昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系を用いたチクングニアウイルス様粒子の生成

チクングニアウイルス様粒子(VLP)は、脂質二重層内に埋め込まれたウイルスエンベロープタンパク質で構成され、遺伝物質を持たない非感染性構造です。

チクングニア熱VLPを産生するには、チクングニア構造遺伝子カセットを発現する組換えバキュロウイルスでSpodoptera frugiperda Sf9昆虫細胞に感染させます。カセットは、カプシドをコードするチクングニア熱構造遺伝子とエンベロープタンパク質と融合したバキュロウイルスプロモーターで構成されています。

インキュベーション中、バキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質は昆虫細胞の表面受容体に結合します。これにより、バキュロウイルスの細胞質へのウイルスDNAの侵入と放出が促進され、チクングニアキャプシドとエンベロープタンパク質を含むポリタンパク質が生成されます。

合成後、カプシドタンパク質の自己触媒的切断により、小胞体、ERにエンベロープタンパク質を持つ前駆体ポリタンパク質が生成されます。小胞体内腔では、酵素が前駆体ポリタンパク質を切断し、さらなる処理のためにゴルジコンパートメントに入る個々のタンパク質を生成し、タンパク質ヘテロ三量体を形成します。

ゴルジ体常駐プロテアーゼはタンパク質ヘテロ三量体を切断し、E2およびE1タンパク質を持つ成熟エンベロープタンパク質を産生します。これらのエンベロープタンパク質は膜に移動し、VLPに芽生えて培地に放出されます。

感染した培養物をチューブに移し、遠心分離して昆虫細胞をペレット化します。VLP含有上清を吸引し、ろ過して破片を除去します。

チクングニア熱 VLP を含む得られた濾液は、免疫病理学研究の準備が整います。

多点撹拌プレートシステム上で130 rpmで連続的に攪拌することにより、以前に調製したSpodoptera frugiperda、またはSf9細胞をスピナーフラスコに懸濁して培養します。適切な曝気のために、培養量をスピナーフラスコの容量の半分以下に維持してください。次に、スピナーフラスコ中の250ミリリットルのSf9細胞を1ミリリットルあたり2 x 10⁶細胞の密度で、事前に調製した組換えバキュロウイルスで感染させることにより、CHIK VLPを発現し、細胞を摂氏28度のインキュベーターに戻します。

トリパンブルー除外を使用して、細胞生存率が70%から80%に低下したかどうかを判断します。確認したら、培養物を懸濁液から50ミリリットルの円錐形チューブに直接移し、細胞をスピンダウンします。上清を収集し、沈降前に0.22ミクロンの細孔膜でろ過します。