逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします

本手順の全体的な目的は、非遺伝学的モデルシステムにおいて、特定されたニューロン集団から生体内で単一ユニット応答を記録することです。まず、開頭術を行い、目的の脳領域を露出させます。次に、タングステン電極を用いて、標的ニューロンが投射する領域に蛍光色素を注入します。

次に、色素が逆行輸送され、投射ニューロンが選択的に標識されます。最終ステップでは、個々の投射ニューロンの標識された軸索から記録を行います。最終的に、単一ユニット細胞外記録を用いて、無傷の回路内にある中心感覚ニューロンが、evoでの感覚刺激に対してどのように反応するかを示します。

この手法は、神経回路がシナプス入力のタイミングにおける1ミリ秒未満の差をどのように検出するかという重要な疑問を解明するのに役立ちます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、個々のニューロンや軸索、さらには遺伝学的操作が不可能な系を標的にできる点にあります。弱電気魚は、通信とナビゲーションのために電気信号を利用しています。

彼らはシナプス入力のタイミングにおけるサブミリ秒単位の差を利用して、異なる個体からの信号を区別しています。私たちは、電気感覚回路における時間比較ニューロンと推定される細胞が、どのようにしてこのような微小なタイミングの差を検出できるのかを検討しました。また、この手法は視覚や聴覚の感覚経路などの他のシステムにも適用可能です。

周囲の組織に密に埋もれていることや、細胞体の大部分を覆うシナプス前終末、および細胞サイズの小ささのため、これらの細胞から液体を採取することは特に困難です。ホールセル記録中の細胞内色素注入は、in vitroで単一の細胞を標識し、その軸索からの標的記録を行うためのガイドとなります。同様に、細胞外色素注入後の逆行性輸送は、脳の浅層領域にある投射ニューロンを選択的に標識する手段となります。

これは、in vivoでのシングルユニット記録における視覚的なガイダンスを提供するために使用できます。Dコード針を準備するには、まず直径160 µmのタングステン線を、最終的な針先径が5〜50 µmになるまで電解研磨します。次に、実験前夜に、全身麻酔を導入する前に、10,000分子量デキストラン結合Alexa Fluor色素の2 mM溶液で針先をコーティングします。

300 mg/LのMS 222溶液を含む水槽水に魚を入れ、3 mg/mLのMS 222を100 µL背側の体筋に注入して、魚を固定し電気的に静止させます。次に、記録チャンバーに水槽水を満たし、チャンバー中央のプラットフォームの上に魚を腹側を下にして置きます。その後、ピペットチップを口に差し込み、エアレーションした100 mg/LのMS 222溶液を1〜2 mL/minで投与します。

その後、固定ロッドとワックスを用いて、魚の体の両側を固定して安定させます。眼球血管の持続的な血流と正常な体色を確認し、魚の健康状態を監視してください。その後、プラットフォームを垂直軸に沿って回転させます。

プラットフォームの一端を調整し、魚の頭部の背面の一方が水面上に出るようにし、体の残りの部分は水没させたままにします。皮膚の露出している部分が乾燥するのを防ぐため、小さなKimwipeを当てます。この手順では、綿棒を使用して、頭部の露出した表面に0.4%lidocaineを塗布します。

次に、メスを用いて、6.2 cmの魚に対して約3 mm × 5 mmの長方形の皮膚組織を切り出します。長方形の外側端は目の中心に合わせます。長方形の前側端は目のすぐ後方に、内側端は正中線のすぐ外側に位置するようにします。

続いて、ピンセットを用いて矩形部分を取り除きます。頭蓋骨を露出させるため、さらに前方の中脳付近を2.5 mm四方に切り出します。メスを用いて余分な組織を掻き取り、露出した頭蓋骨の表面を完全に清掃します。

その後、キムワイプとエアダスターを用いて表面を完全に乾燥させます。次に、瞬間接着剤を使用して、露出した頭蓋骨の前内側領域に金属製ポストを接着します。接着剤が完全に乾くまで待ちます。

直径0.5 mmのボールミル超硬チップ付き歯科用ドリルを使用し、全長6.2 cmの魚の頭蓋骨上に、約2 mm × 4 mmの長方形を描きます。その後、メスとピンセットを用いて長方形の周囲を切除します。次いで、頭蓋骨を剥離させます。

