逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします
June 26th, 2013
蛍光色素ラベル解剖投影に基づくニューロンの亜集団の逆行性輸送。標識された軸索は、視覚的に対象とすることができます、識別された軸索から細胞外記録を可能にする。この手法は、ニューロンが遺伝子操作を通してラベルまたは 'ブラインド'を使用して分離することが困難であることができない場合に記録が容易アプローチ。
この手順の全体的な目標は、非遺伝的モデルシステム内の特定されたニューロン集団からのin vivoでの単一単位応答を記録することです。これは、最初に開頭術を行い、関心のある脳領域を露出させることによって達成されます。2番目のステップは、タングステンワイヤーを使用して、ターゲットニューロンが投射する領域に蛍光色素を配置することです。
次に、色素は逆行性輸送され、その結果、投射ニューロンの選択的標識が行われます。最後のステップは、個々の投射ニューロンの標識された軸索から記録することです。最終的に、単一ユニットの細胞外記録を使用して、無傷の回路の中枢感覚ニューロンがevoの感覚刺激にどのように応答するかを示します。
この方法は、ニューロ回路がシナプス入力のタイミングのサブミリ秒の違いをどのように検出するかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法が既存の方法よりも優れている点は、個々のニューロンや軸索、さらには遺伝的にアクセスできないシステムを標的にできることです。毎週の電気魚は、通信とナビゲーションに電気信号を使用します。
彼らは、シナプス入力のタイミングのミリ秒未満の差を使用して、さまざまな魚からの信号を区別します。私たちは、電気感覚回路の推定時間比較ニューロンが、どのようにしてこのような小さなタイミングの違いを検出できるのかを尋ねました。しかし、この手法は、視覚や聴覚の感覚経路などの他のシステムにも適用できます。
この細胞から液体を出すことは特に困難であるのは、周囲の組織における小さなサイズの密集したミアリングと、全細胞記録中の細胞内色素注入中の細胞腹の大部分を覆うシナプス前末端のためである。In vitroでは、その軸索からの標的記録をガイドするために、単一の細胞を標識します。同様に、細胞外色素注入後の逆行性輸送は、脳表在領域の投射ニューロンを選択的に標識する手段を提供します。
これは、in vivo 単一ユニット記録の視覚的なガイダンスを提供するために使用できます。Dコード針を準備するには、まず、直径160マイクロメートルのタングステンワイヤーを最終的な針先直径5〜50マイクロメートルまで電解的に研ぎます。その後、実験の前夜に、全身麻酔を誘発するために、10, 000分子量のデキストラン結合Alexa床染料の2ミリモル溶液で針先をコード化します。
魚をMS 2 22溶液で300ミリグラム/リットルの水槽水に入れ、100マイクロリットルのフレイルを1ミリリットルあたり3ミリグラムで背体の筋肉組織に注入することにより、魚を固定し、電気的に沈黙させます。次に、記録チャンバーにタンクの水を入れ、魚の腹側を下にしてチャンバーの中央にあるプラットフォームに置きます。次に、通気したMS 2 22溶液を1リットルあたり100ミリグラムで、ピペットチップを口に入れて1分あたり1〜2ミリリットルで送達します。
その後、体の両側に固定ロッドとワックスで魚を安定させます。眼血管内の継続的な血流と正常な体色をチェックして、魚の健康状態を監視します。次に、垂直軸に沿ってプラットフォームを回転させます。
プラットフォームの一方の端を調整して、魚の頭の背側の片側が水面上に露出し、魚の体の残りの部分が水没したままになるようにします。乾燥を防ぐために、皮膚の非水没部分にキムワイプの小片を置きます。この手順では、Qチップを使用して頭の露出面に0.4%リドカインを塗布します。
次に、メスの刃を使用して、6.2センチの魚の約3ミリメートル×5ミリメートルの長方形の皮膚組織片を切り取ります。長方形の横方向の端は、目の中心に揃える必要があります。四角形の前方の端は目の後方にあり、四角形の内側の端は正中線のすぐ外側にある必要があります。
次に、一対の鉗子を使用して長方形を取り外します。さらに2.5ミリメートル四方の前方に切り込みを入れて、頭蓋骨を露出させます。メスの刃を使用して余分な組織をこすり落とし、頭蓋骨の露出面を完全に取り除きます。
次に、キムワイプと強制空気で表面を完全に乾かします。次に、金属製の支柱を前方内側に露出した頭蓋骨領域に瞬間接着剤で接着します。接着剤が完全に乾くまで待ちます。
直径0.5ミリメートルのボールミルカーバイドチップを備えたデンタルドリルを使用して、6.2センチメートルの魚の頭蓋骨に約2ミリメートル×4ミリメートルの長方形を描きます。その後、メスと鉗子で長方形の周囲を切り取ります。次に、頭蓋骨を剥がします。
脳を露出させるには、スプリングハサミまたは針を使用して、色素沈着した硬膜と透明な硬膜の両方を切断します。次に、一対の鉗子で切断された部分を切除して、前外側外側核と後外側外側核を露出させます。次に、以前に準備したDコーティングされた針を備えたマニピュレータを、目的の軸索を含む標的領域の上に配置します。
私たちの場合の後外側外側核は、針を組織に約25マイクロメートルすばやく挿入します。染料が15〜30秒間拡散した後、針を引っ込めます。必要に応じて、追加の新しい針で繰り返します。
それぞれを異なる場所に配置して、色素がターゲット領域全体に分布するようにします。次に、余分な色素をヒックマンリンガー溶液でキャビティから洗い流し、色素の取り込みと輸送を少なくとも2時間待ちます。目的の軸索を視覚化するには、魚が付着した記録チャンバーを直立固定ステージ落射蛍光顕微鏡の対物レンズの下に配置します。
