FSLは構築：生物学​​的マーカーの範囲でセル/ビリオン表面を変更するための簡単​​な方法を彼らの生存率に影響を与えず

本手順の全体的な目的は、生細胞またはSの表面を、生物活性構築物を用いて無害かつ迅速に標識することである。まず、機能性スペーサー、脂質、またはFSL構築物溶液を調製する。次に、この構築物溶液と同量の細胞またはVIRsの溶液を混合する。

第3のステップとして、混合物を37 °Cで60分間インキュベートします。最終ステップは、修飾された細胞またはcytes、あるいは修飾されたVIRsまたはVIRsを洗浄し、通常通り実験に使用することです。最終的に、表面修飾された生細胞またはSは、フローサイトメトリー、顕微鏡観察、凝集反応を含むすべてのルーチンの実験分析手法を通じて可視化できます。

共有結合標識などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、迅速かつ堅牢で柔軟であり、修飾された細胞やバリアントの生存能に影響を与えないことです。まず、FSL構築物のストック溶液を調製するため、製品バイアルに1 mLの希釈液を加えて乾燥したFSL製品を再構成し、1 mg/mLのストック溶液を作成します。バイアルを30秒間ソニケーションし、ストック溶液を100 µLずつ滅菌容器に分注し、2〜8 °Cで最大1週間保存してください。

挿入直前に使用するFSL構築物ワーキング溶液を調製するには、溶液を再度30秒間超音波処理して凝集した細胞を均質化し、その後、FSL構築物と緩衝液を必要濃度まで希釈します。ワーキング溶液は2〜8°Cで最大1週間保存してください。脂質フリー培地またはPBSで再懸濁した後、細胞を遠心分離し、未結合の脂質を除去してFSL修飾を行います。次に、細胞を100 µLの希釈液に回収し、対照群の細胞についても同様の条件で洗浄し、未修飾細胞を100 µLに調製します。

必要に応じて、適切に希釈したFSL溶液を100 µL添加します。同時に、無関係なFSL溶液またはPBSを用いて陰性コントロールも作成します。その後、すべての細胞サブセットを37 °Cで1時間インキュベートします。

遊離したFSL構築体を取り除くため、すべての細胞を脂質フリー培地またはPBSで2回洗浄し、脂質フリー培地で適切な懸濁液を調製します。FSL修飾プロセスが完了すると、細胞は4～8°Cで保存可能です。FSL構築体は3つの主要成分で構成されており、そのうちの機能性ヘッド（F）には、さまざまな生物学的機能基が含まれます。

スペーサーRSは、水分散性を向上させるために機能性ヘッドを膜から離して間隔を空けるよう設計されており、ヒト血清およびDAL脂質またはLに対して非反応性であるため、構築物が表面に自発的に組み込まれるようになっています。代表的なFSLグループを以下の5つの画像に示します。生存しているマウス胚を、無血清細胞培養培地を用いて37 °Cで2時間という手法によりFSLフルオレセインで直接標識し、洗浄後、蛍光顕微鏡で観察しました。

最初の画像では、zop palita 欠損の2細胞鏡像胚が確認できます。胚の中央に見られる強い染色は、典型的な極体染色を示しています。続く2つの画像では、zop palita 欠損の4細胞および8細胞鏡像胚が示されており、顕微鏡の焦点面から外れた細胞に影のような染色が見られます。

最後の画像には、zop palita-freeの16細胞期鏡像胚が示されています。続く一連の画像では、4〜5日目の完全な鏡像胚（blast embryos）であり、胚とzop LUCITAの両方がラベル化されたFSLフルオレセイン標識生体鏡像胚が示されています。ゼブラフィッシュのFSLフルオレセイン標識が示されています。最初の画像は、血流にFSLフルオレセインを直接注入した受精後52時間のゼブラフィッシュ幼魚のマイクロアンギオグラフィーです。

ゼブラフィッシュの血管系の染色の様子をここで確認できます。FSLフルオレセインで標識した異種ゼブラフィッシュ腎組織細胞（ZKサイト）をex vivoで作成し、受精後52時間のレシピエントゼブラフィッシュの循環系にマイクロインジェクションしました。ZKサイトのin vivo観察は、注入2時間後にタイムラプス顕微鏡を用いて血管系を蛍光イメージングすることで行いました。提示されているのは単一のビデオフレームであり、オレンジ色の矢印で示されているのは大きくゆっくりと移動するか、あるいは静止している細胞であり、緑色の矢印で示されているのは移動によるブレが生じている高速移動細胞です。この画像では、ゼブラフィッシュ胚をFSLフルオレセイン含有培地に最大5日間浸漬させることで、構築物の経口摂取によるFSLフルオレセイン標識が達成された様子が示されています。

