マウス肝臓からの辺縁性肝白血球の単離

辺縁肝、MH、白血球は、内皮細胞で裏打ちされた特殊な肝血管または正弦波の壁に付着していることがわかります。MH 白血球は、炎症に反応して周囲の組織に動員されます。

MH白血球を採取するには、安楽死させたマウスを仰臥位で行うことから始めます。腹腔と胸腔を切開し、肝臓と心肺複合体を露出させます。

腸を変位させて門脈を露出させ、脾臓、消化管、およびその関連臓器から肝臓に血液を運びます。蠕動ポンプに接続された針を門脈に挿入します。

下大静脈(肝臓から心臓に脱酸素化された血液を運ぶ主要な血管)を解剖して、灌流中に灌流液を収集します。

凝固剤を含む緩衝液を低流量で短時間、門脈を通して肝臓を灌流します。このステップは、下大静脈の流出を介して肝臓の血管から非接着細胞を含む血液を除去するのに役立ちます。この血液で汚染された灌流液を廃棄してください。

次に、より高い流量で灌流します。増加した流量とせん断速度での強制灌流は、MH白血球と血管内層の間の接着を破壊し、MH白血球を正弦波壁から剥離します。

MH白血球やその他の血球を含む灌流液を収集し、新しいチューブに移します。遠心機。MH白血球を含むペレットを再懸濁して、さらなる下流分析を行います。

マウスの辺縁肝白血球を収集するには、呼吸が停止した直後に、滅菌ハサミと歯組織鉗子を使用して、剣状突起まで腹部正中線切開を行います。次に、鉗子を使って胸骨を持ち上げ、横隔膜と胸郭の両側を慎重に切ります。

止血剤を胸骨に固定し、胸郭を吻側に折りたたんで心肺複合体を露出させます。腸を腹腔の外側の動物の左側に移動し、門脈を露出させます。次に、30ゲージの針を蠕動ポンプに接続し、脾静脈の吻側にある門脈に挿入します。

横隔膜の上の下大静脈を切断して、胸腔からの灌流液の排出と収集を可能にします。次に、毎分約3ミリリットルの速度で蠕動ポンプをオンにし、胸腔プールから血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを収集します。3ミリリットルが集まったら、ポンプの電源を切ります。

次に、10 ミリリットルの注射器に接続された 21 ゲージのバタフライ針を挿入した後、胸腔から 10 ミリリットルの灌流液が収集されるまで、毎分最大 4 ミリリットルの速度で灌流を再開します。肝臓が薄茶色に変わったら、灌流を中止します。次に、灌流液を15ミリリットルのチューブに移します。それを遠心分離し、上清を吸引します。