膵β細胞によるインスリン分泌に影響を及ぼす細胞外タンパク質相互作用の共培養分析
June 15th, 2013
経細胞タンパク質相互作用は、膵臓β-細胞機能の重要な決定因子である。法適応特定貫通タンパク質がインスリン分泌にどのように影響するかを調査するためのシナプス-の共培養モデルからは、ここで詳しく説明します。トランスフェクトしたHEK293細胞は、目的のタンパク質を発現し、β細胞は、トランスフェクションまたは他の方法で直接摂動する必要はありません。
この手順の全体的な目標は、特定の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインが関与する細胞間相互作用がベータ細胞機能、より具体的にはインスリン分泌にどのように影響するかを調査することです。これは、第1のステップで、第2のステップで目的のタンパク質を含有するプラスミドを有する哺乳動物細胞株をトランセクトすることによって達成される。ベータ細胞株は、哺乳動物細胞と共培養されます。
最終ステップでは、グルコース刺激によるインスリン分泌の評価を可能にするために、共培養物を異なるグルコース濃度の培地でインキュベートします。最終的に、インスリン無線イムノアッセイまたはElizaのイライザは、培養ベータ細胞によって培地に分泌されるインスリンのレベルを評価するために使用されます。この手法は、遺伝子の過剰発現やノックダウンなどの既存の方法よりも優れている点として、mRNAやタンパク質発現の摂動を回避し、β細胞の健康や機能に影響を与える可能性のある方法で、タンパク質の特異的相互作用の解析を混乱させる可能性があることです。
まず、HEC 2 93細胞をウェルあたり0.5ミリリットルのHEC 2 93培地中の24ウェルプレートに移し、細胞がプレートの底部に均等に広がるようにします。プレートを一度に1つの軸に沿って、ウェル内に形成された波に同期した速度で振とうします。HEC 2 93細胞が100%coの流暢さに達したら、2マイクロリットルのリポ2000で目的のタンパク質をコードするプラスミド0.8マイクログラムで培養物をトランスフェクションします。
脂肪酸プロトコールによれば、実証されようとしている共培養の全体的なスキームが、非酵素的細胞除去剤を使用してここに描かれている。このステップは、T 75培養フラスコの底からINS 1細胞を約70〜80%の流暢度で回収することから始めます。室温で150Gで細胞を3分間スピンダウンした後、P 1000ピペットを使用して、ペレットを1ミリリットルの半分のINS1と半分に再懸濁します。
次に、培地は10ミリリットルのピペットを使用して、さらに24ミリリットルの混合培地を追加し、細胞を懸濁し、HEC 2 9 3細胞を含む24ウェルプレートのウェルから培地を吸引します。次に、P 1000ピペットを使用して、ウェルの側面に沿ったHEXセル層に500マイクロリットルのINS Oneセル懸濁液を静かに加えます。6ウェルごとに、10ミリリットルのピペットを使用してINS 1細胞を再懸濁します。
再び均質な細胞懸濁液を確保するため。次に、実験プロトコルに応じて、細胞を24〜48時間インキュベートします。細胞を所望の実験期間、一度に1ウェルずつインキュベートした後、片手で共培養培地を吸引し、すぐに培地をクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液中の250マイクロリットルの2.5ミリモルグルコースに交換します。
共培養物を1時間事前にインキュベートした後、低グルコースKRB緩衝液を2.5ミリモルまたは20ミリモルグルコースの250マイクロリットルと交換します。さらに1時間のインキュベーション後、KRBバッファーをマイクロフュージチューブに移し、チューブを遠心分離機に入れた状態で、バッファーを1500Gおよび摂氏4度で5分間スピンダウンします。直ちに100マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤を含むリッパ細胞溶解緩衝液をプレートに加え、プレートを摂氏4度で20分間インキュベートします。
チューブの回転が終了したら、200マイクロリットルの上清を取り除き、後でインスリンラジオイムノアッセイまたはエリザで分析します。.最後に、10, 000 gsで15分間細胞溶解物であるものをスピンダウンし、次にインスリンラジオイムノアッセイまたはイライザによる分析のためにSNATの50マイクロリットルを除去します。ここでは、INS one β細胞をHC2 93細胞と共培養して、ここでNLXと呼ばれる神経リゲンアイソフォームを発現するようにトランスフェクションして得られた結果を示す。
NLXの発現は、共培養されたI NS1細胞によって基礎および刺激されたインスリン分泌を増加させました。NX細胞外ドメインは、INS one細胞がより多くのインスリンを分泌するように、I NS one細胞表面上の別のタンパク質または分子と相互作用している必要があります。共培養システムを使用した他のタイプの分析の結果は、次の2つのグラフに示されています。
この最初のグラフでは、NLYによる共培養INS1細胞のインスリン含量の増加が示されています。一方、この実験では、RNAを細胞層から採取し、R-T-Q-P-C-Rで分析しました。NLYとの共培養により、インスリンとPDX one mRNAのレベルが上昇しました。
この手順に続いて、QPCRや定量的免疫組織化学などの追加の方法を実行して、トランスフェクションされたタンパク質の細胞外相互作用が細胞構造や遺伝子発現の変化を引き起こすかどうかなどの追加の質問に答えることができます。
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概要
この研究は、膵臓ベータ細胞機能における細胞間タンパク質相互作用、特にインスリン分泌における役割を調査します。この方法には、特定の膜貫通タンパク質の影響を評価するために、トランスフェクトされたHEK293細胞とベータ細胞の共培養が含まれます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 内分泌学
背景
- 細胞間相互作用はベータ細胞の機能に不可欠です。
- インスリン分泌はこれらの相互作用の影響を受ける重要なプロセスです。
- 既存の方法はベータ細胞の健康を乱し、分析を複雑にする可能性があります。
- この研究は、より洗練されたアプローチを提供することを目指しています。
研究目的
- 特定の膜貫通タンパク質がインスリン分泌にどのように影響するかを調査すること。
- 共培養モデルを使用してベータ細胞への直接的な撹乱を最小限に抑えること。
- グルコース濃度のインスリン放出への影響を評価すること。
使用された方法
- タンパク質の興味関心を含むプラスミドでHEK293細胞をトランスフェクトすること。
- トランスフェクトされたHEK293細胞とベータ細胞の共培養。
- 異なるグルコース濃度の培地で共培養をインキュベートすること。
- インスリン放出を測定するために、インスリン放射免疫測定法またはELISAを使用すること。
主な結果
- 特定の膜貫通タンパク質がインスリン分泌に影響を与えることを実証しました。
- グルコース濃度が共培養細胞のインスリン放出に影響を与えることを示しました。
- 従来の撹乱技術と比較して、この方法の有効性を確認しました。
- ベータ細胞機能のメカニズムについての洞察を提供しました。
結論
- 共培養方法により、ベータ細胞の健康を乱すことなくタンパク質相互作用の研究が可能になります。
- 得られた洞察は、糖尿病とベータ細胞機能に関する将来の研究に情報を提供する可能性があります。
- このアプローチはインスリン分泌メカニズムのより良い理解につながる可能性があります。
