特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

本実験の全体的な目的は、モデル糖タンパク質を用いた酵素的な脱糖鎖修飾およびn-結合型およびO-結合型糖鎖修飾の分析におけるglycosateの使用法を説明することである。これは、糖タンパク質をPGA's Fまたはタンパク質脱糖鎖ミックスで処理することによって達成される。また、通常では除去が困難な糖を除去しやすくするため、タンパク質脱糖鎖ミックスにさらなるexo glyco assの混合物を添加した。

本法をモデル糖タンパク質であるリコンビナントヒト絨毛性ゴナドトロピンβ（HCG β）を用いて例示します。次に、SDS-PAGEを行い、続いてクマシーブルー染色および糖特異的染色法を実施しました。糖鎖修飾を分析するためにPro Q Emerald 300を使用しました。HCG βサンプルの解析結果から、HCG βは不均一に糖鎖修飾されており、脱糖鎖処理の有無によるタンパク質の移動度の違い、および糖鎖が順次除去されるにつれてPro Q染色のシグナルが減弱することから、複数の糖鎖形態（glycoforms）が含まれていることが示されました。

質量分析などの既存の手法と比較した本技法の主な利点は、簡便であり、一般的な実験器具を使用でき、糖生物学の初心者にとっても有用である点にあります。本手法を用いることで、「目的のタンパク質は糖鎖修飾されているか」といった、糖生物学分野における重要な疑問を解決できます。酵素的脱糖鎖修飾を開始するには、タンパク質脱糖鎖修飾キットに付属のバッファーを解凍してください。

チューブを十分に混合し、室温で保持します。酵素を含むバイアルを氷上に置き、HCG betaバイアルの内容物を600 µLの蒸留水で溶解し、氷上で保持します。10xストック溶液を蒸留水で希釈して1x G7バッファーを1 mL調製した後、そのうち25 µLを用いて0.5 µLのPGA's fを希釈します。

4種類のexo glyco diseasesをそれぞれ2 µLずつ混合し、exo glycosate mixを調製します。次に、書面によるプロトコルの指示に従い、番号付きの7本のPCRチューブにHCG betaおよび10x glycoprotein denaturing bufferを加え、チューブにキャップをして静かに混合します。サーモサイクラーを用いて94 °Cで10分間インキュベートし、その後4 °Cでホールドしてタンパク質を変性させます。サーモサイクラーからチューブを取り出し、遠心分離して各反応チューブ内の目に見える凝縮水を取り除きます。書面によるプロトコルに従い、残りの試薬を各チューブに加えます。新しいキャップを使用してPCRチューブを閉じます。

次に、遠心分離して内容物を集めた後、チューブを軽く4回タッピングして混合し、サーモサイクラーに設置して37 °Cで4時間インキュベートします。その後、サンプルを4 °Cまで冷却します。SDS-PAGEの準備として、新鮮な3 x 還元用SDSローディングバッファーを調製します。

DTTを含む調整済みの3倍濃度還元SDSローディングバッファーを各サンプルに12.5 µL加え、新しいキャップでチューブを密閉し、軽く叩いて混合させます。サーモサイクラーを用いて94 °Cで5分間インキュベートした後、4 °Cまで冷却します。インキュベーション後、各サンプル30 µLとタンパク質マーカー10 µLを10〜20%トリシン-グリシンゲルにロードします。各サンプルの残量は保存しておきます。

Dフロントがゲルの底部付近に到達するまで、130 Vでゲルを電気泳動します。泳動後、キャストからゲルを取り出し、ゲルが完全に浸る十分な量のクマシーブルー染色液を入れた小型プラスチックボックスに入れます。緩やかに攪拌しながら1時間染色します。ゲルの染色が完了したら、

30分間、3回洗浄します。50 mLの染色除去液（detain solution）中で、白色光透過照明装置またはスキャナーを用いて画像を記録します。あるいは、ゲルをセロファンシートの間で乾燥させることも可能です。

