目標は、メラノサイト、メラノーマ、皮膚幹細胞生物学の研究のために、3Dヒト皮膚再構築物を生成することです。これは、まず組織培養トレイのインサートを中和されたウシコラーゲンでコーティングすることによって達成されます。2番目のステップは、線維芽細胞とコラーゲンから細胞の真皮コンパートメントを作ることです。

次に、メラノサイトまたはメラノーマ細胞と混合されたケラチノサイトから表皮コンパートメントを作成します。手順の最後のステップは、18日目に皮膚再建を採取し、マウスに皮膚再建を移植することです。最終的に、移植片の免疫組織化学的および免疫蛍光学的分析により、メラノサイトを含む正常な皮膚の構造、正常な幹細胞の遊走と分化、および病期特異的な黒色腫の表現型が示されています。

私たちが皮膚再建モデルを開発しの理由は、研究の早い段階で、皿の上で培養された正常なメラノサイトまたはメラノーマ細胞が、組織環境にある細胞とは大きく異なる振る舞いをすることを発見したからです。したがって、皮膚再構築モデルは、細胞が皮膚の1つのコンパートメントから他の場所にどのように移動するかを見るのに理想的です。以前に調製した無細胞層コラーゲン混合物を氷上にし、次に6の各インサートに麦わら色の溶液の1ミリリットルを追加します。

ウェル組織培養トレイを室温で30分間インキュベートし、ゲルを固化させます。この間、ゲルがトリプシンの目、5分後に0.25%tripsin EDTAと彼らの培養フラスコからの人間のfiberblastを固化している間、溶液は黄色からピンクに色が変わるはずです。10%FBSを含むDMEMを追加して、化プロセスを中和します。

分離した細胞を室温で200Gで5分間遠心分離して回収し、その後、1.5mlあたり5番目の細胞まで10の4.5倍で細胞を再懸濁します。DMEMに10%FBSを添加。次に、50ミリリットルのチューブに、あらかじめ調製した細胞層コラーゲン混合物を入れ、チューブを氷の上に置きます。

1.5ミリリットルの線維芽細胞懸濁液をチューブに加え、よく混ぜます。3ミリリットルの麦わら色の細胞層溶液を各無細胞層コーティングインサートに加えます。次に、インキュベーション期間中に、組織培養トレイを摂氏37度で45分間、5%二酸化炭素組織培養インキュベーターでインキュベートします。

細胞層溶液の色も黄色からピンクに変わるはずです。最上層ゲルが固まったら、組織培養トレーのインサート内側に10%FBS含有のDMEMを2ミリリットル、インサートの外側に10ミリリットルを添加します。組織培養トレイを4日間インキュベートします。

インキュベーションの4日目にゲルが収縮することを確認し、各インサートの内側と外側の両方から培地を吸引します。インサートの内側に2ミリリットル、外側に10ミリリットルのウォッシュメディウムを加えて、通常の美容液を洗い流します。次に、トレイを摂氏37度で1時間インキュベートして表皮を生成します。

まず、トリプシンはヒトのケラチノサイトです。次に、5分後、大豆トリプシン阻害剤を使用して、分離した細胞を200Gで5分間スピンダウンした後、トリプシンを中和します。Reusは、細胞ペレットを皮膚に1ミリリットルあたり6細胞の4.17倍10で懸濁します。

ケラチノサイトを採取した後、培地を1つ再構築します。トリプシンは、ヒトメラノサイトを1〜2分間氷漬けにします。再度、大豆トリプシンinhibitorでトリプシンを中和します。

その後、前回と同じ条件で細胞をスピンダウンした後、メラノサイトペレットを皮膚の10ミリリットルあたり5番目の細胞の8.3倍で再懸濁します。中型のものも再構築します。次に、真皮層調製組織培養トレイの各インサートの内側と外側の両方から洗浄培地を取り出します。

1.5ミリリットルの皮膚を追加して洗浄媒体を交換し、各インサートの内側に1つ、外側に10ミリリットルの培地を再構築します。次に、600マイクロリットルのケラチノサイト細胞懸濁液と600マイクロリットルのメラノサイト懸濁液を混合します。混合細胞懸濁液を200マイクロリットル分注します。

各インサートの内側に一滴ずつ。組織培養トレイを37°Cで2日間インキュベートします。細胞をインキュベートした後、皮膚を吸引し、各インサートの内側と外側の両方から培地1を再構築し、次に2ミリリットルの皮膚を追加し、インサートの内側に2ミリリットル、インサートの外側に10ミリリットルの培地を再構築します。

次に、再構築物を摂氏37度でさらに2日間インキュベートします。2回目の2日間のインキュベーション後、皮膚を吸引し、各インサートの内側と外側から培地2を再構築します。次に、7.5ミリリットルの皮膚を追加し、インサートの外側のみにミディアム3を再構築します。

再構築物をインキュベーターに戻し、皮膚を交換します。18日目まで隔日でミディアム3を再構築します。インキュベーションの18日目に、皮膚再構成物を装填した組織培養トレイのインサートの内側と外側から培地を吸引します。

