Name: 逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 学ぶ逆行性蛍光標識法による特定神経細胞からの細胞外シングルユニット記録技術。非遺伝学的モデル系で投射ニューロンを選択的に標識し、生体内電気生理学的記録を実現する方法です。

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TKにG2205（学術振興のために国立科学財団（BACにIOS-1050701）、国立衛生研究所（SMにNS54174とAML-WへF30DC0111907。）、上原記念財団と日本協会が提供する資金）。我々は細胞外の軸索の録音のトピックに関する彼の支援とご指導をユリウスミークスに感謝。我々はプロトタイプ記録室を提供するためにカールホプキンスに感謝します。

<ol><li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li>
<li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li>
<li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099(2009).</li>
<li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li>
<li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dogged+pursuit+of+coincidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li>
<li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish%3A+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li>
<li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li>
<li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li>
<li>Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li>
<li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li>
<li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%3A+Neuroethol+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li>
<li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li>
<li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain%3A+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li>
<li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li>
<li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li>
<li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li>
<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li>
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<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
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<li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons%3A+applications+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li>
<li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na%2B+current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li>
<li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li>
<li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

一度習得し、この手法は1つが多くのモデル系におけるin vivoでの録音のために個々の軸索を含む識別ニューロンを、ターゲットにできるようになります。さらに、この技術は1つが確実に挑戦インビボ記録方式で行う従来のユニークな解剖学的特徴を有するニューロンのスパイク出力を記録することができる。私たちは、モルミルス科弱電気魚でELA &quot;小さなセル&quot;から録音するために、この技術を利用してきた。 &quot;小さなセル&quot;のチューニング特性を研究するための以前の試みは、挑戦的な記録条件11、14のために失敗した。類似の解剖学的特徴は、多くの異なる脊椎動物聴覚とelectrosensoryニューロン8-10から単一のユニットの録音を得るための障壁を作成します。我々のシステムでこれらの課題を克服するために、我々は &quot;小さな細胞が&quot; ELPのプロジェクトそのELAで唯一の細胞であるという事実を利用しました。したがって、ELPに置か色素の逆行輸送は &quot;小さなにELAでラベリング制限セル&quot;細胞体と軸索。軸索の蛍光標識にはアクセスできなくSOMAのにもかかわらず、可能性識別細胞から単一ユニット記録を作り、ラベルの付いた軸索の隣に正確な電極配置を可能にした。私たちは、周囲を巻き込むのシナプス11のため、おそらく、体の録音を試みたが、成功しなかった、17があるが、体ラベリングは、この技術は、他の細胞型と他の回路の不定記録を標的化するために使用され得ることを示唆してはっきりと見えた。