Name: CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶCometChipを用いたマイクロアレイ96ウェルプラットフォームによる哺乳類細胞のDNA損傷ハイスループット測定法。蛍光イメージングと画像解析ソフトウェアで損傷を定量化し、創薬スクリーニングや疫学研究に応用可能です。

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この作品は、主に1-R21-ES019498およびR44-ES021116からの部分的な支援を受けて5-UO1-ES016045によりサポートしていました。 DMWは環境毒性学T32-ES007020中NIEHSトレーニンググラントによってサポートされていました。機器は、環境健康科学P30-ES002109センターから提供された。

チップの作製<ol style="margin-left: 40px;"><li>パッケージからチップゲルを取り外し、1ウェル矩形板、ゲル膜面を下に配置します。 </li><li> 2回繰り返す、15分間、PBS 1×25mlのゲルを洗ってください。 </li><li>それに応じてゲルのガラス板とラベル向きにゲルを設定します。 </li><li>静かにゲル上に反転した底なしの96ウェルプレートを押してください。底なしのウェルプレートのすべてのウェルがゲルの領域内にあることを確認してください。 </li><li>ガラスでクランプを固定するためのプレートの両側に1.5 &#39;&#39;バインダークリップを使用してください。 </li><li>過剰のPBSオフ吸引し、各ウェルにバッファー。 </li></ol> 2細胞に添加する<ol style="margin-left: 40px;"><li>細胞懸濁液を準備します。 <ol><li>懸濁細胞株については、10 5〜10 6細胞/ mlの最終濃度を得るために、培地中の細胞懸濁液を希釈する。 </li><li>接着細胞株については、通常の取り外し/トリプシン処理プロトコルおよびdに従ってください10 5〜10 6細胞/ mlの最終濃度になるように培地中の剥離した細胞をilute。細胞が凝集した場合、単一細胞懸濁液を得るために、細胞フィルタで細胞懸濁液を渡す。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を加える。 </li><li>ゲルフィルムでカバープレートは、媒体の蒸発を防止する。 </li><li>細胞を37℃のインキュベーター中で少なくとも30分間ロードします。 </li><li>各ウェルから培養器と吸引メディアからチップを取り外します。 </li><li>バインダークリップと底なしの96ウェルプレートを取り外し;角度でガラス板を有するチップを持ち、静かにアガロース上で余分な細胞を除去するために1×PBSですすいでください。 </li><li> 4X対物レンズ明視野顕微鏡を用いて細胞の負荷を確認してください。不十分な荷重が観察されている場合は、ステップ2.1から繰り返します。 </li><li>でも、面（実験台）に搭載されたチップを置きます。 37℃に予め加温し、1％低融点（LMP）アガロースオーバーレイチップ。およそ使用2̵1、LMPアガロース3mlを各チップのために必要とされる。 </li><li>オーバーレイが3分間RTで最初に固化した後、完全なゲル化のために5分間、4℃の冷蔵庫に移動できるようにします。 </li></ol> 3投与と修理注：ステップ4に進み、ベースラインDNA損傷レベルを研究する。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>慎重に新しい底なし96ウェルプレートのウェルで（前のクランから作成）チップのウェルの位置を合わせます。バインダークリップでトップとセキュアクランプで再プレス底なし96ウェルプレート。 </li><li> 96ウェルプレートの各ウェルに所望の用量の化学物質の100μlを加える;氷の上または所望の時間のために4℃の冷蔵庫内に投与/処置を行う。 </li><li>各ウェルから、吸引化学物質を投与し、1×PBSを用いて、残留化学物質を洗い流すの後。直接的な被害がここで研究されている場合は、ステップ4に進みます。 </li><li>修復動態を研究するために、チップ内の細胞がで修復することができ37℃での媒体。特定の時点で溶解する（ステップ4に進む）。 NOTE：修復は、添付の底なし96ウェルプレートにオンチップで行うことができ、またはチップは底96ウェルプレートを除去した後に個片に切断することができる。 </li></ol> 4。溶解<ol style="margin-left: 40px;"><li>アルカリコメットアッセイを実行するには： <ol><li>溶解ストック溶液（2.5 MのNaCl、100mMののNa 2 EDTA、10mMトリス、pHが10）をアルカリ性にするために、1％トリトンX-100を添加することによってアルカリ溶解ワーキングバッファーを作る。各チップのために働くの溶解緩衝液約25ミリリットルを用意します。 </li><li> 4℃でのプレチルワーキングアルカリ溶解バッファー。 </li><li>クール作業アルカリ溶解緩衝液中でチップを浸し、溶解は4℃の冷蔵庫内でO / Nを実行することを可能にする。 </li></ol></li><li>ニュートラルコメットアッセイを実行するには： <ol><li>中性溶解ストック溶液（2.5 MのNaCl、100mMののNa 2 EDTA、10、1％トリトンX-100および10％DMSOを添加することにより中性の溶解緩衝液を作る作業mMトリス、1％N -Lauroylsarcosine、pHは9.5）。チップごとに、溶解緩衝液の作業を約25ミリリットルを用意します。 </li><li> 43℃で中性の溶解バッファーワーキング事前暖かい。 </li><li>暖かい作業中性溶解緩衝液中でチップを浸し、溶解は43℃のインキュベーター中でO / Nを実行することを可能にする。 </li></ol></li></ol> 5。