鉗子でトレイからインサートを取り外します。ポリカーボネートフィルターを含むコンストラクトを、メスの刃で端に近い円をなぞって切り取ります。次に、再構築物をフィルターの硬い表面に置き、ブレードで半分に切ります。

再構築の半分を黒いTBS生検紙に置き、次に紙を組織学カセットに入れます。カセット全体を10%ホルマリンに4時間以上浸します。次に、カセットを70%エタノールに入れ、パラフィン包埋のための再構築を処理する準備ができるまで摂氏4度で保管します。

再構築物の残りの半分を摂氏4度の50%スクロースに1〜2時間置きます。次に、ショ糖を2モルに変更し、摂氏4度でさらに1〜2時間保管します。ベースモールドを最適な切断温度、凍結媒体、またはOCTで半分充填します。

気泡を避けてください。鉗子で再構築物の端をつかみ、ショ糖から再建物を取り除きます。ショ糖が吸収されるまでキムワイプの上に置きます。

鉗子とヘラを使用して、OCTの上部にあるボートに再構築物を移します。繰り返しになりますが、泡を避けます。

砕いたドライアイスの上にボートを均等に置き、OCTが完全に凍結するようにします。次に、ベース型とホイルを包み、クライオスタットで切断する準備ができるまで摂氏マイナス70度で保管します。マウスに皮膚再建物を移植する準備をするには、容器に液体窒素を満たし、50ミリリットルのチューブに5ミリリットルのDMEMを追加します。

ビーカーに600ミリリットルの水道水を入れ、ビーカーをホットプレートの上に置いて温めます。次に、生後約6週間のメスのスキッドヘアレス近親系マウスを選択します。マウスをisofフッ素で麻酔した後。

ノーズコーンを使用して、処置中ずっと麻酔を維持します。滅菌眼科用潤滑剤を塗布し、低体温症を防ぐために熱サポートを提供します。次に、化合物ベンゾインチンキ剤とアルコール調製綿棒でマウスの皮膚をきれいにします。

マウスの背面の上部に線を引いて、後で縫合するために同じ位置を保ちます。虹彩はさみと鉗子を使用してマウスの背中に丸い創傷床を切り取り、次に傷口を滅菌ガーゼスポンジで覆います。丸いマウスの皮をDMEMの50ミリリットルチューブに入れます。

すべての培地と組織が完全に凍結するまで、チューブを液体窒素容器に浸します。次に、チューブをお湯のビーカーで完全に解凍するまで解凍します。これを繰り返し、凍結と解凍の手順を3回行います。

外科用ブレードを使用して、インサートから皮膚再建物を取り外します。メンブレンを非常に慎重に除去し、次に皮膚再建物をマウス創傷床の上部に移します。次に、マウスのスキンをスキン再構築物の上に置きます。

最初の縫合糸が以前にラベル付けされたマーカーの上にあり、2番目の縫合糸が下部にあることを確認してください。次に、皮膚再建の側面にさらに2つの縫合糸を使用して、マウスの皮膚を固定します。移植後にマウスの皮膚をきれいにしてから、マウスを新しいケージに入れます。

18日目。皮膚再建の表皮は、層状のケラチノサイト層で構成されており、未分化基底層と逐次分化層は垂直方向に配向しています。再構成物の切片をメラニン細胞マーカーで染色する。

黒矢印で示されているS 100は、メラノサイトが表皮の基底層に整列し、樹状突起伸長を介して複数のケラチノサイトと通信していることを示しています。真皮コンパートメントには、コラーゲン1型マトリックスに埋め込まれた線維芽細胞が含まれており、コラーゲン4は、表皮と真皮を分離する基底膜を示しています。次の図は、表皮のケラチノサイトの複数の層がどのように発達するかを示しています。

GFPレンチウイルスベクターで標識した真皮幹細胞に線維芽細胞を包埋した場合。コラーゲン1型マトリックスでは、それらは表皮に移動し、5日目にメラノサイトに分化します。ケラチノサイトに播種した後、単一細胞は球体から移動を開始します。

表皮はまだ単一の層で構成されていることに注意してください。8日目のことです。いくつかの細胞が真皮表皮界面に到達します。

10日目までに、GFP陽性細胞は、ここで見られるように、基底膜の位置でしっかりと整列しています。表皮に遊走したGFP陽性細胞は、メラニン細胞マーカーHMB 45を発現します。さまざまな段階の黒色腫細胞株を皮膚再構築物に組み込むと、細胞の挙動はin vivo特性を反映します。

ここでは、2D培養で増殖した正常なメラノサイトとメラノーマ細胞をこの図で見ることができます。正常なメラノサイトの位置と成長速度は、ここに見られるように皮膚再建において厳密に制御されており、放射状成長期、原発性黒色腫は主に表皮で増殖しますが、垂直成長期の黒色腫は、この図に見られるように真皮に浸潤的に成長します。最後に、転移性黒色腫が真皮の奥深くに積極的に侵入する方法をここで見ることができます。

正常な皮膚に関する私たちの研究は、黒色腫の発症と進行に関するより良い知識の基礎を提供します。