CRISPRを介した塩基編集ツール:標的塩基置換を誘導するゲノム編集技術

CRISPRを介したゲノム編集では、塩基エディター酵素をコードするBE遺伝子を統合した一倍体細胞株であるHAP1-BE3培養物から始めます。この培養物に、ヒト乳がん遺伝子BRCA1などの特定の標的用に設計されたCRISPR-Cas9プラスミドを含むレンチウイルスベクターを追加します。

レンチウイルス粒子は宿主細胞膜と融合してプラスミドを放出し、最終的に宿主細胞ゲノムに組み込まれて CRISPR-Cas9-BE 遺伝子セグメントを形成します。これらの遺伝子は、BRCA1を標的とするgRNA、Cas9エンドヌクレアーゼ、およびBE-シチジンデアミナーゼを生成します。

BRCA1を標的とするgRNAは、Cas9と融合し、複合体をBRCA1遺伝子座に誘導するRNAです。この遺伝子の近くには、遺伝子座がプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)であり、BEは安定してドッキングして上流に移動し、活性触媒領域に到達することができます。ここで、BEはシチジン塩基を認識し、それをウリジンに変換します。

この塩基置換変異は、Cas9ヌクレアーゼを誘発して、修飾されていないDNA鎖を切断します。DNA鎖の切断は、欠けている塩基を埋める修復酵素を活性化し、非DNA塩基であるウラシルをチミンに変換します。全体として、これらのプロセスは遺伝子変異を生成します。

次に、生理学的条件下で細胞をインキュベートし、継代培養して遺伝子変異を増殖させます。ゲノムDNAを抽出し、配列決定することで、CRISPRを介した塩基編集効率を解析します。

トランスフェクションの1日前に、24ウェルプレートに5 x 10⁵個のHAP1-BE3細胞を1ウェルに播種し、トランスフェクション用の70%から80%のコンフルエンスに達するように培養します。メーカーのプロトコルに従って、購入したトランスフェクション試薬を使用してBRCA1を標的とするガイドRNAをトランスフェクションします。1マイクログラムのBRCA1標的ガイドRNAを使用して、BRCA1標的部位でCGからTAへの変換を誘導します。次に、細胞を摂氏37度でインキュベートし、3〜4日ごとに継代培養します。トランスフェクションの3、10、および24日後に細胞ペレットを回収し、塩基編集効率を分析します。ゲノムDNA精製キットを使用してゲノムDNAを抽出します。