電気泳動<ol style="margin-left: 40px;"><li>アルカリコメットアッセイを実行するには： <ol><li>溶解バッファーを外し、すぐに1×PBSでチップをすすぐ。 </li><li>ゲルフィルム側は、両面テープを用いて、下にして電気泳動チャンバー内のセキュアチップ。 </li><li> 4℃の低温室にチャンバーを持参してください。 </li><li>ただゲルをカバーレベルに冷たいアルカリ電気泳動バッファー（0.3MのNaOH、1のNa 2 EDTA）でチャンバーを埋める。 </li><li> 40分間アルカリ巻き戻しを可能にします。 </li><li>低温室で30分間、1 V / cmの300 mAで電気泳動を実行します。茶中の電気泳動バッファーの量を調整します希望流れる電流を達成するためにmber。 </li></ol></li><li>ニュートラルコメットアッセイを実行するには： <ol><li> 4℃で2×15分間、溶解緩衝液を取り出し、中性の電気泳動緩衝液でチップを洗浄（2のNa 2 EDTA、90 mMトリス、90 mMのホウ酸、pH8.5）に。 </li><li>ゲルフィルム側は、両面テープを用いて、下にして電気泳動チャンバー内のセキュアチップ。 </li><li> 4℃の低温室にチャンバーを持参してください。 </li><li>ただゲルをカバーレベルに冷たい中立電気泳動バッファー（2のNa 2 EDTA、90 mMトリス、90 mMのホウ酸、pH8.5）でチャンバーを埋める。 </li><li>ゲルは60分間低温室で静置する。 </li><li> 0.6 V / cmであり、低温室での60分間の6ミリアンペアで電気泳動を実行します。希望ランニング電流を達成するために、チャンバー内に電気泳動緩衝液の量を調整します。 </li></ol></li></ol> 6。蛍光イメージング<ol style="margin-left: 40px;"><li> COLから電気室からチップを取り外しDルーム。 </li><li> 4℃の冷蔵庫内で2×15分間、中和緩衝液（0.4 Mトリス、pH7.5）中でゲルを中和する。 </li><li>工場推奨手順の下で（ すなわち 、SYBRゴールド、臭化エチジウム）、選択した蛍光DNA染色でチップを染色。蛍光顕微鏡を用いた画像。 </li></ol> 7。データ解析そのようなコメット5.5などの標準コメットアッセイソフトウェアによって彗星の画像を分析します。

<ol><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comet+Assay+for+DNA+Damage+and+Repair+Principles%2C+Applications%2C+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations.</a> Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).</li>
<li>Olive, P. L., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation+induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
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<li>Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+breaks+measured+in+individual+cells+subjected+to+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis.</a> Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).</li>
<li>Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatography--tandem+mass+spectrometry+measurement+of+radiation-induced+base+damage+to+isolated+and+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+research+in+toxicology%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA.</a> Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).</li>
<li>Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively-induced+clustered+DNA+lesions+using+a+novel+adaptation+of+single+cell+gel+electrophoresis+%28comet+assay%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay).</a> Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).</li>
<li>Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+alkylation+damage+and+repair+in+mammalian+cells+by+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay.</a> Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).</li>
