CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

この手順の全体的な目的は、COMETチップを用いて哺乳類細胞におけるハイスループットなDNA損傷測定を行う方法を実証することです。まず、哺乳類細胞をCOMETチップにロードします。次に、DNA損傷を引き起こすことが知られている化学物質で細胞を処理します。

次に、従来のCOMETアッセイプロトコルを用いて、細胞を溶解し電気泳動を行います。最終ステップでは、損傷したDNAの移動を可視化するために、細胞DNAの蛍光イメージングを行います。最終的に、画像解析ソフトウェアを使用してDNA損傷の程度を定量化します。

コメットアッセイは古くから存在し、多種多様なDNA損傷を調べるために非常に有用な手法です。しかし、スループットが非常に低く、感度に欠けるという課題がありました。そこで私たちはCOMETチップを開発しました。これは基本的にコメットアッセイの高スループット版であり、例えば薬剤スクリーニングや疫学研究における高スループットスクリーニングを可能にするものです。

当研究室の大学院生であるJing GAが、本手順を実演します。comaチップは、単一細胞と同程度の直径を持つマイクロポストを備えたマイクロファブリケーションスタンプを用いて作製された、マイクロウェルアレイを持つゲルです。まず、これを1ウェル長方形プレートに、ゲル結合フィルム側を下にして配置します。1×PBSを用いてゲルを25 mLで2回洗浄した後、comaチップをガラスプレート上に置き、ゲルの向きを適切にラベル付けします。

次に、底のない96ウェルプレートを逆さまにして、96個のウェルすべてがゲルの範囲内に収まるように、ゲルにそっと押し当てます。その後、96ウェルプレートの両側を1.5インチのバインダークリップでガラスプレートに固定します。最後に、各ウェルから余分なPBSを吸引して除去します。

標準的な手順に従って懸濁細胞または接着細胞を回収し、培地で希釈して最終濃度を1 mLあたり100,000〜100万個にします。必要に応じてセルフィルターに通し、単一細胞懸濁液が得られていることを確認してください。細胞懸濁液100 µLを各ウェルに分注し、CometChip 96ウェルプレートを完成させます。

蒸発を防ぐためにプレートをゲルボンドフィルムで覆い、インキュベーターから取り出した後、37 °Cに設定したインキュベーターに30分間置きます。30分経過後、各ウェルから培地を吸引し、バインダークリップと底のない96ウェルプレートを取り除きます。ガラスプレートを傾けてコメットチップを保持し、1×PBSで緩やかに洗浄して、アガロース上の余分な細胞を除去します。次に、明視野顕微鏡の4倍対物レンズでプレートを観察し、細胞が最適にロードされているかを確認します。十分な細胞がロードされたら、コメットチップを水平な面に置き、37 °Cに予熱した1%低融点アガロースでオーバーレイします。

オーバーレイを室温で3分間静置して凝固させ、その後4 °Cで5分間保持して完全に固定し、目的の化学物質を細胞に投与します。まず、コメットチップのウェルを底のない新しい96ウェルプレートのウェルに慎重に合わせ、押し付けます。前述と同様に、バインダークリップを用いて96ウェルプレートをガラスプレートに固定します。

その後、プレートを氷上に置き、各ウェルに所望の用量の目的化学物質を100 µLずつ添加します。投与後、所望の時間、調査対象の化学物質を細胞に作用させ、各ウェルから化学物質溶液を吸引し、必要に応じて1回XPBSで洗浄します。ゲルを個別の断片に切断します。次に、修復キネティクスを研究するために、ウェルに培地を添加してインキュベートし、特定のタイムポイントで細胞溶解を行い、アルカリコメットアッセイ用に細胞を溶解させます。

アルカリ溶菌ストック溶液に1% Triton X 100を加えて、チップ1枚あたり約25 millilitersのアルカリ溶菌用ワーキングバッファーを調製します。その後、4 °Cで予冷します。コメットチップよりわずかに大きい容器に、アルカリ溶菌バッファーをデカンテーションします。

