遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

この手順の全体的な目的は、タンパク質とDNAの相互作用の検証、遺伝子発現の転写調節因子の探索、および新規抗腫瘍剤の同定に有用な定量DNA結合アッセイを実演することです。これは、まず適切なビオチン化DNAターゲットを用いてストレプトアビジンコーティングアッセイプレートを調製することで達成されます。次のステップでは、潜在的な阻害剤の有無にかかわらず核抽出タンパク質を添加し、それらをDNAターゲットに結合させます。

次に、結合した転写因子を一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体を用いて検出します。最終ステップとして、発色させるためにHRP基質をウェルに添加します。最終的に、分光光度計を用いて発色強度を測定します。

時間の経過とともに、色の変化量によってDNA結合の程度およびDNA結合の潜在的な阻害剤の効果が示されます。電気泳動移動度シフトアッセイなどの他の手法に対する本手法の主な利点は、定量的なDNA阻害剤結合アッセイであることです。まず、試験する各条件について、少なくとも3×10⁷個の細胞で構成される十分な数の細胞培養物を準備します。

ここでは、run X2タンパク質を発現しているヒト骨髄内皮細胞を使用します。細胞が80%コンフルエントになったら、0.2 µg/mLのノコダゾールで細胞を処理し、細胞周期のG2/M境界で細胞増殖を停止させます。

これにより RunX2タンパク質が安定化し、16時間後に最大のDNA結合能が得られます。付随するテキストプロトコルの指示に従って細胞を溶解し、タンパク質を単離してください。タンパク質の単離後、標準的なBCAアッセイを用いてタンパク質濃度を測定します。

その後、サンプルを2〜5 mg/mLの濃度で10 µLずつ分注し、-80 °Cで保存します。0.1 M炭酸ナトリウム溶液を用いて96ウェルプレートを固定します。各ウェルに混合液を300 µLずつ加えます。各サンプルを3連（triplicate）で測定できるよう、十分な数のウェルを準備してください。

プレートを室温のロッキングプラットフォーム上で2時間インキュベートします。その後、300 µLのstrep avidおよび洗浄バッファーでプレートを3回洗浄し、1ウェルあたり1.25 nMのビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチド100 µLを加え、ロッキングしながら2時間インキュベートします。次に、strep din洗浄バッファーでプレートをさらに3回洗浄します。

次に、1X DNA結合バッファー、3〜9 µg/wellのDNA結合タンパク質、および1 µg/wellのpoly DIGCを含むマスターミックスを、1ウェルあたり100 µLずつ加えます。続いて、ビタミンD3などの潜在的な阻害剤、またはエタノールなどの溶媒コントロールの適切な希釈液を含むマスターミックスを、それぞれのウェルに加えます。その後、プレートに蓋をし、核抽出液でインキュベートした後、4 °Cのロッキングプラットフォームで一晩静置します。

プレートをstrep avidおよび洗浄バッファーで3回洗浄します。次に、0.2 ng/µLに希釈したrun X 2特異的モノクローナル抗体をstrep avidおよび洗浄バッファーで調製し、1ウェルあたり90 µLずつ加えます。プレートに蓋をし、ロッキングプラットフォーム上で室温にて1時間インキュベートします。

次に、ウェルをstrep avidおよび洗浄バッファーで再度リンスし、strep AVIDおよび洗浄バッファーで希釈した5 ng/µLのFab特異的アフィニティー精製HRP標識抗体を含む二次抗体混合液を、1ウェルあたり90 µLずつ添加します。二次抗体を室温で30分間、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。

次に、各ウェルに300 µLのStrpおよび洗浄バッファーを用いて6回洗浄します。続いて、サンプルの連続モニタリングを行うため、ストックボトルから各ウェルに50 µLのテトラエチルベンジジン基質を直接添加し、結果を発色させます。サンプルを分光光度計にセットし、635 nmにおける吸光度を連続的に測定します。

単回測定を行う場合は、サンプルを室温・暗所にて10～20分間インキュベートします。この間に、ウェルが透明からさまざまな程度の青色に変化します。各ウェルに50 µLの硫酸を加えて反応を停止させます。

次に、96ウェルプレートリーダーを用いて、各ウェルの450ナノメートルにおける吸光度を測定します。ここに示すグラフは、生物学的に活性なビタミンD3がrun X 2D NA結合に及ぼす影響を継続的にモニタリングした例です。テストした濃度では、run X 2D NA結合への影響はほとんど見られませんでした。

他のビタミンD3化合物においても劇的な効果が示されていますが、本研究で試験した化合物 5 2 2 1 9 7 5 は、コンピュータ支援薬物設計を用いて同定されました。試験の結果、この化合物は 1 nanomolar から 100 micromolar の範囲で rux two の結合を濃度依存的に抑制し、わずか 0.01 micromolar の化合物で renx 2D NA 結合の 50% を抑制することができました。

このビデオを視聴することで、DNA結合アッセイの実施方法およびDNA結合の潜在的な阻害剤を試験する方法について、十分に理解できるはずです。