特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

次の実験の全体的な目標は、モデル糖タンパク質上のnおよびO結合型グリコシル化の酵素的脱グリコシル化および分析のためのグリコセートの使用を説明することです。これは、糖タンパク質をPGAのFまたはタンパク質の脱グリコシル化ミックスで処理することによって達成されます。また、タンパク質の脱グリコシル化ミックスには、追加のエキソグリコASSの混合物が添加されており、これにより、他の方法では耐性のある糖を除去するのに役立つことがあります。

この方法は、モデル糖タンパク質組換えヒト絨毛性ゴナドトロピンベータ、またはHCGベータの次のSDSページを使用して説明し、続いてクマシブルー染色と糖特異的染色法を示します。Pro Q Emerald 300は、Dグリコシル化の解析に使用されます。HCG ベータサンプルの結果が得られ、HCG ベータは不均一にグリコシル化され、グリコセート処理の有無にかかわらずタンパク質の移動の違いと、グリカンが連続的に除去されるにつれて ProQ 染色でシグナルが低下することに基づいて、複数のグリコ形態が含まれていることが示されています。

この手法が質量分析などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、シンプルで、一般的な実験装置を使用し、初心者の糖質生物学者に適していることです。この方法は、タンパク質がグリコシル化されているかどうかなど、糖質分野の重要な質問に答えることができます。酵素による脱グリコシル化を開始するには、タンパク質脱グリコシル化キットから供給されたバッファーを解凍します。

チューブをよく混ぜ合わせ、室温に保ちます。酵素含有バイアルを氷の上に置き、HCGベータバイアルの内容物を600マイクロリットルの蒸留水に溶解し、氷上に保ちます。10 x ストックを蒸留水で希釈して 1 つの XG 7 バッファーを 1 ミリリットル調製した後、25 マイクロリットルを使用して PGA の f を 0.5 マイクロリットル希釈します。

エキソグリコセートミックスは、4つのエキソグリコ疾患のそれぞれである2マイクロリットルを組み合わせて調製します。次に、HCGベータおよび10×糖タンパク質変性緩衝液を、書かれたプロトコルに示されているように、7つの番号付きPCRチューブに加え、チューブをキャップし、94°Cで10分間インキュベートすることにより、サーモサイクラー内のタンパク質を穏やかに変性させて混合し、続いて4°Cホールドサーモサイクラー遠心分離機からチューブを取り外した後、各反応チューブに見える結露を除去し、 残りの試薬は、書かれたプロトコルに従って追加します。新しいキャップを使用してPCRチューブを閉じます。

次に、内容物をスピンダウンした後、チューブを4回軽くたたいてチューブを混合し、チューブをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で4時間インキュベートします。続いて、サンプルを摂氏4度に冷却します。SDSページを設定するには、新しい3つのx削減SDSローディングバッファを準備します。

DTTでは、準備した3×還元SDSローディングバッファーの12.5マイクロリットルを各サンプルに追加し、新しいキャップでチューブを閉じ、チューブを軽くたたいて混合します。チューブをサーモサイクラーで摂氏94度で5分間インキュベートし、次いで摂氏4度まで冷却しますインキュベーション負荷に続いて、各サンプルの30マイクロリットルとタンパク質マーカーの10〜20%トリグリシンゲル上に10マイクロリットルを注入します。各サンプルの残りの部分を保存します。

Dフロントがゲルの底部近くまで、ゲルを130ボルトでエレクトロします。ゲルの流動が終わったら、ジェルをキャストから取り出し、ゲルの汚れを覆うのに十分なクマシブルーの汚れが入った小さなプラスチックの箱に入れます。ゲルを穏やかに攪拌しながら1時間ゲルを染色した後。

30分間3回洗います。50ミリリットルの拘留液中で、白色光トランスルミネーターまたはスキャナーを使用して画像を記録します。あるいは、ゲルをセロハンのシート間で乾燥させることもできます。

