逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします

この手順の全体的な目標は、非遺伝的モデルシステム内の特定されたニューロン集団からのin vivoでの単一単位応答を記録することです。これは、最初に開頭術を行い、関心のある脳領域を露出させることによって達成されます。2番目のステップは、タングステンワイヤーを使用して、ターゲットニューロンが投射する領域に蛍光色素を配置することです。

次に、色素は逆行性輸送され、その結果、投射ニューロンの選択的標識が行われます。最後のステップは、個々の投射ニューロンの標識された軸索から記録することです。最終的に、単一ユニットの細胞外記録を使用して、無傷の回路の中枢感覚ニューロンがevoの感覚刺激にどのように応答するかを示します。

この方法は、ニューロ回路がシナプス入力のタイミングのサブミリ秒の違いをどのように検出するかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法が既存の方法よりも優れている点は、個々のニューロンや軸索、さらには遺伝的にアクセスできないシステムを標的にできることです。毎週の電気魚は、通信とナビゲーションに電気信号を使用します。

彼らは、シナプス入力のタイミングのミリ秒未満の差を使用して、さまざまな魚からの信号を区別します。私たちは、電気感覚回路の推定時間比較ニューロンが、どのようにしてこのような小さなタイミングの違いを検出できるのかを尋ねました。しかし、この手法は、視覚や聴覚の感覚経路などの他のシステムにも適用できます。

この細胞から液体を出すことは特に困難であるのは、周囲の組織における小さなサイズの密集したミアリングと、全細胞記録中の細胞内色素注入中の細胞腹の大部分を覆うシナプス前末端のためである。In vitroでは、その軸索からの標的記録をガイドするために、単一の細胞を標識します。同様に、細胞外色素注入後の逆行性輸送は、脳表在領域の投射ニューロンを選択的に標識する手段を提供します。

これは、in vivo 単一ユニット記録の視覚的なガイダンスを提供するために使用できます。Dコード針を準備するには、まず、直径160マイクロメートルのタングステンワイヤーを最終的な針先直径5〜50マイクロメートルまで電解的に研ぎます。その後、実験の前夜に、全身麻酔を誘発するために、10, 000分子量のデキストラン結合Alexa床染料の2ミリモル溶液で針先をコード化します。

魚をMS 2 22溶液で300ミリグラム/リットルの水槽水に入れ、100マイクロリットルのフレイルを1ミリリットルあたり3ミリグラムで背体の筋肉組織に注入することにより、魚を固定し、電気的に沈黙させます。次に、記録チャンバーにタンクの水を入れ、魚の腹側を下にしてチャンバーの中央にあるプラットフォームに置きます。次に、通気したMS 2 22溶液を1リットルあたり100ミリグラムで、ピペットチップを口に入れて1分あたり1〜2ミリリットルで送達します。

その後、体の両側に固定ロッドとワックスで魚を安定させます。眼血管内の継続的な血流と正常な体色をチェックして、魚の健康状態を監視します。次に、垂直軸に沿ってプラットフォームを回転させます。

プラットフォームの一方の端を調整して、魚の頭の背側の片側が水面上に露出し、魚の体の残りの部分が水没したままになるようにします。乾燥を防ぐために、皮膚の非水没部分にキムワイプの小片を置きます。この手順では、Qチップを使用して頭の露出面に0.4%リドカインを塗布します。

次に、メスの刃を使用して、6.2センチの魚の約3ミリメートル×5ミリメートルの長方形の皮膚組織片を切り取ります。長方形の横方向の端は、目の中心に揃える必要があります。四角形の前方の端は目の後方にあり、四角形の内側の端は正中線のすぐ外側にある必要があります。

次に、一対の鉗子を使用して長方形を取り外します。さらに2.5ミリメートル四方の前方に切り込みを入れて、頭蓋骨を露出させます。メスの刃を使用して余分な組織をこすり落とし、頭蓋骨の露出面を完全に取り除きます。

次に、キムワイプと強制空気で表面を完全に乾かします。次に、金属製の支柱を前方内側に露出した頭蓋骨領域に瞬間接着剤で接着します。接着剤が完全に乾くまで待ちます。

直径0.5ミリメートルのボールミルカーバイドチップを備えたデンタルドリルを使用して、6.2センチメートルの魚の頭蓋骨に約2ミリメートル×4ミリメートルの長方形を描きます。その後、メスと鉗子で長方形の周囲を切り取ります。次に、頭蓋骨を剥がします。