左側のFSLフルオレセイン処理したゼブラフィッシュの明視野顕微鏡像は、右側の隣接する蛍光像に対応しています。蛍光は優先的に消化管に局在していました。ここに示した未処理の対照胚では、染色は観察されませんでした。

ここでは、10 µg/mLのFSLフルオレセインを用いて37 °Cで2時間直接標識し、続いて4%パラホルムアルデヒドで固定した後、FACScanで分析した水疱性口炎ウイルス（VSV）の結果を示しており、FSL標識後のVSVウイルスの精製は不要であることが示されています。このヒストグラムは、FSLフルオレセインで標識したヒトH1N1ウイルス（A/Puerto Rico/8/34）に感染させたブタ精巣細胞を示しています。

非蛍光の未感染細胞は黒線で示され、豚細胞とH1N1コロナウイルスが融合して蛍光を発した状態は赤線で示されています。次の画像シリーズでは、細胞をまずFSLビオチンで37 °Cで1時間標識し、洗浄後、Fluor 4標識アビジンと反応させ、さらに洗浄して蛍光顕微鏡用にウェットマウントしました。最初の画像はマウス胚盤胞の構成共焦点画像であり、この図は前述の画像における胚の中央共焦点スライスを示しています。

こちらは、生存して運動しているヒト精子細胞です。ぼやけて見えるのは、それらが運動しているためです。挿入後に4%パラホルムアルデヒドで固定したヒト精子のより鮮明な代表画像は、こちらの図で確認できます。

4%パラホルムアルデヒドで固定したFSLビオチン標識ヒト赤血球を示します。以下の2つの図に示されるように、固定操作はFSL標識に影響を与えません。こちらでは、4%パラホルムアルデヒドで固定したRL 95子宮内膜ヒト癌細胞が観察できます。一方、こちらの画像では、RL 95子宮内膜ヒト癌細胞は固定されていません。固定の有無による2つの画像間で、標識に実質的な差は見られません。

静脈内投与から2時間後に採取した血液サンプル中で観察されたFSLビオチン標識RBCサイトをここに示します。左側は光学顕微鏡による細胞の観察像であり、右側は同一視野を蛍光顕微鏡で観察したもので、2つのサイトが緑色に識別できます。サイトと未標識細胞の比率を算出することで、生存率の指標として利用できます。最後のFSLビオチン標識細胞の画像は、アビジンビーズに結合させることで可視化した生存ヒト子宮内膜ビオチンサイトを示しています。

この最後の画像シリーズでは、FSL構築物と血液型マーカーとの相互作用を示します。最初の画像は、500 µg/mL濃度のFSLGでコーティングし、ヒト血清の希釈液でテストしたヒト赤血球GLIサイトのものです。ヒト赤血球は、通常、Xena抗原GALI抗原とは反応しません。

このように、cytesを用いることで血清中の抗体量を定量することが可能です。この例では、FSLの濃度を段階的に下げたcytesを作製することにより、患者の抗体価が1:32であることが判定されました。抗体価の測定と同様に、抗体を検出するための最適な抗原濃度を決定でき、抗体価が特定の閾値を超えた場合にのみ陽性結果を示す細胞を作製することができます。

陽性結果を得るために必要なFSL抗原のレベルは、検出される抗体の質とレベルに依存します。通常、糖鎖抗原の場合、100 micrograms per milliliterのFSL溶液で強い陽性反応が得られます。ヒトO型赤血球を、特定のレベルの抗原を持つように修飾したもの、いわゆる標準化赤血球です。

A細胞は、ヒト血清中のanti-Aを正確かつ再現性よく定量するために使用されます。この例では、cytesはドナー自身の赤血球から調製され、検査したO型血清中のanti-Aレベルは1/32であることが判明しました。ここに示す6番目の試験管では、単一のO型赤血球サンプルにA抗原とB抗原を同時に導入することで、A weak, B weak cytesを作成しています。

これらの細胞は、VOの品質管理目的に使用できます。特に調製されたa weekおよびB week細胞を抗Aおよび抗B試薬でテストした解析では、本図に示されるように、チューブの中央下部で反応が起こり、期待通りの弱い反応が得られます。この簡便な手法は、適切に実施すれば2時間で完了します。