in vivoでの逆行輸送を介してニューロンの蛍光標識は、 インビトロ 19-21 に標的記録を案内するために使用されている。類似の技術はゼブラフィッシュ脊髄22で運動ニューロンからin vivoでの録音の対象に使用された。私たちの仕事はラベリングと記録の両方が脳内で生体内で行われているこのアプローチの新規拡大を表し、私たちの方法は、生体内であることを示してい逆行tと共に中枢神経系領域のラベリングレーサーは、同様に選択的な投影ニューロンを持つ他の無傷の回路の研究に拡張することができます。例えば、哺乳類の聴覚処理で、下丘（IC）は、複数の菱脳構造23からの入力のための重要な中継センターとして機能しています。 ICへの色素の注入が選択的にこれらの核のそれぞれから投影細胞を標識だろう。上丘（SC）は、ビジョン24と同様の機能を提供しています。脊髄調製物が特に良く、この技術に適している、脊髄が容易にアクセスされるように、色素注入は、記録部位から遠くに発生することができ、それは、より詳細な解剖学的情報25を取得する選択ニューロンの細胞内記録と充填と組み合わせることができる。最後に、管·トレースは複雑な回路26をマッピングするために、中枢神経系全体で使用されるよく確立された技術である。我々の方法は、wを行われているように、これらの研究に機能情報を追加するために利用することができるネコ視覚野27のi番目のカルシウム感受性の指標。 十分に確立されている手術は、信頼性が高く、定期的にin vivoでの録音16 でブラインドに使用、最小限の出血や動物と生き残るために組織を可能にするため、脳の表面にダメージなしで完了しなければならない。練習すれば、手術と染料アプリケーションが30-45分で完了することができます。我々は成功した準備の67％で、 &quot;小細胞&quot;軸索のラベルが付いた。ほとんどの準備はわずか1または2目に見えるラベル軸索を持っているが、一部は8できるだけ多く持っている。試み119ラベル単位の、私たちは12製剤（ 表2）上に分散26台から単一ユニット記録を得た。従って、データは、25％の全体的な成功率のために標識された軸索を有する製剤の41％から採取した。 染料アプリケーションの重要な側面は、深さをラベリングされています。タングステン線の浅い挿入を洗浄AWという染料になりますAY。浸透が深すぎる場合は、ラベルの付いた軸索は、ターゲティングのために表示されません。さらに、細胞にはいくつかの機械的な損傷が十分に25、28に取り込まれるように染料のために発生する必要があります。しかし、あまりにも多くの被害は、細胞を殺すでしょう。我々は、他の染料やELP中の標識軸索（ 表3）からの録音とペアELAに染料注入を通じて順行性ラベルなどの他の方法（ 表2）で標識試み。ラベルはそれらが応答しなくなり、体細胞の損傷を持つ細胞に限られていたので、私たちは順行性ラベルが成功しなかったと仮定。さらに、シナプス前端末が邪魔されている可能性があり。これとは対照的に、逆行性標識は、これらの懸念の両方を最小限に抑えます。染料塗布量と位置が検討されて特定の回路に応じて変更することができる。最大のラベルは、我々がコーティングされたタングステン線を使用して達成する最大の色素濃度、で発生します。しかし、デと軸索を標識するそれが進んでいるようにEP予測は、染料は、タングステン針をオフに来るかもしれない。これらのケースでは、圧力注入がより適切であろう。染料の取り込みと輸送は2時間後に注射し、6時間後に注射限り遅く現れる追加ラベル軸索には早くも目に見えるある私達の準備中の標識軸索で、迅速です。従って、標識および記録が生存手術に伴う技術的な問題を排除し、一日で達成することができる。タイミングは、染料の輸送のために必要な距離に応じて、アプリケーションごとに異なります。 もう一つの重要な側面は、電極の配置である。これは、先端の目詰まりを防ぐために、ラベルの付いた軸索のサイトへの組織の近くに入ることが重要です。などELAのよう高密度組織の場合は、記録電極上に長い、細いシャンクは、周囲の組織の過剰な動きを最小限に抑えることができます。成功した記録が最初の試みは、記録が得られるまで、新たな電極を有する繰り返し又はTISS上で達成されていない場合UEは、軸索は、もはや表示された時点に中断されます。しかし、すぐに漂白光毒性を引き起こす可能性蛍光露光、の量を最小限にし、セル29-31の生理学的特性に影響を及ぼす可能性軸索の横に電極を配置することも重要である。 軸索のセグメントを正常に記録電極に吸引されると、記録が数時間にわたって得ることができる。ユニットは常に1時間未満で失われている場合、抜け軸索を防ぐために、より小さい電極チップを作って検討してください。一方、先端の小さすぎには軸索に詰まり、低い信号対雑音比、または損傷につながる可能性があります。追加の吸引ユニットのスパイク振幅の着実な減少と &#39;リターン&#39;先端が大きすぎることを示しています。多すぎると吸引軸索に取り返しのつかないダメージを与えることがあります。一つの解決策は、圧力が徐々に0に戻るように空気ラインに小さな漏れを可能にすることである。急速にイコライジング番目電子圧力が軸索を追放することが一時的な相対外側 &#39;プッシュ&#39;になります。 この技術は識別された投射ニューロンからターゲットの記録を得るための主要な利点であるが、色素を注射部位でのすべての種類の細胞によって取り込まれるように、それは、ローカル介在を区別するために有用ではありません。理論的には、別個の注入部位を持つ複数の蛍光体の使用は、この方法を拡張することを可能にすることができる。例えば、単一の対二重標識の比較回路32の2つの点で二重注射後に投射ニューロンからニューロンを区別するために使用することができる。同様に、逆行性トレーサーはキンカチョウハイボーカルセンター（HVC） は32で、最近行われたような二光子イメージングなど他の高度なイメージング技術、と組み合わせることができます。落射蛍光顕微鏡を使用しているとき、我々は唯一の1＆を解決することができたとしても、記録領域は、表面付近のものに限定されているムー、組織の最初の30ミクロンm以内の構造。しかし、この深さは、このような二光子顕微鏡33又は対物結合面状照明顕微鏡34のような他の顕微鏡技術の使用を介して拡張することができる。相対的にアクセスできないものも含め、 -それはモデル系の様々な多くの異なる回路における単一ニューロンから記録するために使用することができるので、全体として、この技術は、in vivoで神経回路の研究において重要な進歩を表している。

