FSLは構築：生物学​​的マーカーの範囲でセル/ビリオン表面を変更するための簡単​​な方法を彼らの生存率に影響を与えず

この手順の全体的な目標は、生細胞またはSの表面を生理活性コンストラクトで無害かつ迅速に標識することです。これは、最初に機能スペーサー、脂質、またはFSLコンストラクト溶液を調製することによって達成されます。次に、等量のコンストラクト溶液を等量の細胞またはVIRの溶液と混合します。

第3のステップとして、混合物を摂氏37度で60分間インキュベートする。最後のステップは、修飾された細胞または細胞、または修飾されたVIRまたはVIRを洗浄し、通常どおり実験的に使用することです。最終的に、表面修飾された生細胞またはSは、フローサイトメトリー、顕微鏡法、凝集術を含むすべてのルーチン実験分析技術を通じて視覚化できます。

この手法が共有結合標識などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、迅速で堅牢、柔軟性があり、改変細胞や Varian の活力に影響を与えないことです。FSLコンストラクトストック溶液を調製するには、まず製品ファイルに1ミリリットルの希釈剤を加えて乾燥FSL製品を再構成し、1ミリリットルあたり1ミリグラムのストック溶液を作成します。バイアルを30秒間超音波処理し、ストックを100マイクロリットルの滅菌容器に分注し、容器を摂氏2〜8度で最大1週間保存します。

使用直前に挿入するFSL構築物溶液を調製するには、任意のmis cellsを均質化するために30秒間再度溶液を超音波処理し、次にFSL構築物および緩衝液を必要な濃度に希釈する。Resus懸濁液を脂質を含まない媒体に懸濁した後、またはPBSが非結合脂質を含まないFSL修飾のために細胞を遠心分離した後、2〜8°Cで最大1週間、作業溶液を摂氏2〜8度で保存します。次に、細胞を100マイクロリットルの希釈剤に詰め、同じ条件下でコントロール用の細胞を100マイクロリットルの未修飾細胞に洗浄します。

必要に応じて、100マイクロリットルの適切な希釈量のFSL溶液を追加します。並行して、無関係なFSLソリューションやPBSを使用してネガティブコントロールも作成します。次に、インキュベーション後、すべての細胞サブセットを摂氏37度で1時間インキュベートします。

すべての細胞を無脂質培地またはPBSで2回洗浄して、遊離FSLコンストラクトを除去し、脂質を含まない培地に適切な懸濁液を調製します。FSL改質プロセスが完了すると、コイは花のように摂氏4〜8度で保存できます。FSLコンストラクトは、ファンクショナルヘッドまたはFの3つの主要なコンポーネントで構成されており、これらはさまざまな生物学的に機能的なグループである可能性があります。

スペーサーRSは、水の分散性を改善し、人間の血清とDAL脂質またはLと非反応性であるために、膜から機能的なヘッドの間隔を誘導するように設計されており、構造が自発的に表面に4つ組み込まれることを可能にします。代表的なFSLグループを以下の5つの画像に示します。生きたマウス胚を、無血清細胞培養培地で37°C法で2時間、FSLフルオレセインで直接標識し、洗浄した後、蛍光顕微鏡で観察しました。

この最初の画像では、zop palita free two cell mirroring 胚を見ることができます。胚の中央での激しい染色は、古典的な極性体染色の代表です。次の2つの画像では、顕微鏡の焦点Pの外側にある細胞の影のような染色を示すzop palita free 4細胞および8細胞ミラーリング胚がここに示されています。

この最後の画像には、FSLフルオレセイン標識のこの最後の画像に示されています。この最後の画像には、ライブミラーリング胚、4〜5日齢の無傷のミラーリングブラスト胚、胚とZOP LUCITA標識の両方を持つ胚が示されています。ゼブラフィッシュのFSLフルオレセイン標識が示されています。この最初の画像は、FSLフルオレセインが直接循環に注入されたゼブラフィッシュの幼生の受精後52時間のマイクロ血管造影法です。

ここでは、ゼブラフィッシュの血管系の染色が観察できます。FSLフルオレセイン、不均一なゼブラフィッシュ腎臓組織細胞またはZK細胞をexvivoで作成し、その後、受精後52時間の循環にマイクロ注射しました レシピエントゼブラフィッシュのZK細胞の生体内観察は、注入後2時間で行われました タイムラプス顕微鏡による蛍光下での血管系のイメージングにより、オレンジ色の矢印で示された大きなゆっくりと動くまたは動かない細胞と単一のビデオフレームです。 緑色の矢印で示された動きのためにぼやけて見えました。この画像では、ゼブラフィッシュの胚とFSLフルオレセイン含有培地を最大5日間浸漬することによって達成されるコンストラクトの経口摂取によるFSLフルオレセイン標識が示されています。