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<li>Ge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+fluorescent+imaging+of+live+cells+is+highly+genotoxic%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).</li>
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<li>Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation+and+DNA+repair+efficiency+in+a+healthy+population%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population.</a> Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).</li>
</ol>

CometChipは、Wood、Weingeist、Bhatia、Engelwardを含む特許申請に基づいて、Trevigen, Inc.にライセンス供与されています。

環境での、また、ヒト細胞内のユビキタス遺伝毒性物質は避けられないストレスや細胞のDNAに損傷を及ぼす。実際には、定常状態での18のヒト細胞中に存在するDNA損傷の1,000sがあることが推定されている。ヒトで損傷感受性と修復動態を理解することは、基礎研究への洞察をもたらすだけでなく、医薬品開発に利益をもたらすだけでなく、。皮肉なことに、癌を促進するためのDNA損傷の能力にもかかわらず、DNA損傷剤は、DNA損傷についての知識を作り、癌を治療し、個別化医療に関連する修復するために、非常に高いレベルで使用される。 CometChipは、長期存在していたDNA損傷アッセイに革命をもたらす微細加工慣行を利用した新規研究デバイスである。伝統的なコメットアッセイの同じ原則を踏まえ、チップが有意に高いスループットと優れた再現性を提供します。ここでは、このチップを使用するための方法を記載する。その有用性と堅牢性を明らかにするために、前後に結果を示すチップは、複数の異なるDNA損傷剤によって誘発された損傷を評価するために使用されており、それがDNA修復を評価するために使用されている場合、いくつかの実験をメートル。総合すると、ここに示された結果は、チップを使用するための役立つ情報を提供し、DNA損傷と修復の研究に幅広い適用性を実証する。 このプロトコルの中で最も重要な工程の一つは、効果的なセル負荷を達成することである。多くの細胞系は、懸濁および接着細胞の両方を含む、このシステムで試験されている。積載効率は、細胞型、細胞の大きさ、添加濃度と時間などの多くの変数に依存する。そのようなリンパ芽球様細胞などの浮遊細胞株は、で動作するのが最も簡単です。細胞懸濁液の濃度は、通常15〜30分間で完了し、96ウェルローディング10 4から10 6個の細胞まで変化しうる。高い細胞密度は、ローディングを容易にし、マイクロウェル中に沈降する細胞に要する時間を短縮。 接着細胞のためのパラメータをロードすると、浮遊細胞とは異なる場合があります。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のような細胞株は、（トリプシン処理後）浮遊細胞と同様の積載効率を有し、したがって類似の荷重条件を使用することが見出された。簡単に懸濁液中の細胞凝集体を形成する腫瘍細胞などの他の細胞型は、追加の処理を必要とする。単細胞フィルターを通して細胞懸濁液を通過させ、懸濁媒体にトリプシンを添加してロード中に細胞クラスターの形成を抑制することができる。最後に、ロード時間の点で、マイクロウェルに付着した細胞株を捕捉するために必要な時間は1時間と20分で変えることができる。その結果、ユーザはさらなる調査に進む前に、最適な負荷条件を決定するために、パイロット実験を行うことが推奨される。ロード効力は、明視野顕微鏡下で可視化またはより正確にDAPIまたは他のDNAをカプセル化細胞を染色することによって明らかにすることができる蛍光顕微鏡下での評価に先立って汚れ。 この方法は、チップの1つの主要な利点は汎用性である。最初に、過剰な細胞は洗い流すため、研究者は、特定の作業用細胞濃度に限定されず、マイクロアレイは、均一彗星密度を保証する。第二に、マイクロウェルは、異なるサイズの細胞型に対応するために可変サイズで作ることができる。複数のセルが単一のマイクロウェル内に捕捉される状況下では、マルチセル彗星は、自己較正され、単一細胞彗星6,7と比較して一貫した結果をもたらす。マイクロアレイ中の細胞をパターン化する別の利点は、すべての彗星による非集束彗星にノイズを低減し、自動イメージングおよび分析を容易にする、固定された位置と同じ焦点面に、次にであることである。 CometChipが提供するスループットと感度の大幅な改善は、大規模な研究のためのアッセイの適用を可能にする。総合すると、チップが提供研究者、毒物学者、臨床医と疫学者のためのDNA損傷を評価するためのsaの貴重なツール。 コメットアッセイは、DNA損傷の広い範囲を検出するのに優れた感度のために知られているが、このアッセイは、低特異性に苦しむ。このプロトコルを使用すると、大幅にアッセイの再現性とスループットが向上しますが、特異性において進歩を示さない。それにもかかわらず、他の方法を用いるアッセイは、より高い特異性を達成するの​​に有効であることが報告されている多重化する。一例は、精製された病変特異的酵素を含めることである。これらの酵素は、検出可能な鎖の切断や塩基部位1,19-21にそうでなければ検出できない基本病変を変換することができます。広く使用されている例では、酸化的DNA修飾19,22を明らかに修復エンドヌクレアーゼホルムアミドピリミジン-DNAグリコシラーゼ（FPG）である。酵素消化ステップは、細胞溶解後に適用されるので、システムは同じようにaを処理することができるプロトコルへの変更なしでのsa伝統的なアガローススライド。詳細なプロトコルは、ここで説明されていないが、このアプローチは、過去の多くの伝統的なコメットアッセイユーザによって適合されており、プロトコルは容易に見つけることができる。