<table><tbody><tr><td>トリカインメタンスルホネート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>ガラミン三ヨウ化エチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>リドカイン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hickman&amp;rsquo;sリンゲル液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0.29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0.084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0.06 g/l)</td></tr><tr><td>ペリスタポンプ</td><td>Gilson または Rainin</td><td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td><td>10.0 &amp;plusmn; 1.0 rpm。または、流量計付き重力落下ライン</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>2gチューブ</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ボールミル用カーバイドドリルビット #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0.19 DIA (ビット径 = 0.48 mm)</td></tr><tr><td>低温焼灼キット</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手動マイクロマニピュレーター</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>デキストラン接合 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>濃度 2mM; 10,000MW。色素の波長は顕微鏡のフィルター設定に合わせて選択すること</td></tr><tr><td>エピ蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>微調整にはリモートフォーカスアクセサリーが有用。TRITCフィルター、または異なる色素波長の焦点面に適合する適切なフィルターを使用</td></tr><tr><td>低倍率対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>CFI Plan Achromat シリーズ, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td></tr><tr><td>高倍率対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>CFI Fluor シリーズ, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td></tr><tr><td>白色光源</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Model 190</td><td>ファイバーオプティック照明装置</td></tr><tr><td>蛍光光源</td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>低照度カメラ</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>デジタルマノメーター</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>電動マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ヘッドステージ</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>アンプ</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>絶縁パルス刺激装置</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>火炎/ブラウン式マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>本アプリケーションのプログラム設定：Heat: ramp + 1, Pull: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td></tr><tr><td>ピペットガラス</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>フィラメント付きホウケイ酸キャピラリーガラス (1 mm OD, 0.58 mm ID)</td></tr></tbody></table>

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

この方法の全体的な目標は、ニューロンの識別集団から単一ユニット応答を記録することです。 生体内では個々のニューロンから電気生理学的記録は、神経回路が自然条件下でどのように機能するか理解するために重要である。伝統的に、これらの記録は記録セルのアイデンティティは記録の開始時は不明である意味、 &#39;ブラインド&#39;行われてきた。細胞のアイデンティティはその後細胞内juxtacellular 1,2、または緩いパッチ染料の3イオン導入を介して決定することができるが、これらの記録は、機能的に不均一な細胞型と地域の特定のニューロンにあらかじめ対象とすることができません。蛍光タンパク質を視覚的に誘導単一細胞電気生理学4-6を可能にする細胞型特異的に発現させることができる。しかし、これらの遺伝のツールが利用できない者である多くのモデル系があります。でも、遺伝的にアクセス可能なモデル系で、目的のプロMOTERが不明であってもよいし、遺伝的に均一なニューロンは、投影パターンを変化させている可能性があります。同様に、ウイルスベクターは、投影ニューロンの特定の亜群7を標識するために使用されているが、この方法の使用は、毒性およびトランス-シナプス特異性の欠如によって制限される。このように、 生体内で識別される単一のニューロンから記録するために特定のプレビジュアライゼーションを提供する付加的な技術が必要とされている。ターゲットニューロンのプリビジュアライゼーションは、古典的な単細胞レコーディングはしばしば8-11極めて困難であるため困難な記録条件、特に便利です。迅速かつ選択的に標的と電気生理学的記録を取得するための視覚的な手がかりを提供し、独自の軸索投射に基づいて、特定の脳領域内の細胞の特定のサブセットを標識するためにタングステン針を使用して適用本稿で述べた新しい技術は、蛍光色素の逆行性輸送を使用しています無傷回路withiがで識別ニューロンからNAはCNS脊椎動物。 本手法の最も重要な新規な進歩は非遺伝子アクセス可能なモデル系における特定の細胞型を標的とする蛍光標識の使用である。弱電気魚は目を覚まし、行動動物12に神経回路を研究するための優れたモデルシステムである。私たちは弱い電気モルミルス科魚類の前方exterolateral核における &quot;小さなセル&quot;（ELA）によって感覚処理を研究するために、この手法を利用した。 &quot;小細胞は&quot;シナプス前スパイク13の到着時間のミリ秒以下の違いを検出するための重要な時間比較器ニューロンであることが仮定されている。しかし、このような緻密なミエリン、巻き込むシナプス、小細胞体としての解剖学的特徴は、それが極めて困難従来の方法11,14を使用して、これらの細胞から記録するために行った。ここでは、信頼性の高い、堅牢な録音ます特性を考慮し、我々の新しい方法は、選択的に準備の28％にこれらの細胞を標識することを実証electrosensory刺激に対する応答のrization。

