実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

この手順の全体的な目標は、転写翻訳またはTX tlと呼ばれる大腸菌ベースの無細胞発現系を作成することです。これは、まずTX TL粗細胞抽出物、アミノ酸溶液、エネルギー溶液の3つの初期成分を作ることによって達成されます。アミノ酸溶液とエネルギー溶液は、後で組み合わせてTX TLバッファーを作ります。

2番目のステップは、粗細胞抽出物を較正して、最大レベルの発現でTX TL反応を生成するための最適なマグネシウム、カリウム、およびDTT濃度を決定することです。次に、キャリブレーション結果を使用して、バッファー粗細胞抽出物とDNAで作られた3チューブTX TLシステムを作成します。最後のステップは、作成したばかりの試薬を使用してTX TL反応を実行することです。

最終的に、TX TLは、合成生物学回路や従来の無細胞発現アプリケーションの実証に使用されます。この方法は、in vivoでそれをエミュレートするin vitroの等価環境を提供することにより、合成生物学の分野における回路の試験に役立ちます。この手法の意味するところは、in vivoですべてのプロトタイピングステップを行う必要性を排除することにより、合成生物学的設計の速度を上げることにまで及びます。

手術を補助するのは、私たちのグループの研究助手であるクレア・ヘイズです。このビデオは、撮影に不可欠なプロトコルの一部のセクションのみを通過することに注意してください。完全なプロトコルは、テキスト記事で入手できます。

このプロトコルの早い段階で、細菌細胞を増殖させ、ペレット化しました。次に、細菌細胞をビーズビーターを使用して溶解します。細胞懸濁液を含むすべての50ミリリットルのファルコンチューブを氷上に保管してください。

このビデオでは、ビーズビーズのデモンストレーションは1つのチューブのみで行います。ビーズは、全ビーズの3分の1を使用して、それぞれ3つのアリコートでFalconチューブに断続的に加える必要があります。ビーズの最初のアリコートをチューブの渦に30秒間加え、氷の上に置きます。

同様に、ビーズの2番目のアリコート、渦、および氷の上に置きます。最後のアリコートを追加し、ボルテックス処理でビーズが均一に分布していることを確認した後、3番目のボルテックスステップの後に濃厚なペーストが形成されます。チューブを氷の上に置きます。

滅菌済みのハサミを使用して端を切り取り、5ミリリットルの容量のピペットチップを準備します。3〜4ミリメートルの開口部を作成するには、ピペットを2ミリリットルにダイヤルします。20本の滅菌ビーズビーズチューブを氷の上に置きます。

改良したピペットを使用して、ビーズセル溶液の高粘度を確認します。ピペットの先端からかろうじて出るところまで粘性があるはずです。駆出時には、ビーズセル溶液をFalconチューブから取り出し、ビーズビーズチューブに移します。

それをミニ遠心分離機で非常に短時間フルスピンで満たします。ビーズを再分配せずに気泡を除去するには、チューブにビーズセル溶液を加えて凹型メニスカスを形成します。次に、ビーズビーズチューブキャップの内側にビーズセル溶液をごく少量

キャップの外側の縁に溶液を入れないように注意してください。そうしないと、ビーズビーズチューブが十分に閉じません。平らな面でキャップを軽くたたき、キャップの底に気泡がないことを確認します。

ビードビートチューブにキャップをします。正しく行われた場合、キャップはしっかりと密封されるべきです。気泡が見えてはならず、ビーズセル溶液がここからあふれても、ビーズビーズを効率的に達成するには2人が必要です。

充填されたチューブをビーズビーズのアシスタントに渡し、最初のデモンストレーターは残りのビーズセル溶液でさらにビーズビーズチューブを充填し続けます。充填されたビーズビーズチューブを取り、氷の上に置きます。2つの充填されたビーズビーズチューブが収集され、少なくとも1分間氷上に置かれます。

1本のチューブに46RPMで30秒間ビーズビーズのビーズ加工を開始します。もう一方のチューブを叩きながら、氷の上に逆さまに30秒間置きます。充填された各ビーズビーズチューブが合計1分間叩かれるように、ビーズとアイシングを繰り返します。