以前の出版物では、蛍光灯の光誘起損傷22を識別するために、このメソッドを使用していました。 この方法の主な利点は、以前には事実上不可能だったの研究への扉を開き、それが提供するスループットである。同じプラットフォーム上で96サンプルを処理する能力は、手間と時間を削減するだけでなく、実験的なノイズを低減し、大幅に再現性を高めるだけでなく。インターサンプルの変動は、このチップ6,7で観察された変動よりも2倍高くなることがあり、伝統的なスライド·ツー·スライド変動よりも著しく低い。ノイズの低減はまた、サンプル間のより微妙な違いの検出を可能にする、改良された感度をもたらす。デバイスがSTAを採用しているためndard 96ウェルフォーマットでは、一般的な研究機器やHTS技術と互換性があります。平均研究者が数日間にわたって〜30のガラススライドを処理できると仮定して、100サンプルの評価を必要とする研究を考えてみましょう。各サンプルは、トリプリケートで実施される必要があることを考えると、それはまた、必然的に変動をサンプリングするサンプルから被るような研究を完了するために約1ヶ月かかる。対照的に、このチップを搭載した処理条件100、トリプリケートでそれぞれが、わずかプレートを必要とし、三日間で行うことができる。このスループットの大幅な改善は、以前には達成不可能であった研究のへの扉を開きます。 ここで紹介するプロトコルは、標準のコメットアッセイを実施するための基本的な手順やCometChipプラットフォームを使用するために必要な変更された手順の両方について説明します。本来のDNA損傷のレベルとその後の修復応答の両方を測定する能力を、アッセイは非常に適切である生物学的および臨床的なさまざまなアプリケーション。ゲノム上の特定の化学暴露の影響に関する情報は、病気の予防と治療を容易にします。さらに、DNA損傷感受性および個人23,24間の修復能力の変動を決定する上での重要な関心もある。この技術は、大規模な研究に必要なスループットを提供する。個体間のばらつきについての知識は、影響を受けやすい人々を識別するための個別化治療法や予防策戦略を設計するために重要である。ここで紹介する技術は、近い将来には、標準的な方法になる可能性が高いスループット、客観的かつ定量的なDNA損傷解析プラットフォームを提供し、一緒になって。

単細胞ゲル電気泳動（コメットアッセイ別名）（SCGE）アッセイは、ベース病変、脱塩基部位、一本鎖切断、二本鎖切断、架橋アルカリ敏感含むDNA損傷の広いスペクトルの定量化のために広く使用されている技術であるサイト。アッセイの基礎となる原理は、損傷を受けたDNAが損傷を受けていないDNAよりも起因する断片化と超らせん構造の損失をより容易に移行することです。移動の程度は、DNA損傷の量に比例し、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。画像キャプチャおよび個別彗星状のDNAの強度プロファイル分析は、セル1-4内のDNA損傷のレベルを明らかにするために尾部にかかるテール長、テールモーメント、および％DNAなどのパラメータ測定値を提供します。 a）は、アルカリコメットアッセイおよびb）中立コメットアッセイ：現在、コメットアッセイの2一般的に使用されるバージョンがあります。アルカリコメットアッセイは、最も広くですこのように、電気泳動の前にDNAを巻き戻すために高pH緩衝液を使用し、使用済みのバージョンは、鎖切断とアルカリ感受性部位のすべてのタイプを検出します。それは、二重らせんを維持するだけで二本鎖切断2,5を検出するための中性緩衝液を使用しているため、中性コメットアッセイは、一方では、より少ない実施される。 DSBを誘発する化学的および物理的なエージェントの場合、のSSBが協調して作成され、非常に高いレベルで形成されている（ 例えば 、γIR誘発性のSSBはDSBはより一般的な大きさのオーダーである）。ほとんどのDNA損傷のエクスポージャーについては、DSBのはそれほど頻繁にDNA損傷の他のクラスよりも、従って検出することが困難です。私たちは、以前の刊行物に両方のバージョンの検出窓を示した。6,7 コメットアッセイは日常的にDNA損傷と修復および遺伝毒性試験の1,2,8-15の基礎研究のために使用されてきたが、このアッセイは、原因サンプル対に乏しい再現性が報告されているサンプル、個人対個人およびLAB間の変動性。さらに、アッセイは、画像取得及びデータ解析が面倒である部分であるため、低スループットである。一緒に、これらの制限は、大規模な研究でその比較的低い受諾に貢献しています。エンジニアリング技術と原則の統合により、CometChipは、従来のコメットアッセイ6,7に関連しているスループットと矛盾の問題を解決をもたらします。簡単に説明すると、チップを作成するために、金型は、単一細胞と同程度に小さい直径を有するマイクロポストを作成するためにフォトリソグラフィを用いて微細加工されている。次いで、金型ゲルが固化した後にマイクロウェルのアレイが得られる、溶融アガロース上にスタンプするために使用される。チップは、異なる細胞型と互換性を可変サイズのウェルを有する研究者に提供するために開発されている。チップをロードするには、培地中の細胞は、重力によってウェル内に定着させている。過剰細胞が洗い流される。捕捉された細胞は、その後私たちにカプセル化され低融点アガロースの薄い層をると、底なしの96ウェルプレートを、その底面にマイクロウェル数百の96 macrowells、それぞれを作成するためにゲル表面にクランプされる。 このプロトコルは、ゲル剤、セル負荷、投与および修復、細胞溶解、電気泳動、および蛍光イメージングを含む、このチップを用いた実験のための一般的な手順について説明します。私たちは、それぞれのアッセイのアルカリ性および中性のバージョンを使用して、既知のDNA損傷剤に曝露リンパ芽球細胞を用いた用量反応実験の2つの例を示す。二つの修復実験も修復応答後露光システムを用いて評価することができる方法を説明するために示されている。