蛍光色素ラベル解剖投影に基づくニューロンの亜集団の逆行性輸送。標識された軸索は、視覚的に対象とすることができます<em生体内で&gt;</em&gt;、識別された軸索から細胞外記録を可能にする。この手法は、ニューロンが遺伝子操作を通してラベルまたは &#39;ブラインド&#39;を使用して分離することが困難であることができない場合に記録が容易<em生体内で&gt;</em&gt;アプローチ。

本手法の総合的な目的は、特定されたニューロン集団から単一ユニット応答を記録することである。...からの生体内電気生理学的記録では、

この手順の全体的な目的は、非遺伝学的なモデルシステムにおいて、特定されたニューロン集団から生体内でシングルユニット応答を記録することです。まず、開頭術を行い、目的の脳領域を露出させます。次に、タングステン電極を用いて、標的ニューロンが投射する領域に蛍光色素を導入します。次に、色素が逆行性に輸送され、これにより投射ニューロンが選択的に標識されます。最終ステップは、個々の投射ニューロンの標識された軸索から記録を行うことです。最終的に、単一ユニット細胞外記録を用いて、無傷の回路内の中心感覚ニューロンがevoにおける感覚刺激にどのように反応するかを示します。この手法は、神経回路がシナプス入力のタイミングにおけるサブミリ秒単位の差をどのように検出するかという重要な問いに答えるのに役立ちます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、個々のニューロンや軸索、さらには遺伝学的に操作不可能な系を標的にできることです。弱電気魚は、通信やナビゲーションに電気信号を利用しています。彼らは、シナプス入力のタイミングにおける1ミリ秒未満の差を利用して、異なる魚からの信号を区別します。私たちは、彼らの電気感覚回路にある時間比較ニューロンと推定される細胞が、どのようにしてこのような微小なタイミングの差を検出できるのかを研究しました。また、この手法は、視覚や聴覚の感覚経路などの他のシステムにも適用可能です。周囲の組織に密集して埋もれていることや、細胞体の大半を覆うシナプス前終末により、これらの細胞から液体を回収することは特に困難です。ホールセル記録中の細胞内染料注入により、in vitro で単一の細胞を標識し、その軸索からの標的記録を導くことができます。同様に、細胞外染料注入後の逆行性輸送は、脳の表在領域にある投射ニューロンを選択的に標識する手段となります。これは、in vivoでのシングルユニット記録に視覚的なガイダンスを提供するために使用できます。Dコード化針を準備するには、まず、直径160 µmのタングステン線を、最終的な針先の直径が5〜50 µmになるまで電解研磨します。次に、実験の前夜に、全身麻酔を導入する前に、10,000分子量デキストラン結合Alexa Fluor色素の2 mM溶液で針先をコード化します。魚を300 mg/LのMS 222溶液を含む水槽水に入れ、背部の筋肉に3 mg/mLのflailを100 µL注入して、魚を固定し電気的に静止させます。次に、記録チャンバーに水槽水を満たし、魚を腹側を下にしてチャンバー中央のプラットフォーム上に置きます。その後、ピペットチップを口に挿入し、エアレーション済みの100 mg/L MS 222溶液を1〜2 mL/minで投与します。その後、固定棒とワックスを用いて、魚の体の両側を固定して安定させます。眼球血管の持続的な血流と正常な体色を確認し、魚の健康状態をモニタリングします。次に、プラットフォームを垂直軸に沿って回転させます。プラットフォームの一端を調整し、魚の頭部の背面の片側が水面上に露出するようにし、体のそれ以外は水に浸かったままにします。皮膚の露出している部分が乾燥するのを防ぐため、小さなキムワイプを当てます。この手順では、Qチップを用いて、頭部の露出面に0.4% lidocaineを塗布します。次に、メスを用いて、6.2 cmの魚から約3 mm × 5 mmの長方形の皮膚組織を切り出します。長方形の外側端は眼の中心に合わせます。長方形の前側端は眼の直後、内側端は正中線の直外側に位置するようにします。続いて、ピンセットを用いて矩形部分を取り除きます。さらに前方正中線に沿って2.5 mm四方に切開し、頭蓋骨を露出させます。メスを用いて余分な組織を掻き出し、露出した頭蓋骨表面を完全に清掃します。次に、キムワイプとエアダスターを用いて表面を完全に乾燥させます。続いて、瞬間接着剤を用いて、露出した頭蓋骨の前内側領域に金属製ポストを接着します。接着剤が完全に乾くまで待ちます。直径0.5 mmのボールミル超硬チップ付き歯科用ドリルを使用して、体長6.2 cmの魚の頭蓋骨上に、約2 mm × 4 mmの長方形を描きます。