マウスモデルにおける神経活動と接続性を研究するための2光子ホログラフィック顕微鏡法

空間光変調器(SLM)と統合された2光子ホログラフィック顕微鏡の下に置かれた覚醒マウスから始めます。

マウスは、事前に埋め込まれたヘッドプレートを保持します。

マウスの脳では、ニューロンはカルシウムイオンに結合する赤色光に敏感なチャネルと緑色蛍光カルシウム指示薬を発現します。

神経活動と接続性を研究するには、イメージングパラメータを設定します。

920ナノメートルのレーザーを使用して、ニューロン内のカルシウム結合指標を励起します。最小限の光損傷でニューロンの蛍光画像をキャプチャします。

イメージングパラメータをリセットし、近赤外レーザービームを集束させます。

SLM はレーザー ビームを正確なホログラフィック パターンに成形し、複数のポイントで標的ニューロンに選択的に焦点を合わせることができます。

これにより、光感受性チャネルが刺激され、カルシウムイオンの流入が引き起こされ、標的ニューロンの蛍光が増強されます。

活性化された標的ニューロンは、接続されたニューロンに信号を伝達し、接続されたニューロンの蛍光を高めます。

ここでも、2光子画像をキャプチャします。標的ニューロンと接続されたニューロンの蛍光の増加は、ニューロンの活動と接続性を確認します。

マウスを顕微鏡下に置き、2光子イメージングを実行した後、市販のイメージングソフトウェアを開きます。ライブイメージングモードでは、画像検出器の電圧とイメージングレーザーの出力を調整して、GCaMP6m-P2A-ChRmineを発現するニューロンの明るさを最適化します。これらのタンパク質を発現するニューロンの画像をキャプチャし、前に示した手順に従って特定のニューロンを照らします。

レイヤー 2 および 3 ニューロン内の機能的接続性を調査するには、空間光変調器を使用して光遺伝学的刺激のホログラフィック パターンを生成します。そして、それを二光子カルシウムイメージングと組み合わせます。イメージングレーザーの強度を10〜20ミリワットで920ナノメートルに設定し、視野を256マイクロメートル×256マイクロメートルに設定します。皮質表面から100〜150マイクロメートルの深さで測定されます。

ピクセル滞留時間を 2 ヘルツの場合は 1.5 マイクロ秒、30 ヘルツの場合は 100 ナノ秒に設定します。イメージングフレームレートとして2ヘルツと30ヘルツの両方を使用して、単一のホログラフィック刺激がニューロンにカルシウム応答を引き起こしたかどうかを確認します。1つのニューロンを刺激するホログラフィック刺激レーザーの強度を、神経活動を誘導するのに十分な10ミリワットに設定します。

同時に、10秒のベースライン期間の後、50ミリ秒の持続時間、1,040ナノメートルで10回のホログラフィック刺激と8秒間隔で、920ナノメートルでカルシウムイオン応答を画像化します。