充填されたすべてのビーズビーズチューブが処理されたら、15ミリリットルのファルコンチューブからフィルター装置を構築します。まず、新しいビーズビーズキャップの平らな部分をチューブの底に向けて上向きに追加します。次に、処理されたビーズビーズチューブからキャップを取り外し、マイクロクロマトグラフィーカラムを処理されたビーズビーズチューブの端にしっかりと押し付けて、完全に密封します。

マイクロクロマトグラフィーカラムのelucian側をはがし、elucianを配置します。空のビーズビーズチューブに閉じ込めます。この複合体を15ミリリットルのファルコンチューブに入れます。

充填されたすべてのビーズビートチューブのフィルター装置を構築し、氷上に保ちます。完全な遠心分離機では、濾過装置の鷹の管は4つの摂氏温度で5分間6、000 Gで空けられてビーズから抽出物そして餌を分けます。遠心分離後、各ビーズビーズチューブが生存可能な抽出物を生成したことを確認します。

適切に叩かれた抽出物は濁ることはなく、ペレットは左のチューブで示されているように2つの異なる層を持ちます。右の例に示すように、濁ったチューブは廃棄する必要があります。上清を非濁液チューブから個々の1.75ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ペレットをできるだけ少なくします。

すべてのビーズビーズチューブが処理されるまで、氷上に置いてください。次に、マイクロ遠心チューブをスピンダウンし、上清を回収します。500マイクロリットルのペレットフリー上清を新しいビーズビーズチューブに固めた後。

キャップを取り外した状態でチューブを220 RPMおよび37°Cで80分間インキュベートします。これにより、ビーズビーズプロセス中に放出される内因性エキソヌクレアーゼを使用して、残りの核酸が消化されます。インキュベーションが完了すると、抽出物は濁って見えるはずです。

抽出物を1.75ミリリットルのマイクロ遠心分離管に1.5ミリリットルまで、12, 000Gで10分間摂氏4度で遠心分離機として統合します。ピペットを使用して、ペレットフリーの上清を1.75ミリリットルのマイクロ遠心チューブに固めて収量を小さくするか、氷上での収量を増やすために15ミリリットルのファルコンチューブに固めます。チューブにキャップをし、反転させてよく混ぜます。

後でタンパク質濃度を測定するために、氷上で10マイクロリットルの上清を保存します。生成される抽出物の総量を決定し、必要な数の分子量カットオフ透析カセットをS 30 Bバッファーに2分間浸漬して水和します。最大2.5ミリリットルの抽出物をカセットにロードします。

各ビーカーは、摂氏4度で3時間攪拌しながら透析する最大2つのカセットを取ることができます。透析後の処理ステップについては、執筆記事を参照してください。基本的な転写翻訳反応は、粗細胞抽出物、バッファー、DNAの3つの部分から構成されています。

反応の量はさまざまですが、このプロトコルでは、事前に作成されたテンプレートを使用して10マイクロリットルの反応を行います。ここは。紫色の項目はユーザー入力値を示し、青色の項目は、マスターミックス調製セクションとDNA調製セクションを使用して、シリでの実験を反応設計に追加するための追加の試薬を示します。一般に、定数はマスターミックス調製セクションに、変数はDNA調製セクションに入れることができます。

サンプルの蒸発や実験開始時間の偏りを避けるために、実験あたりのサンプル数を最小限に抑えます。この表にサンプル設定を示します。各サンプルのDNAサンプルを調製するには、示されたDNA水とユーザー提供のアイテムをマイクロ遠心チューブにIDアリコートします。

室温で、バッファー抽出物と、氷上およびボルテックス状態に保つグローバルユーザー提供のアイテムからなるマスターミックスを調製します。各項目を添加した後、各DNAサンプルに適量のマスターミックスを加え、室温で保管してください。これを反応開始時間として扱います。

各サンプルをボルテックスし、室温で 10 、 000 G で 30 秒間遠心分離して、残留サンプルを下げ、気泡を減らします。384ウェルプレートで29°Cで反応を実行します。実行時間は実験によって異なりますが、通常は8時間未満で終わります。