脳を露出させるため、スプリングシザーまたは針を用いて、有色の上硬膜と透明な軟膜の両方を切開します。次に、切開した部分をピンセットで取り除き、前外側核および後外側核を露出させます。ここで、あらかじめ準備したDコーティング針を装着したマニピュレーターを、目的の軸索を含む標的領域の上に配置します。

本症例における後外側核に対し、針を組織内へ約25 µm迅速に刺入します。染料が15～30秒間拡散した後、針を抜去します。必要に応じて、新しい針を用いてこの操作を繰り返します。

染料が標的領域全体に分布するように、それぞれを異なる位置に配置します。次に、キャビティから過剰な染料をヒックマンリンゲル液で洗い流し、染料の取り込みと輸送のために少なくとも2時間待ちます。目的の軸索を可視化するには、魚が入った記録チャンバーを正立固定ステージ鏡面蛍光顕微鏡の対物レンズ下に配置します。

呼吸溶液を新鮮なタンク水に切り替え、同じ流速を維持します。次に、接地線の片端を露出した脳腔に入れ、もう一方の端を記録ヘッドステージの接地端に接続します。続いて、一対の記録電極を尾の付け根の横に配置します。

次に、電極を差動増幅器と記録装置に接続します。電気器官放電指令（EODC）をモニターするため、低倍率で観察した脳領域の縮尺スケッチを作成し、標識された軸索の正確な位置を特定するためのランドマークとして主要な血管を書き込んでおきます。まず、Dの配置を確認するために、明視野照明で組織全体を観察して方向を確認します。

その後、蛍光照明下で観察します。後外側核にびまん性の標識が認められるはずです。続いて、高倍率下で血管を指標として前外側核を確認します。

外径1 mm、内径0.58 mmのホウケイ酸キャピラリーガラスとフィラメントを用い、表面付近にある標識された軸索を探しながら、蛍光光で照明します。シャンク部分が5 mmで、先端径が約1～2.4 µmの記録電極を引き出します。

ろ過したHickman's Ringer溶液を電極に充填します。最終的なチップ抵抗は16から155 MΩの範囲内である必要があります。電極を圧力ポート付きの電極ホルダーに設置してください。

マニピュレーターに取り付けられたヘッドステージに接続します。次に、ヘッドステージをアンプに接続します。図には示されていませんが、アナログ-デジタル変換装置を介してアンプとコンピューターが接続されます。

その後、電極ラインに30 millibarの正圧をかけます。組織表面から軸索に向かって、電極をゆっくりと進めます。電極が軸索に近づくと、電極が軸索の隣にある間に、正圧によって軸索にわずかではあるが明確な動きが生じます。

テスト刺激の提示中の活動を記録します。電気的なアーティファクトによって適切な記録と刺激が確認されますが、活動電位は認められないはずです。電極の外圧を解除し、刺激と記録を繰り返します。

次に、わずかに吸引し、軸索を電極内に引き込みます。刺激と記録を再度繰り返してください。これで、刺激に応答していくつかの活動電位が観察されるはずです。

活動電位が確認できたら、圧力ラインを閉じます。必要な記録がすべて完了したら、タンクの水を、魚が完全に麻酔されるようにMS 222を100 mg/L添加した呼吸液に戻します。魚を安楽死させる前に、少なくとも10分間はEODCが検出されないことを確認してください。

ここでは、0.1ミリ秒、6mV/cmの単相対側陽性横断方形パルス刺激によって誘発された活動電位を示す5つのサンプルトレースを示し、また、同一ユニットに対して0秒時に6mV/cmの刺激を与えた際の、75ミリ秒の記録ウィンドウを20回繰り返した時のスパイクタイミングを示すラスタープロットを示します。持続時間の範囲は右側に記載されています。ここでは、刺激持続時間チューニング曲線として、刺激反復あたりのスパイク数で応答を定量化したものを表示しています。

この手法で示された手術および色素注入に習熟し、適切に実施すれば、1時間で完了させることができ、色素注入の2〜3時間後に記録を開始することが可能です。この手順を行う際は、術後の実験動物の健康状態を慎重に観察することが重要です。さらに深い脳構造にあるニューロンから記録を行うには、2光子イメージングなどの他の手法を用いることができます。

このビデオを視聴することで、同定されたニューロン集団から単一ユニットの反応をラベル付けし、記録する方法について十分に理解することができます。