遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ
2013年8月31日
我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。
この手順の全体的な目標は、タンパク質DNA相互作用の調査、遺伝子発現の転写調節因子の発見、および新規抗腫瘍剤の同定に役立つ定量的DNA結合アッセイを実証することです。これは、まず、適切なビオチン化DNAターゲットを持つストレプトアビジンコーティングアッセイプレートを調製することによって達成されます。第2のステップは、潜在的な阻害剤の有無にかかわらず核抽出タンパク質を添加し、それらをDNAターゲットと結合させることです。
次に、結合した転写因子を一次抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体で検出します。最後のステップは、発色を引き出すために、ウマダイサビペルオキシダーゼ基質をウェルに添加することです。最終的に、発色は分光光度計で測定されます。
時間の経過とともに、色の変化の量は、DNA結合の程度とDNA結合の潜在的な阻害剤の影響を示します。この技術が電気泳動移動度シフトアッセイなどの他の技術よりも優れている主な利点は、定量的なDNA阻害剤結合アッセイであることです。まず、試験する各条件について、少なくとも10〜7個の細胞の3倍からなる適切な数の細胞培養物を調製します。
ここでは、run X twoタンパク質を発現するヒト骨髄内皮細胞が使用されています。セルが80%コンフルエントになったら。G、2 M細胞周期境界での細胞増殖を阻止するコナゾールなし、ミリリットルあたり0.2マイクログラムで細胞を処理します。
これにより、run X two タンパク質が安定化し、16 時間後に最大の DNA 結合が生成されます。細胞を溶解し、添付のテキストプロトコルの指示に従ってタンパク質を単離します。タンパク質が単離されたら、標準的なBCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
次に、サンプルを摂氏マイナス80度で、10マイクロリットルのアリコートに1ミリグラム/ミリリットルあたり2〜5ミリグラムの濃度で保存します。96ウェルプレートを炭酸ナトリウムの0.1モル溶液で固定し、300マイクロリットルの混合物を加えます。よく各サンプルが三重に実行されるように十分に準備します。
プレートを室温のロッキングプラットホームで2時間インキュベートします。次に、プレートを300マイクロリットルの連鎖球菌酸溶出剤で3回洗浄し、バッファーを洗浄し、100マイクロリットルのビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチドと1ウェルあたり1.25ナノモルで2時間、揺さぶりながらインキュベートします。次に、溶連菌性Din洗浄バッファーでプレートをさらに3回洗浄します。
次いで、1ウェルあたり3〜9マイクログラムのXDNA結合バッファーDNA結合タンパク質およびウェルあたり1マイクログラムのポリDIGCを含むマスターミックスのウェルあたり100マイクロリットルを添加する。次に、ビタミンD 3などの潜在的な阻害剤を含むマスターミックス、またはエタノールなどの溶媒コントロールの適切な希釈をそれぞれのウェルに加えます。次に、プレートを覆い、核抽出物とのインキュベーション後、一晩で摂氏4度のロッキングプラットフォームに置きます。
連鎖球菌と洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。次に、0.2ナノグラム/マイクロリットルに希釈したラン×2の特異的モノクローナル抗体と連鎖球菌アビッドおよび洗浄バッファーのウェルあたり90マイクロリットルを追加します。プレートを覆い、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間インキュベートします。
次に、ウェルを連鎖球菌と洗浄バッファーで再度すすぎ、溶連菌で希釈した5ナノグラム/マイクロリットルのファブ特異的アフィニティー精製HRP標識抗体を含む二次抗体混合物のウェルあたり90マイクロリットルを追加します。AVIDおよび洗浄バッファー。二次抗体をロッキングプラットフォーム上で室温で30分間インキュベートします。
次に、Strpのウェルあたり300マイクロリットルで6回洗浄し、バッファーを洗浄します。次に、サンプルの連続モニタリングのために、ストックボトルから直接各ウェルに50マイクロリットルのテトラエチルベナジン基質を添加することにより、結果を出します。サンプルを分光光度計に入れ、635ナノメートルの吸光度を連続的に測定します。
1回限りの測定の場合は、サンプルを室温で10〜20分間、暗所でインキュベートします。この間、井戸は透明からさまざまな程度の青に変わります。それぞれに50マイクロリットルの硫酸を加えて反応を停止します。
次に、96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を450ナノメートルで測定します。ここに示すグラフは、生物学的に活性なビタミンD 3がrun X 2D NA結合に及ぼす影響を連続的にモニタリングした例です。試験した濃度は、ランX 2D NA結合にほとんど影響を与えませんでした。
他のビタミンD3つの化合物は劇的な効果があることが示されていますが。ここで試験した化合物5 2 2 1 9 7 5は、コンピュータ支援薬物設計を使用して同定されました。試験時に、化合物は、1ナノモルから100マイクロモルへのrux 2結合の用量依存的な阻害を示し、renx 2D NA結合の50%は、化合物のわずか0.01マイクロモルで阻害することができました。
このビデオを見た後、DNA結合アッセイの実施方法とDNA結合の潜在的な阻害剤の試験方法についてよく理解できるはずです。
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概要
この記事では、特に転写因子に焦点を当てたタンパク質-DNA相互作用を研究するために設計された定量的DNA結合アッセイを紹介します。このアッセイは、ストレプタビジン被覆プレートとビオチン化DNAを使用して、コロリメトリック測定を通じてRUNX2タンパク質相互作用の検出を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生化学
- 分子生物学
- 転写調節
背景
- タンパク質-DNA相互作用の理解は遺伝子発現調節に重要です。
- 転写因子は細胞プロセスと疾患メカニズムにおいて重要な役割を果たします。
- 定量的アッセイは転写調節因子を特定するために不可欠です。
- コロリメトリック検出法は相互作用のリアルタイムモニタリングを提供します。
研究の目的
- タンパク質のDNAへの結合を測定するための信頼できるアッセイを開発すること。
- 遺伝子発現の潜在的な転写調節因子を特定すること。
- タンパク質-DNA相互作用分析を通じて新しい抗腫瘍剤を探索すること。