次に、アルカリチップを冷却したアルカリ溶解用ワーキングバッファーに浸し、冷蔵庫に入れて4°Cで一晩溶解させます。翌日、コメットチップを溶解バッファーから取り出し、1×PBSで速やかに洗浄します。その後、チップのゲルフィルム側を下に向けて電気泳動槽に配置し、両面テープで固定します。

チャンバーを4 °Cの低温室に移動し、ゲルがちょうど浸かるまで冷やしたアルカリ電気泳動バッファーを満たします。次に、アルカリ変性をさせるため、チップを4 °Cで40分間静置します。最後に、1 V/cm、300 mAの条件下でゲルを30分間泳動します。

低温室にて、目的の走行電流を得られるよう、チャンバー内の電気泳動バッファーの量を調整します。中性コメットアッセイでは、中性溶解ストック溶液に1%Triton X 100および1%DMSOを加えて、中性溶解ワーキングバッファーを調製します。ここでも、チップ1枚につき約25 mLのワーキング溶解バッファーを調製します。

作業用の中性溶解バッファーを43°Cに設定したインキュベーターに入れ、予熱します。中性溶解バッファーが温まった後、コンマチップを中性溶解バッファーに浸し、40°Cのインキュベーターで一晩置きます。翌日、中性溶解バッファーを除去し、中性電気泳動バッファーで4°Cにて15分間の洗浄を2回行います。その都度、チップを電気泳動槽に固定して低温室へ移動させてください。

前と同様に、電気泳動槽に冷えた中性電気泳動バッファーをゲルがちょうど浸かるまで満たし、コールドルームに60分間静置します。その後、コールドルーム内で0.6 V/cm、6 mAの条件で60分間電気泳動を行います。必要に応じて、目的の走行電流を得るために槽内の電気泳動バッファーの量を調整してください。COMチップをコールドルームから取り出した後、4 °Cで中和バッファーを用いて2回、各15分間洗浄し、ゲルの中和を行います。

Cyberg goldまたは臭化イリジウムなどの蛍光DNA染色剤を用いて、チップ内での染色を行います。製造元の指示に従って染色し、蛍光顕微鏡で撮影した画像を用いて、未処理のTK6リンパ芽球由来の代表的なマイクロウェルコメットをこの図の上段パネルに示します。中段パネルには50 µMの過酸化水素に曝露したTK6細胞、下段パネルには100 µMの過酸化水素に曝露したTK6細胞の結果を示しています。

すべての曝露は4 °Cで20分間行われました。この折れ線グラフは、TK6細胞の過酸化水素に対する用量反応を示しています。各データポイントは3回の独立した実験の平均値であり、各実験において少なくとも50個の個別のコメットからテールDNAの中央値パーセンテージが算出されました。

このグラフは、過酸化水素に曝露したTK6細胞を用いたコメットアッセイにおけるサンプル間の変動を示しており、各ウェルのテールDNAパーセントのデータがここに表示されています。各ボックスは、各ウェルから得られた少なくとも50個の個々のコメットの中央値を表しています。12ウェルの平均値は77.53%、標準偏差は3.99%、変動係数は5.2%です。このグラフは実験間の変動を示しています。

同じ過酸化水素曝露を6回繰り返し、各回のデータをグレーのバーで示しています。各ボックスは、各回の少なくとも100個の個々のコメットにおけるテールDNAパーセントの中央値を表しています。6回の繰り返しの平均値は49.57%であり、ここでは黒いバーで示されています。

6回の繰り返し測定における標準偏差は4.99%であり、平均値の誤差棒は2.04%です。これは、従来の一般的なアッセイと同様に、図中のエラーバーとして示されています。研究者は、細胞内で生成されるDNA損傷のタイプに関するさらなる疑問に答えるために、精製された病変特異的酵素を添加するなど、この手順に変更を加えたり、他の手法を使用したりすることが可能です。コメットチップ技術は、哺乳類細胞におけるDNA損傷と修復に関する研究への道を切り開きました。

また、ハイスループットであるため、サンプルの数の問題でこれまで不可能であった臨床研究や疫学研究を行うことが可能になります。