<table><tbody><tr><td>UltraPure LMP アガロース (低融点)</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14190</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Crystalline NaCl</td><td>Macron Chemicals</td><td>7581-06</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>Crystalline Na2EDTA</td><td>Macron Chemicals</td><td>4931-04</td><td>複数の供給者、刺激性</td></tr><tr><td>結晶性トリス(塩基)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>複数の供給者、刺激性</td></tr><tr><td>結晶性トリス(酸)</td><td>J.T.Baker</td><td>4106</td><td>複数の供給者</td></tr><tr><td>結晶性N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td>複数の供給者、吸入による毒性が高い、刺激性</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>複数の供給者、摂取により有害、刺激性</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>複数の供給者、可燃性液体、標的臓器効果</td></tr><tr><td>結晶性NaOH</td><td>マクロン化学薬品</td><td>7708-06</td><td>複数の供給者、腐食性</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>VWR</td><td>BDH3871</td><td>複数の供給者</td></tr><tr><td>、腐食性結晶性ホウ酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>B6768</td><td>複数の供給者、標的臓器効果、催奇形物質、生殖ハザード</td></tr><tr><td>彗星チップ</td><td>トレビゲン</td><td></td><td>流通のための開発中、必要な材料を得るためにトレビゲンに直接連絡してください</td></tr><tr><td>1ウェル皿</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>73521-420</td><td></td></tr><tr><td>ボトムレス 96 ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>655000-06</td><td></td></tr><tr><td>1.5 'バインダークリップ</td><td>ステープル</td><td></td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>ガラスプレート</td><td>タグハードウェア</td><td></td><td>96ウェルプレートのサイズに合わせてカスタマイズ</td></tr><tr><td>フクロウ水平電気泳動システム</td><td>VWR</td><td>27372-131</td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>PowerPac基本電源</td><td>バイオ・ラッド</td><td>164-5050</td><td>複数のサプライヤー</td></tr></tbody></table>

cometchip：マイクロアレイヒト細胞におけるdna損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA損傷剤は老化、病気、癌を促進する可能性があり、それらは環境中に遍在し、正常な細胞代謝物として人間の細胞内で生成されます。皮肉なことに、高用量では、DNA損傷剤は癌の治療にも使用されます。したがって、DNA損傷応答を定量化する能力は、公衆衛生、製薬、および臨床の領域で重要です。ここでは、微細加工技術を利用して固定マイクロアレイ内の細胞をパターン化する新しいプラットフォームについて説明します。「CometChip」は、電気場中のマトリックスを介したDNAの移動の程度を評価することにより、DNA損傷のレベルを推定する、確立されたシングルセルゲル電気泳動アッセイ(別名コメットアッセイ)に基づいています。このアッセイで測定される損傷の種類には、非塩基性部位、架橋、および鎖切断が含まれます。従来のアッセイでは、細胞がアガロースにランダムに分散する代わりに、細胞は重力によってアガロースマイクロウェルアレイに捕捉されます。また、このプラットフォームは、標準的な顕微鏡スライドのサイズから96ウェル形式に拡張され、並列処理が可能になります。ここでは、チップを使用して既知の遺伝毒性物質によって引き起こされるDNA損傷を評価するプロトコルと、曝露後に追跡される細胞修復応答について説明します。生物学的原理と工学的原理の統合により、この方法はヒト細胞のDNA損傷の堅牢で高感度な測定を強化し、遺伝毒性試験、医薬品開発、疫学研究、臨床アッセイに必要なスループットを提供します。