実行の完了時には、プレートリーダーからデータを読み取ることができます。この論文では、内因性大腸菌ベースの転写翻訳または TXTL 無細胞発現システムの調製のための 5 日間のプロトコルを紹介します。このシステムの発現条件は、さまざまなプラスミドプロセッシングメソッドとelucianバッファーの影響をテストすることにより最適化されました。

例えば、プラスミド処理方法の比較では、精製方法1ではkaya prep spin mini prep kitのみを使用し、精製方法2では、プラスミドは同じmini prep kitを使用して調製され、その後、カヤックで後処理されます。クイックPCR精製キット。このグラフは、8時間後のエンドポイント蛍光と、12分移動に基づくタンパク質産生の最大速度を示しています:平均エラーバーは、異なる日の4つの独立した実行から1標準偏差です。

観察された発現の違いは、塩分含有量の違いによるものです。ただし、elucian bufferなどの他のアイテムはTXTLに影響を与えない場合があります。異なる濃度のTS塩化物を、プラスミドの1つのアノモルの発現に基づく無細胞発現反応で比較しました。

記載されている濃度は、塩化トリスの最終濃度です。反応では、使用されるelucianバッファーは10ミリモルトリス塩化物エラーバーは、異なる日の3つの独立した実行から1標準偏差です。この図は、グルタミン酸マグネシウム、グルタミン酸カリウム、およびDTTの追加レベルについてキャリブレーションされた粗細胞抽出物の一般的なキャリブレーションプロットを示しています。

8時間後のエンドポイント蛍光と、12分移動平均に基づくタンパク質産生の最大速度が示されています。すべての粗細胞抽出物は、これら3つの変数に対して個別にキャリブレーションする必要があることに注意してください。一般に、結果は、粗細胞抽出物がグルタミン酸マグネシウムレベルに最も敏感であり、次にグルタミン酸カリウムレベルが続くことを示しています。

これらのプロットに基づくと、追加のグルタミン酸マグネシウムの許容範囲は4ミリモル、グルタミン酸カリウムは60〜80ミリモル、DTTは下側で0〜3ミリモルです。各粗細胞抽出物調製物の最終効率は、ユーザーの習熟度や環境条件によって異なります。典型的な収率の変動は5〜10%ですが、異なる日に調製された2つの粗抽出物のエンドポイント蛍光をここに示します。

エラーバーは、異なる日の3つの独立した実行からの1標準偏差です。無細胞発現系を実証するために、Tet抑制に基づく負帰還ループを構築し、TCの有無にかかわらず同じ回路を実行したテストでは、7倍のエンドポイント発現が示されました。発現エラーバーを8時間経過させた後のD-E-G-F-Pレポーターの変更は、異なる日の3回の独立した実行から1標準偏差です。

遺伝的回路は挿入図に示されています。この最終的な図は、競合する粗細胞抽出物のコストと発現分析を示しています。円グラフは、2012年12月現在の試薬コストと1時間あたり14人の人件費に基づいて、TX TL無細胞発現システムの人件費と材料費を内訳

パネルBは、TX無細胞発現システムのコストと他の商用システムを比較しています。コストはマイクロリットルあたりに分類されていますが、反応量はキットごとに異なる場合があります。このシステムの材料費は、マイクロリットル反応あたり約3セントで、これは同等の商用セルフリーシステムと比較して98%のコスト削減です。

パネルCは、TX TL無細胞発現系の収量と他の市販系との比較を示しています。このシステムは、ラムダファージオペレーターを備えたSigma 70ベースのプロモーターまたはT 7駆動プロモーターのいずれかを使用して、レポータータンパク質の1ミリリットルあたり最大0.75ミリグラムを生成できます。これらの比較は、TX TL無細胞発現システムが、T 7ベースのシステムが同様の商用システムに大幅なコスト削減を追加するのと同量のタンパク質を産生できることを示しています。

この技術が、合成生物学における工学プロセスの簡素化への道を開くことを願っています。