フレーム内で、各サンプルの残りとタンパク質マーカーを、ゲルの実行中に10〜20%Triグリシンゲルに泳動します。ProQエメラルド試薬をDMFに溶解し、キットに付属の製品マニュアルに従って、ストック固定、洗浄、および染色用の酸化溶液を準備します。電気泳動が完了したら、ゲルをキャストから取り出し、プラスチックの箱に入れます。

調製した固定溶液100ミリリットルを加えてゲルを固定します。ゲルを室温で一晩放置し、翌日は穏やかに攪拌します。調製した洗浄液100ミリリットルでゲルを室温で10〜20分間、穏やかに攪拌しながら洗浄し、新鮮な洗浄液で再度洗浄を繰り返します。

次に、調製した酸化溶液の25ミリリットル中に30分間穏やかに攪拌しながらゲルをインキュベートすることにより、炭水化物を酸化し、ゲルを洗浄しながらさらに2回の洗浄でインキュベーションします。キットに付属の25 mmリットルの染色バッファーに500 μリットルのProQ Emerald 300試薬溶液を加えて、新しいProQ emerald 300染色液を調製します。ゲル染色後90〜120分間、暗所で調製した染色液にインキュベートし、穏やかに攪拌してゲルを染色します。

前述のように、2つの洗浄手順を繰り返します。その後、UVトランスイルミネーターで300ナノメートルの画像を記録します。最後のステップとして、kumasi染色ゲルとProQエメラルド染色ゲルの画像を比較します。

酵素による脱グリコシル化後のタンパク質遊走の変化は、コントロールサンプルをPGAのF処理と比較すると確認できます。n個の糖鎖を除去し、n型糖鎖とO型糖鎖を除去する脱グリコシル化ミックス処理では、追加のグリコセートで消化した後、それ以上のサイズの縮小は見られません。質量の変化に加えて、糖鎖が除去されるとバンドが鋭くなります。

17キロダルトンマーカーの下を走るバンドは、おそらく完全に脱グリコシル化されたHCGベータポリペプチドを表しています。レーン 5 から 7 は、Glyco に対応するバンドを示しています。他のバンドは、不完全な脱グリコシル化に由来するか、HCGベータサンプルに存在する複数の未同定タンパク質に由来する可能性があります。

エメラルドグリーンの試薬は、タンパク質分子中に存在するすべての糖鎖を酸化し、染色します。したがって、HCGベータが酵素的にdグリコシル化されると、シグナルの強度は減少します。レーン3とレーン4の残留シグナルは、使用する酵素に耐性を持つ糖鎖モチーフの存在を示しています。

追加のグリコセートはレーン4で使用されます。余分な砂糖の残留物をいくつか取り除きます。タンパク質の移動は同じですが、染色の強度がわずかに低下していることがわかります。

耐性糖部分は、すべてのタンパク質種に存在したわけではありません。一部のバンドはエメラルドグリーンによって検出されず、広範囲に脱グリコシル化されていたことを示しています 追加のデータは、HCGベータが不均一にグリコシル化されているという結論を支持しています。レーン 2 の下のバンドは、エメラルド グリーンの画像でかすか

レーン 2 の上のバンドは明るく、多くの GLYCAN 基がまだ存在していることを示していますが、これらのデータは、マウス細胞で発現する組換え HCG β には、グリコシル化の固有の不均一性により複数の糖型が含まれているという結論を支持しています。この手順に続いて、質量分析などの他の方法を実行して、占有率などの追加の質問に答えることができますか?グリコシル化の程度や、糖鎖の微細構造はどの程度ですか?

このビデオを見れば、NNO Linked Glycansの酵素的脱グリコシル化と分析にグリコシル酸を使用する方法について十分に理解できるはずです。糖タンパク質について。タンパク質染色領域は、脱グリコシル化によって他のタンパク質の分子量が大幅に変化する場合にのみ有用であるため、検出の選択が難しい場合があります。

脱グリコシル化後の異常な遊走が見られ、遊走の変化はタンパク質が脱グリコシル化されている証拠であることを発見しました。