この最初の例では、H 2 O 2を用いた酸化的損傷への曝露後にヒトリンパ芽球細胞におけるDNA損傷の初期濃度を定量化するためのアプローチを記載する。 H 2 O 2誘発ベース病変および一本鎖切断を評価するために、アルカリ性コメット条件が使用されている。ロードが完了し、細胞がアガロースオーバーレイでカプセル化された後、底の96ウェルプレートは、チップ上の96の区画を作成するために表面に押し付けられる。 96ウェルのそれぞれは、異なるタイプまたは化学物質の濃度を投与することができる。ここでH 2 O 2、4つの異なる用量を用い、1×PBSを陰性対照として使用した。配列彗星の代表的な画像は、非処理図1A、（上）、50μM（中央）および100μM（下）H 2 O 2 -exposedサンプルはコメットテイルの異なるレベルを示したに示されている。コメット画像の分析はperforすることができ一般に、各コメットテールの総蛍光強度および移動距離に基づいて損傷レベルを定量化する市販のソフトウェアを使用してのmed。測定は一般に条件当たり50〜100彗星上で実行され、中央値（％テールDNAまたはテールの長さのいずれか）が計算される。 図1Bは、Hの4つの異なる濃度にさらさTK6リンパ芽球様細胞彗星から分析パーセンテージ尾DNA応答曲線を示す2 O 2。独立した実験間の一貫性は、細胞中の化学処理のさまざまなレベルのDNA損傷応答を評価する際にこのアプローチの有効性を示す。 （macrowellsの中など ）と同じ実験の繰り返しの中で、サンプル間のばらつきの詳細については、サンプル間および実験間のばらつきは、それぞれ、 図2Aおよび図2Bにプロットした。 96ワットの各実験内で、各ウェルエルチップは、異なるサンプルと同等であるので、ウェル間の変動は、デバイスのサンプル間のばらつきを明らかにする。ここで、96ウェルマイクロチップの12ウェル中にロードされたTK6細胞を、H 2 O 2の同じ用量で処置し、直ちに処理した後に溶解した。他の全ての実験工程を並行して行い、各マクロウェルから少なくとも50彗星の中央値は、 図2Aにプロットした。標準偏差は3.99パーセントであると中央値の平均は、尾で77.53パーセントのDNAである。これらのデータからは、サンプル間の変動係数は、いくつかの5.2％が、このアッセイ6,16の改善された堅牢性を実証し、従来のアッセイよりも低倍される。計算アッセイの再現について学ぶために、私たちは、75μMのH 2 O 2を用いてチップ内のTK6細胞を露出し、DNA損傷の即時レベルを分析する。この実験は、各実験の6回、データがFでプロットした繰り返した。igure 2B。同一の実験条件下では、私たちは、図に灰色のバーとして示し、41.76パーセントから57.87パーセントに及ぶ結果が得られた。 6反復の平均は、2.04パーセントの平均値の標準誤差で、49.57パーセントである。リピート間の低い変動がこの小説のデバイス上で実行コメットアッセイが高度に再現可能であることを意味します。 修復速度を評価するために、細胞を処理した後、新鮮な培地中でそれらのDNAを修復させる。さまざまな時点でmacrowellsを溶解することは時間をかけてDNA損傷の変化を明らかにする。例が図3に示されている。この実験では、TK6細胞を最初に、チップに封入した50μMのH 2 O 2で処理し、60分後露光まで修復させた。細胞は、それぞれ0、20、45及び60分で溶解した。異なる時点での代表的なコメット画像は、 図3Aに示されており、経時的なDNA損傷のレベルの変化を図にプロットされている図3（b）。このデータは、ほぼ全ての損傷の45分後にH 2 O 2処理内で修復されることが明らかになった。多くの変数が使用される細胞株および化学剤の種類を含む、修復の速度に影響を与えることができる。したがって、研究者は彼らの調査で追加のニーズに対応するために（ すなわち 、修理時間を延長する）プロトコルに変更を加えることができます。 TK6細胞は、異なる遺伝毒性物質でチャレンジされるここでは、このチップを使用して修復実験の別の例を提供する、N -メチル- N &#39;-Nitro- N -Nitrosoguanidine（MNNG）は、7 -メチルグアニンを含むベース病変を誘発することが知られているアルキル化剤である及び3 - メチルアデニン。これらの病変は自然発生的な脱プリンまたはDNAグリコシラーゼによる酵素の除去のいずれかの部位を脱塩基に変換されます。得られた脱塩基部位は、アルカリ条件下で切断し、チップ上で検出することができる。最初の曝露は、長いから明らかな損傷の有意な増加を引き起こし細胞が修復中に無傷のDNAを復元するように尾部は、時間の経過とともに、これらの尾が低減される。アルキル化および酸化的損傷が両方の主に塩基除去修復経路によって修復されますが、生成された病変の量や修復に関与するタンパク質が異なります。これらの変化は部位、ならびに得られた脱塩基部位の修復の異なる速度を脱塩基への変換の異なる速度をもたらすことができる。 図4では、TK6細胞の修復速度は0.1、1に曝露し、そしてMNNGの3 / mlのが示されている。 MNNG誘発性の損傷が長く持続することが表示され、H 2 O 2誘発損傷に比べて遅い速度でクリアされるため、この実験では、2時間の露光後に実験時間を延長した。 中性条件を用いてDSBの分析は、アルカリ性条件を使用して一本鎖病変の分析のためのプロトコルに非常に類似している。初期損傷レベルを示すために、TK6細胞をGIRの変数のレベルに暴露し、<html>そして得られた細胞を溶解し、中性pH（ 図5A）で電気泳動した。これは、コメットテイルの形態は、アルカリ性アッセイ条件とは異なることに注目すべきである。このアッセイを使用して観察可能な断片化DNAを達成するために、使用されるIR用量は、アルカリ性条件を使用して損傷を見るために必要とされる用量よりも（0-100 Gyの）有意に高い。また、テールの長さが中性コメットアッセイ7を使用する場合にDNA損傷の程度を反映し、最も敏感なパラメータであることを見出した。分析した用量応答曲線は、 図5Bに示されている。細胞におけるDNA二本鎖切断の修復も評価することができ、Weingeist らによって示されている。ら 。7。総合すると、ニュートラルCometChipは、DNA DSBのハイスループット解析のための貴重なツールを提供しています。 1highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図1。アルカリ性コメットアッセイを用いてTK6細胞のH 2 O 2の用量応答。未処理TK6リンパ芽球からの（A）アレイ化マイクロウェル彗星（上）およびTK6細胞を50μM（中央）および100μM（下）H 2 O 2に曝露さ4°Cで20分間。スケールバーは100μmである。 （B）H H 2 O 2のさまざまなレベルにさらさTK6細胞の2 O 2の用量応答。