呼吸液を真水タンクの水に切り替え、同じ流量を維持します。次に、アース線の一方の端を露出した脳腔に配置し、もう一方の端を記録ヘッドステージのアースに接続します。次に、尾の付け根の隣に一対の記録電極を配置します。
次に、電極を差動増幅器と記録デバイスに接続します。電気臓器放電コマンド(EODC)を監視するには、標識された軸索の正確な位置を特定するための目印として主要な血管を含む、低倍率で見た脳領域のスケーリングスケッチを準備します。最初にDの配置を確認するには、方向付けのために明視野照明で組織全体を表示します。
その後、蛍光灯で表示します。後外側核はびまん性標識を示すはずです。その後、高倍率で、血管を目印として前外側核を見つけます。
外径1mm、内径0.58mmで表面付近の標識軸索を探しながら蛍光灯で照らします。フィラメント付きケイ酸ホウ素キャピラリーガラス。長さ5ミリメートルの細いシャンクと先端の直径が約1〜2.4マイクロメートルの記録電極を引っ張ります。
電極にろ過されたヒックマンリンガー溶液を充填します。最終的なチップ抵抗は、16〜155メガオームの範囲である必要があります。電極を圧力ポート付きの電極ホルダーに入れます。
マニピュレーターに取り付けられたヘッドステージに接続します。次に、ヘッドステージをアンプに接続します。図に示されていないアナログ-デジタル集録デバイスは、アンプをコンピュータに接続します。
その後、電極ラインに30ミリバールの正圧を加えます。電極を組織表面から軸索に向かってゆっくりと進めます。電極が軸索に近いため、電極が軸索の隣にある間、正圧によって軸索がわずかに、しかし目立った動きを引き起こすはずです。
テスト刺激の提示中の活動を記録します。電気的アーチファクトは適切な記録と刺激を確認しますが、活動電位は存在しないはずです。電極内の外圧を逃がし、刺激と記録を繰り返します。
次に、わずかに吸引力を加えて、軸索を電極に移動します。刺激と録音を再度繰り返します。これで、刺激に反応していくつかの活動電位が見られるはずです。
活動電位が見えたら、圧力ラインを閉じます。必要な記録がすべて完了したら、水槽の水をMS 2 22で1リットルあたり100ミリグラムの呼吸溶液に戻し、魚が完全に麻酔されていることを確認します。魚を安楽死させる前に、少なくとも10分間EODCが検出されることはありません。
ここでは、0.1ミリ秒の6ミリボルト/センチメートルの単相対側の正の横方方パルス刺激によって誘発される活動電位を示す5つのサンプルトレースを示し、また、6ミリボルト/センチメートルの刺激で時間ゼロで刺激された同じユニットの75ミリ秒の記録ウィンドウの20回の繰り返し中のスパイク時間を示すラスタープロットを示します。デュレーションの範囲は右側にリストされています。ここに示されているのは、刺激の繰り返しごとに応答をスパイクとして定量化する刺激持続時間調整曲線です。
この技術で示されている手術や色素注入は、一度習得すれば1時間で行うことができ、色素注入の2〜3時間後に録音を開始することができます。この手順を試みるときは、この手順に従って実験動物の健康状態を注意深く監視することを覚えておくことが重要です。2光子イメージングのような他の方法は、さらに深い脳構造のニューロンから記録するために実行できます。
このビデオを見れば、特定されたニューロン集団からの単一ユニット応答をラベル付けして記録する方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、体内特定されたニューロンからの単一ユニット応答を記録するための方法を、蛍光色素の逆行性輸送を用いて提示します。この技術により、投射ニューロンの選択的なラベリングが可能となり、遺伝子工学以外のモデルシステムでの標的外細胞記録が容易になります。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 神経回路
背景
- 特定のニューロンからの記録は、神経回路を理解する上で重要です。
- 従来の方法では、遺伝子工学以外のシステムでニューロンを効果的にラベル付けできないことがあります。
- 蛍光色素を使用して、解剖学的投射に基づいてニューロンをラベル付けできます。
- このアプローチは、特に電気魚の感覚ニューロンを研究するのに有用です。
研究の目的
- 特定されたニューロンからの体内記録の技術を開発すること。
- 感覚ニューロンが刺激にどのように反応するかを調査すること。
- 複雑な組織内の個々のニューロンを標的とする能力を向上させること。
使用した方法
- 脳の興味領域を露出するための開頭術。
- 投射ニューロンをラベル付けするために、標的領域に蛍光色素を注入すること。
- 正確な色素配置のためにタングステン線の使用。
- ラベル付けされた軸索からの神経応答を評価するための外細胞記録。
主な結果
- 色素の逆行性輸送を用いた投射ニューロンの成功的なラベリング。
- 特定されたニューロンからの単一ユニット応答を記録する能力。
- 感覚回路のタイミングの違いを研究するための技術の適用性を実証。
- 体内標的記録のための視覚的ガイダンスの提供。
結論
- この方法により、遺伝子工学以外のシステムで特定のニューロンからの標的記録が可能になります。
- このアプローチは、電気魚以外の様々な感覚経路にも適用できます。
- 複雑な組織環境において、従来の方法に比べて大きな利点を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