脳を露出させるには、スプリングハサミまたは針を使用して、色素沈着した硬膜と透明な硬膜の両方を切断します。次に、一対の鉗子で切断された部分を切除して、前外側外側核と後外側外側核を露出させます。次に、以前に準備したDコーティングされた針を備えたマニピュレータを、目的の軸索を含む標的領域の上に配置します。

私たちの場合の後外側外側核は、針を組織に約25マイクロメートルすばやく挿入します。染料が15〜30秒間拡散した後、針を引っ込めます。必要に応じて、追加の新しい針で繰り返します。

それぞれを異なる場所に配置して、色素がターゲット領域全体に分布するようにします。次に、余分な色素をヒックマンリンガー溶液でキャビティから洗い流し、色素の取り込みと輸送を少なくとも2時間待ちます。目的の軸索を視覚化するには、魚が付着した記録チャンバーを直立固定ステージ落射蛍光顕微鏡の対物レンズの下に配置します。

呼吸液を真水タンクの水に切り替え、同じ流量を維持します。次に、アース線の一方の端を露出した脳腔に配置し、もう一方の端を記録ヘッドステージのアースに接続します。次に、尾の付け根の隣に一対の記録電極を配置します。

次に、電極を差動増幅器と記録デバイスに接続します。電気臓器放電コマンド(EODC)を監視するには、標識された軸索の正確な位置を特定するための目印として主要な血管を含む、低倍率で見た脳領域のスケーリングスケッチを準備します。最初にDの配置を確認するには、方向付けのために明視野照明で組織全体を表示します。

その後、蛍光灯で表示します。後外側核はびまん性標識を示すはずです。その後、高倍率で、血管を目印として前外側核を見つけます。

外径1mm、内径0.58mmで表面付近の標識軸索を探しながら蛍光灯で照らします。フィラメント付きケイ酸ホウ素キャピラリーガラス。長さ5ミリメートルの細いシャンクと先端の直径が約1〜2.4マイクロメートルの記録電極を引っ張ります。

電極にろ過されたヒックマンリンガー溶液を充填します。最終的なチップ抵抗は、16〜155メガオームの範囲である必要があります。電極を圧力ポート付きの電極ホルダーに入れます。

マニピュレーターに取り付けられたヘッドステージに接続します。次に、ヘッドステージをアンプに接続します。図に示されていないアナログ-デジタル集録デバイスは、アンプをコンピュータに接続します。

その後、電極ラインに30ミリバールの正圧を加えます。電極を組織表面から軸索に向かってゆっくりと進めます。電極が軸索に近いため、電極が軸索の隣にある間、正圧によって軸索がわずかに、しかし目立った動きを引き起こすはずです。

テスト刺激の提示中の活動を記録します。電気的アーチファクトは適切な記録と刺激を確認しますが、活動電位は存在しないはずです。電極内の外圧を逃がし、刺激と記録を繰り返します。

次に、わずかに吸引力を加えて、軸索を電極に移動します。刺激と録音を再度繰り返します。これで、刺激に反応していくつかの活動電位が見られるはずです。

活動電位が見えたら、圧力ラインを閉じます。必要な記録がすべて完了したら、水槽の水をMS 2 22で1リットルあたり100ミリグラムの呼吸溶液に戻し、魚が完全に麻酔されていることを確認します。魚を安楽死させる前に、少なくとも10分間EODCが検出されることはありません。

ここでは、0.1ミリ秒の6ミリボルト/センチメートルの単相対側の正の横方方パルス刺激によって誘発される活動電位を示す5つのサンプルトレースを示し、また、6ミリボルト/センチメートルの刺激で時間ゼロで刺激された同じユニットの75ミリ秒の記録ウィンドウの20回の繰り返し中のスパイク時間を示すラスタープロットを示します。デュレーションの範囲は右側にリストされています。ここに示されているのは、刺激の繰り返しごとに応答をスパイクとして定量化する刺激持続時間調整曲線です。

この技術で示されている手術や色素注入は、一度習得すれば1時間で行うことができ、色素注入の2〜3時間後に録音を開始することができます。この手順を試みるときは、この手順に従って実験動物の健康状態を注意深く監視することを覚えておくことが重要です。2光子イメージングのような他の方法は、さらに深い脳構造のニューロンから記録するために実行できます。

このビデオを見れば、特定されたニューロン集団からの単一ユニット応答をラベル付けして記録する方法について十分に理解できるはずです。