各データ点は、少なくとも50の個別彗星の中央値のパーセンテージ尾部DNAを、各実験で得られた3つの独立した実験の平均である。エラーバーは、3つの独立した実験から平均値の標準誤差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。サンプル間とインター実験変動。（A）サンプル間の変動。 TK6ヒトリンパ芽球細胞を96ウェルチップの12ウェルにロードした。各ウェルを、50μMのH 2 O 2100μlに暴露した 4°Cで20分間。セルはすぐに溶解し、％テールDNAを分析した。各ウェルのデータがここに示されています。各ボックスには、中央値、各ウェルから少なくとも50の個別彗星を表します。 12ウェルの平均で77.53パーセントであり、標準偏差は3.99％であり、変動係数は5.2％であると計算される。 （B）実験間のばらつき。 TK6ヒトリンパ芽球細胞を4℃で20分間、75μMのH 2 O 2100μlに露出し、96ウェルマイクロチップに装填した。セルはすぐに溶解し、％テールDNAを分析した。同じ実験を6回繰り返し、各繰り返しのデータは灰色のバーとして示されている。各ボックスには、各繰り返しから少なくとも100個の彗星の中央値％の尾DNAを表しています。 6反復の平均は、ここに戻ってバーとして示され、49.57パーセントである。 6反復の標準偏差は4.99％であり、平均の標準誤差は、図中のエラーバーとして表さ2.04％であると計算される。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。TK6リンパ芽球中のH 2 O 2誘発損傷の修復。代表彗星と修復の研究（A）の模式図。 TK6細胞を損傷剤で処理し、溶解前に、37℃で培地中で修復させる。 （B）4＆＃で20分間、50μMのH 2 O 2での処理後のTK6細胞の修復動態176、C。各データ点は、少なくとも50の個別彗星の中央値のパーセンテージ尾部DNAを、各実験で得られた3つの独立した実験の平均である。エラーバーは、繰り返し実験からの平均の標準誤差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。TK6リンパ芽球におけるMNNG誘発損傷の修復。TK6細胞を0.1,1、及び4℃で30分間、3 / mlのMNNGで処理し、120分後まで37℃で培地中で修復させる暴露。少なくとも50個体彗星の中央値のパーセンテージテールDNAは、3つの独立した実験のそれぞれについて得られた。エラーバーは標準誤差を表す3つの独立した実験からの平均である。 <img alt="図5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" width="300" /> 40 Gyの（中央）および80 Gyの（下）ガンマ線照射に暴露され、未処理TK6リンパ芽球（上）とTK6細胞から図5。ニュートラルコメットアッセイを用いてTK6細胞のIR用量反応。（A）アレイ化マイクロウェル彗星。スケールバーは100μmである。 （B）ガンマ線照射のさまざまなレベルにさらさTK6細胞のIR用量応答。各データポイントは、チップ上の6 macrowellsからプールに少なくとも300彗星の中央値テール長（μm）を表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50607/50607fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

この手順の全体的な目的は、COMETチップを用いて哺乳類細胞におけるハイスループットなDNA損傷測定を行う方法を実証することです。まず、哺乳類細胞をCOMETチップにロードします。次に、DNA損傷を引き起こすことが知られている化学物質で細胞を処理します。次に、従来のCOMETアッセイプロトコルを用いて、細胞を溶解し電気泳動を行います。最終ステップでは、損傷したDNAの移動を可視化するために、細胞DNAの蛍光イメージングを行います。最終的に、画像解析ソフトウェアを使用してDNA損傷の程度を定量化します。コメットアッセイは古くから存在し、多種多様なDNA損傷を調べるために非常に有用な手法です。しかし、スループットが非常に低く、感度に欠けるという課題がありました。そこで私たちはCOMETチップを開発しました。これは基本的にコメットアッセイの高スループット版であり、例えば薬剤スクリーニングや疫学研究における高スループットスクリーニングを可能にするものです。当研究室の大学院生であるJing GAが、本手順を実演します。comaチップは、単一細胞と同程度の直径を持つマイクロポストを備えたマイクロファブリケーションスタンプを用いて作製された、マイクロウェルアレイを持つゲルです。まず、これを1ウェル長方形プレートに、ゲル結合フィルム側を下にして配置します。1×PBSを用いてゲルを25 mLで2回洗浄した後、comaチップをガラスプレート上に置き、ゲルの向きを適切にラベル付けします。次に、底のない96ウェルプレートを逆さまにして、96個のウェルすべてがゲルの範囲内に収まるように、ゲルにそっと押し当てます。その後、96ウェルプレートの両側を1.5インチのバインダークリップでガラスプレートに固定します。最後に、各ウェルから余分なPBSを吸引して除去します。標準的な手順に従って懸濁細胞または接着細胞を回収し、培地で希釈して最終濃度を1 mLあたり100,000〜100万個にします。必要に応じてセルフィルターに通し、単一細胞懸濁液が得られていることを確認してください。細胞懸濁液100 µLを各ウェルに分注し、CometChip 96ウェルプレートを完成させます。蒸発を防ぐためにプレートをゲルボンドフィルムで覆い、インキュベーターから取り出した後、37 °Cに設定したインキュベーターに30分間置きます。30分経過後、各ウェルから培地を吸引し、バインダークリップと底のない96ウェルプレートを取り除きます。ガラスプレートを傾けてコメットチップを保持し、1×PBSで緩やかに洗浄して、アガロース上の余分な細胞を除去します。