使用した方法
- ストレプタビジン被覆アッセイプレートの調製。
- 結合アッセイ用のビオチン化DNAターゲット。
- 核抽出タンパク質と潜在的な阻害剤の組み込み。
- 特定の抗体を用いた結合転写因子の検出。
主要な結果
- コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドを使用してRUNX2の高特異性が達成されました。
- リアルタイムのコロリメトリック検出が正常に実施されました。
- このアッセイはタンパク質-DNA相互作用の効果的な測定を示しました。
- 転写調節因子を特定する潜在的な応用が強調されました。
結論
- 開発されたアッセイは転写因子相互作用を研究するための価値あるツールです。
- がん研究における新しい治療標的の発見に役立ちます。
- 将来の研究では、このアッセイの様々な生物学的文脈での応用を拡張する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of protein-DNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. This D-ELISA assay enables precise measurement of transcription factor binding and inhibitor effects, supporting predictive confidence at key inflection points in oncology and gene regulation portfolios. Its quantitative outputs facilitate robust triage and prioritization of candidate modulators for further development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of transcription factor-DNA binding for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying inhibitor effects on protein-DNA interactions.
- Facilitates predictive confidence in pathway modulation and target engagement.
Screening & Assay Development
- Provides a quantitative, reproducible platform for screening DNA-binding inhibitors.
- Standardizes detection of transcription factor activity using colorimetric readouts.
- Enables scalable, multiwell assay formats suitable for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant transcriptional regulation in oncology models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of anti-tumor agents.
- Reduces biological risk by confirming target modulation in relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative DNA-binding assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging target validation, lead identification, and translational research for transcriptional regulators.
- Discovery Biology: Quantifies transcription factor-DNA interactions to clarify pathway roles and validate targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for inhibitor screening and assay standardization.
- Analytics: Provides absorbance-based measurements for comparative analysis of binding and inhibition.
- Translational Research: Supports preclinical evaluation of candidate anti-tumor agents targeting gene regulation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse protein-DNA interaction studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility, scalability, and standardization across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust inhibitor evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transcriptional regulator programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein extraction, antibody-based detection, and quantitative assay design.
- Needs access to multiwell plate readers and validated antibody reagents.
- Demands cross-team standardization of controls and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various transcription factors and DNA targets with appropriate optimization.
- Dependent on rigorous specificity controls to ensure meaningful quantitative outputs.
