透過型電子顕微鏡を用いたマウス脳切片の超微細構造解析

樹脂ブロックに埋め込まれた四酸化オスミウム固定マウスの脳切片を取ります。

断面画像を取得し、事前に準備されたアトラス画像と位置合わせして、関心領域を特定します。

ブロック上のこの領域の境界をマークします。

樹脂を加熱して柔らかくし、マークされた領域を切除します。

試験片をガラス保持バーに接着し、トリミ

ウルトラミクロトームを使用して、半薄切片と極薄切片を準備します。

半薄切片と超薄切片をそれぞれガラスキャリアとニッケルグリッドに転写します。

核酸、リボソームに富む細胞質、および細胞外マトリックスに結合する色素で半薄切片を染色します。

切片を洗浄し、光学顕微鏡で調べて、標的領域の存在を確認します。

透過型電子顕微鏡で極薄切片を観察します。

四酸化オスミウムは、細胞膜と細胞小器官膜の電子密度を高め、電子密度の低い細胞質に対して高いコントラストを提供し、細胞の超微細構造の視覚化を可能にします。

対象領域をマッピングするには、事前に準備した画像アトラスから対象領域を含む画像を選択します。対象領域の境界線を断面画像にスケッチします。これらの境界を顕微鏡下で埋め込まれた標本に光学的に重ね合わせ、1インチの26ゲージ針を使用して、これらの領域の境界を樹脂標本に引っ掻きます。次に、樹脂を柔らかくするために試料を摂氏95度に加熱します。

次に、オーブンから温かい樹脂標本を取り出し、カミソリの刃を使って関心のある領域を切除します。試料を適切な口径のアクリルガラス保持バーに接着し、取り付けられた試料をトリミングして半薄および超薄型切片化します。ウルトラミクロトームを使用して、半薄型0.7マイクロメートルおよび超薄型70ナノメートルの切片を取得し、半薄型切片をガラスキャリアに、超薄型切片をニッケルグリッドに収集します。

半薄切片をPBS中の1%トルイジンブルーで4分間染色し、その後脱イオン水で数回洗浄してから、光学顕微鏡で切片を調べます。超薄型切片は、180キロボルトの透過型電子顕微鏡で、それ以上の変更を加えることなく直接評価できます。