次に、明視野顕微鏡の4倍対物レンズでプレートを観察し、細胞が最適にロードされているかを確認します。十分な細胞がロードされたら、コメットチップを水平な面に置き、37 °Cに予熱した1%低融点アガロースでオーバーレイします。オーバーレイを室温で3分間静置して凝固させ、その後4 °Cで5分間保持して完全に固定し、目的の化学物質を細胞に投与します。まず、コメットチップのウェルを底のない新しい96ウェルプレートのウェルに慎重に合わせ、押し付けます。前述と同様に、バインダークリップを用いて96ウェルプレートをガラスプレートに固定します。その後、プレートを氷上に置き、各ウェルに所望の用量の目的化学物質を100 µLずつ添加します。投与後、所望の時間、調査対象の化学物質を細胞に作用させ、各ウェルから化学物質溶液を吸引し、必要に応じて1回XPBSで洗浄します。ゲルを個別の断片に切断します。次に、修復キネティクスを研究するために、ウェルに培地を添加してインキュベートし、特定のタイムポイントで細胞溶解を行い、アルカリコメットアッセイ用に細胞を溶解させます。アルカリ溶菌ストック溶液に1% Triton X 100を加えて、チップ1枚あたり約25 millilitersのアルカリ溶菌用ワーキングバッファーを調製します。その後、4 °Cで予冷します。コメットチップよりわずかに大きい容器に、アルカリ溶菌バッファーをデカンテーションします。次に、アルカリチップを冷却したアルカリ溶解用ワーキングバッファーに浸し、冷蔵庫に入れて4°Cで一晩溶解させます。翌日、コメットチップを溶解バッファーから取り出し、1×PBSで速やかに洗浄します。その後、チップのゲルフィルム側を下に向けて電気泳動槽に配置し、両面テープで固定します。チャンバーを4 °Cの低温室に移動し、ゲルがちょうど浸かるまで冷やしたアルカリ電気泳動バッファーを満たします。次に、アルカリ変性をさせるため、チップを4 °Cで40分間静置します。最後に、1 V/cm、300 mAの条件下でゲルを30分間泳動します。低温室にて、目的の走行電流を得られるよう、チャンバー内の電気泳動バッファーの量を調整します。中性コメットアッセイでは、中性溶解ストック溶液に1%Triton X 100および1%DMSOを加えて、中性溶解ワーキングバッファーを調製します。ここでも、チップ1枚につき約25 mLのワーキング溶解バッファーを調製します。作業用の中性溶解バッファーを43°Cに設定したインキュベーターに入れ、予熱します。中性溶解バッファーが温まった後、コンマチップを中性溶解バッファーに浸し、40°Cのインキュベーターで一晩置きます。翌日、中性溶解バッファーを除去し、中性電気泳動バッファーで4°Cにて15分間の洗浄を2回行います。その都度、チップを電気泳動槽に固定して低温室へ移動させてください。前と同様に、電気泳動槽に冷えた中性電気泳動バッファーをゲルがちょうど浸かるまで満たし、コールドルームに60分間静置します。その後、コールドルーム内で0.6 V/cm、6 mAの条件で60分間電気泳動を行います。必要に応じて、目的の走行電流を得るために槽内の電気泳動バッファーの量を調整してください。COMチップをコールドルームから取り出した後、4 °Cで中和バッファーを用いて2回、各15分間洗浄し、ゲルの中和を行います。Cyberg goldまたは臭化イリジウムなどの蛍光DNA染色剤を用いて、チップ内での染色を行います。製造元の指示に従って染色し、蛍光顕微鏡で撮影した画像を用いて、未処理のTK6リンパ芽球由来の代表的なマイクロウェルコメットをこの図の上段パネルに示します。中段パネルには50 µMの過酸化水素に曝露したTK6細胞、下段パネルには100 µMの過酸化水素に曝露したTK6細胞の結果を示しています。すべての曝露は4 °Cで20分間行われました。この折れ線グラフは、TK6細胞の過酸化水素に対する用量反応を示しています。各データポイントは3回の独立した実験の平均値であり、各実験において少なくとも50個の個別のコメットからテールDNAの中央値パーセンテージが算出されました。このグラフは、過酸化水素に曝露したTK6細胞を用いたコメットアッセイにおけるサンプル間の変動を示しており、各ウェルのテールDNAパーセントのデータがここに表示されています。各ボックスは、各ウェルから得られた少なくとも50個の個々のコメットの中央値を表しています。12ウェルの平均値は77.53%、標準偏差は3.99%、変動係数は5.2%です。このグラフは実験間の変動を示しています。同じ過酸化水素曝露を6回繰り返し、各回のデータをグレーのバーで示しています。各ボックスは、各回の少なくとも100個の個々のコメットにおけるテールDNAパーセントの中央値を表しています。6回の繰り返しの平均値は49.57%であり、ここでは黒いバーで示されています。6回の繰り返し測定における標準偏差は4.99%であり、平均値の誤差棒は2.04%です。これは、従来の一般的なアッセイと同様に、図中のエラーバーとして示されています。研究者は、細胞内で生成されるDNA損傷のタイプに関するさらなる疑問に答えるために、精製された病変特異的酵素を添加するなど、この手順に変更を加えたり、他の手法を使用したりすることが可能です。コメットチップ技術は、哺乳類細胞におけるDNA損傷と修復に関する研究への道を切り開きました。また、ハイスループットであるため、サンプルの数の問題でこれまで不可能であった臨床研究や疫学研究を行うことが可能になります。

cometchip-high-throughput-96-well-platform-for-measuring-dna-damage

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学ぶCometChipを用いたマイクロアレイ96ウェルプラットフォームによる哺乳類細胞のDNA損傷ハイスループット測定法。蛍光イメージングと画像解析ソフトウェアで損傷を定量化し、創薬スクリーニングや疫学研究に応用可能です。

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

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