その後、メスとピンセットで長方形の周囲を切開します。そして、頭蓋骨を剥がします。脳を露出させるため、スプリングシザーまたは針を用いて、色素沈着した硬膜と透明な軟膜の両方を切開します。次に、切開した部分をピンセットで取り除き、前外側核と後外側核を露出させます。ここで、あらかじめ準備したDコーティング針を取り付けたマニピュレーターを、目的の軸索を含む標的領域の上に配置します。本ケースにおける後外側核では、針を組織内へ約25 µmまで迅速に刺入します。色素が15〜30秒間拡散した後、針を抜去します。必要に応じて、新しい針を用いてこの操作を繰り返してください。染料が標的領域全体に分布するように、それぞれを異なる位置に配置します。その後、ヒックマン・リンガー液を用いて腔内の過剰な染料を洗い流し、染料の取り込みと輸送のために少なくとも2時間待ちます。目的の軸索を可視化するために、魚が入った記録チャンバーを正立固定ステージ共焦点蛍光顕微鏡の対物レンズ下に配置します。呼吸用溶液を新鮮なタンク水に切り替え、同じ流速を維持します。次に、接地線の片端を露出した脳腔に配置し、もう一方の端を記録ヘッドステージの接地端に接続します。続いて、一対の記録電極を尾の基部の隣に配置します。次に、電極を差動増幅器と記録装置に接続します。電気器官放電指令（EODC）をモニターするために、低倍率で観察した脳領域の縮尺スケッチを作成し、ラベル化された軸索の正確な位置を特定するための目印として主要な血管を書き込んでおきます。まずDの配置を確認するため、明視野照明で組織全体を観察し、方向を合わせます。次に、蛍光照明下で観察します。後外側核にびまん性の標識が認められるはずです。その後、高倍率で、血管を指標にして前外側核を特定します。外径1mm、内径0.58mmのホウケイ酸キャピラリーガラスとフィラメントを用い、表面付近にある標識された軸索を探索しながら、蛍光光で照明します。シャック部分の長さが5mmで、先端径が約1〜2.4µmの記録用電極を引き出します。電極にろ過したヒックマンリンガー液を満たします。最終的なチップ抵抗値が16〜155 MΩの範囲にあることを確認してください。電極を圧力ポート付きの電極ホルダーに装着します。これをマニピュレーターに取り付けられたヘッドステージに接続します。次に、ヘッドステージをアンプに接続します。図示されていないアナログ-デジタル変換装置が、アンプとコンピュータを接続しています。その後、電極ラインに30 millibarの正圧をかけます。組織表面から、電極を軸索に向かってゆっくりと進めます。電極が軸索に近づくと、電極が軸索の隣にあるときに、正圧によって軸索にわずかですが明確な動きが生じます。テスト刺激提示中の活動を記録します。電気的なアーティファクトによって適切な記録と刺激が確認できても、活動電位は認められないはずです。電極の外向きの圧力を解除し、刺激と記録を繰り返します。次に、軽く吸引して軸索を電極内に移動させます。刺激と記録を再度繰り返します。これで、刺激に反応していくつかの活動電位が観察されるはずです。活動電位が確認できたら、加圧ラインを閉じます。目的の記録がすべて完了したら、魚が完全に麻酔状態にあることを確実にするため、タンクの水を 100 mg/L の MS 222 を含む呼吸液に戻します。魚を安楽死させる前に、少なくとも 10 分間は EODC が検出されないことを確認してください。ここでは、0.1ミリ秒、6mV/cmの単相対側陽性横方向方形パルス刺激によって誘発された5つのサンプル波形を示しています。また、ここでは、同じユニットに対して0秒時に6mV/cmの刺激を与え、75ミリ秒の記録ウィンドウを20回繰り返した際のスパイクタイミングを示すラスタープロットを示しています。持続時間の範囲は右側に記載されています。ここに示されているのは、刺激持続時間のチューニング曲線であり、刺激1回あたりのスパイク数として反応を定量化したものです。この手法で示された手術と色素注入は、適切に行えば習得後に1時間で完了させることができ、色素注入の2〜3時間後に記録を開始することが可能です。この処置を行う際は、処置後の実験動物の健康状態を注意深く観察することが重要です。さらに深い脳構造にあるニューロンから記録を行うには、2光子イメージングなどの他の手法を用いることができます。このビデオを視聴することで、特定されたニューロン集団から単一ユニット応答をラベル付けし、記録する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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