ゲルの電気泳動を行っている間に、各サンプルの残量とタンパク質マーカーを10〜20% Tri-glycine ゲルで展開します。キット付属の製品マニュアルに従い、ProQ emerald 試薬をDMFで溶解し、染色のためのストック固定液、洗浄液、および酸化液を調製します。電気泳動が完了したら、ゲルをキャストから取り出し、プラスチック製ボックスに入れます。

調製した固定液100 millilitersを加え、ゲルを固定します。ゲルを室温で一晩放置し、翌日に緩やかに攪拌します。室温で緩やかに攪拌しながら、調製した洗浄液100 millilitersで10～20分間ゲルを洗浄し、新しい洗浄液を用いてこの洗浄工程を2回繰り返します。

次に、準備した酸化液25 millilitersを用いて、ゲルを緩やかに撹拌しながら30分間インキュベートし、炭水化物を酸化させます。インキュベーション後、ゲルの洗浄中にさらに2回の洗浄を行います。キットに付属の染色バッファー25 millilitersにProQ Emerald 300試薬溶液500 microlitersを加え、新鮮なProQ emerald 300染色液を調製します。調製した染色液に入れ、遮光条件下で緩やかに撹拌しながら90分から120分間インキュベートして、ゲルを染色します。

前述した2回の洗浄ステップを繰り返します。その後、UVトランスイルミネーターを用いて300 nanometersで画像を記録します。最終ステップとして、クマシー染色したゲルの画像とProQ emerald染色したゲルの画像を比較します。

コントロールサンプルとPGAのF処理を比較すると、酵素的脱糖鎖後のタンパク質の移動度の変化を確認できます。n-糖鎖を除去するための処理およびn-糖鎖とO-糖鎖を除去するための脱糖鎖ミックス処理を行った後、さらに糖鎖分解酵素で消化しても、それ以上のサイズ減少は見られません。質量の変化に加えて、糖鎖が除去されるにつれてバンドがより鮮明になります。

17 kilodaltonマーカーより下に現れるバンドは、おそらく完全に脱糖鎖修飾されたHCG betaポリペプチドを表しています。レーン5から7には、Glycoに対応するバンドが示されています。その他のバンドは、不完全な脱糖鎖修飾、またはHCG betaサンプル中に存在する未同定の複数のタンパク質に由来する可能性があります。

エメラルドグリーン試薬は、タンパク質分子内に存在するすべての糖鎖を酸化し、染色します。したがって、HCG betaが酵素的に脱糖鎖されるにつれて、シグナルの強度は低下します。レーン3および4に認められる残存シグナルは、使用した酵素に対して耐性を持つ糖鎖モチーフが存在していることを示しています。

追加のグリコシル化をレーン4で使用します。いくつかの余剰な糖残基を除去します。タンパク質の移動度は同じですが、染色の強度がわずかに低下していることが確認できます。

すべてのタンパク質種に耐性糖鎖が存在していたわけではありませんでした。一部のバンドはemerald Greenで検出されず、これらが広範に脱糖鎖化されていたことが示されました。追加データは、HCG betaが不均一に糖鎖修飾されているという結論を支持しています。レーン2の下方のバンドは、emerald greenの画像では薄くなっています。

レーン2の上方のバンドが明るく、多くのGLYCAN基が依然として存在していることを示していますが、これらのデータは、マウス細胞で発現させたリコンビナントHCGベータが、糖鎖付加固有の不均一性により、複数の糖鎖形態を含んでいるという結論を裏付けています。この手順の後、占有率はどのくらいか、糖鎖付加の程度はどの程度か、あるいは糖鎖の微細構造はどうなっているか、といったさらなる疑問に答えるために、質量分析などの他の手法を実施することができます。

このビデオを視聴することで、糖タンパク質のN-結合型グリカンの酵素的脱糖鎖修飾および分析にglycosylateを使用する方法を十分に理解できるはずです。検出方法の選択は困難な場合があります。なぜなら、タンパク質染色領域は、脱糖鎖修飾によって分子量に有意な変化が生じた場合にのみ有用であるためです。

脱糖鎖修飾後に異常な移動度が観察されており、移動度の変化は、タンパク質が脱糖鎖修飾されたことの証拠であることが分かりました。