左のFSLフルオレセイン処理ゼブラフィッシュの明視野顕微鏡は、右の隣接する蛍光画像に対応しています。蛍光は腸管に優先的に位置していました。ここに示されている未処理の対照胚では染色は観察されませんでした。

ここでは、水疱性口内炎ウイルスまたはVSVをFSLフルオレセイン1ミリリットルあたり10マイクログラムで直接標識し、摂氏37度で2時間、続いて4%パラホルムアルデヒドで固定し、その後、ファクトスキャンによる分析はVSVウイルスの精製を示していません。ポストFSLラベリングが必要でした。このヒストグラムは、ヒトA、プエルトリコ、8、19、34、またはH、1、N、1、VIRに感染したブタ精巣細胞をFSLフルオレセインで標識したことを示しています。

非蛍光性の非感染細胞は黒線で表され、蛍光を生じたH1Nオンコロンとブタ細胞との融合は赤線で示されています。この次の一連の画像では、まず細胞をFSLビオチンで摂氏37度で1時間標識し、次にFluor 4標識アバドンで洗浄して反応させ、次いで洗浄して蛍光顕微鏡用にウェットマウントしました。最初の画像は、マウス胚のブラストアシストのコンパイルされた共焦点画像を示しており、この図は、前の画像から胚の中央の共焦点スライスを示しています。

これは生きている運動性の人間パーマゾアです。ぼやけは、それらの動きの結果として発生します。挿入後の4%パラフォームアルデヒドに固定されたヒト精子のより明確な代表的な画像は、この図で見ることができます。

FSLビオチン標識ヒト赤血球は、4%パラフォームアルデヒドプレ挿入による固定が示され、以下の2つの図に示すようにFSL標識に影響を与えず、4%パルマル固定RL95子宮内膜ヒト癌細胞が観察できる。一方、この画像では、RL 95 子宮内膜ヒトがん細胞は固定されていません。固定の有無にかかわらず、2つの画像間でラベリングにはほとんど違いが見られません。

静脈内注入の2時間後に採取した血液サンプルで観察されたFSLビオチン標識RBC細胞を左に、細胞を光学顕微鏡で観察した右に、同じ細胞フィールドを蛍光で観察し、存在する2つの細胞を緑色で識別できます。細胞と非標識細胞の比率を計算することは、生存の指標として使用できます。この最後のFSLビオチン標識細胞画像は、減少したビーズに結合して可視化された生きたヒト子宮内膜ビオチン細胞を示しています。

この最後の一連の画像は、FSLコンストラクトと血液型マーカーとの相互作用を示しています。最初の画像は、ヒト血清の希釈に対して試験された500μg/ミリリットルの濃度のFSLGでコーティングされたヒト赤血球GLI細胞です。ヒトの赤血球は、Xena抗原GALI抗原と自然に反応しません。

そのため、細胞を使用して血清中の抗体レベルを定量することができます。この例では、患者は、FSLのレベルが減少する細胞を作成することにより、抗力価が1〜32であると判断されました。抗原力価を作成するのと同様に、抗体を検出するための最適な抗原レベルを決定することができ、抗体レベルが特定の力価を超えた場合にのみ陽性の結果が得られるように細胞を作成することができます。

陽性結果を出すために必要なFSL抗原のレベルは、検出される抗体の品質とレベルによって異なります。通常、炭水化物抗原の場合、1ミリリットルあたり100マイクログラムのFSL溶液は、強い陽性反応をもたらします。ヒトグループO赤血球は、特定のレベルの抗原を有するように改変された、またはいわゆる標準化されています。

細胞は、ヒト血清中の抗アを正確かつ再現性よく定量するために使用されます。この例では、サイトはドナー自身の赤血球から調製され、試験されたグループO血清中の抗アレベルは1〜32であることがわかりました。ここで示すのは、血液型A型とB型の抗原を1つのグループO赤血球サンプルに同時に挿入して、1週間、B週の細胞を作製するために使用した血液型A型

これらの細胞は、VO品質管理の目的で使用できます。特に処方された週、B週の細胞を抗アおよび抗B試薬に対してテストした分析は、この図で証明されているように、チューブの中央底部で起こる反応で予想される弱い反応を与えます。この簡単なテクニックは、適切に実行すれば2時間で実行できます。