Name: 実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: 学ぶTX-TL無細胞発現系の構築と最適化条件の決定。Escherichia coli抽出液を用いた合成生物学回路の試験とタンパク質発現の高速化手法を解説します。

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私たちは、プロジェクトの初期段階での支援をJongminキム、ダン·シーガル·ガスキンズ、アヌThubagere、およびプロトコルを効率化支援のためのエノクヨン、そしてクレアチェンとバークレーリーに感謝します。この材料は、米国防総省の国防高等研究計画庁（DARPA /受注生産）生活ファウンドリプログラム、契約番号HR0011-12-C-0065（DARPA / CMO.ZZSもUCLA /カリフォルニア工科大学医学者によってサポートされていることによって部分的にサポートされる作業に基づいています国防総省、空軍科学研究局、国防科学工学専攻（NDSEG）フェローシップ、32のCFR 168Aによるトレーニングプログラムの親睦と。本書に記載されているビューと結論は著者のものであると表現するものと解釈すべきではない米国防総省の国防高等研究計画庁や米国政府の正式の政策、いずれか明示または黙示、。

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<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li>
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<li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li>
<li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94(1962).</li>
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<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%2Fpromoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li>
<li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li>
<li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells%3A+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135(2006).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+and%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li>
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<li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li>
<li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+amorpha-4%2C11-diene%2C+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489(2009).</li>
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<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明する内在大腸菌ベースTX-TL無細胞発現系は、データ収集まで設定からわずか8時間かかることが簡単に実行3管の反応である。すべての試薬 ​​を作成するプロセスは、5日間の時間の合計（一日だけに大きな労力が要求される）を必要としますが、3000反応に粗抽出物を生成し、バッファ意思万反応のための試薬 ​​（ 図1）。さらに、粗抽出物およびバッファ意思試薬は1準備の複数の用途を可能にし、-80℃で少なくとも1年間安定している。4を 10μlの反応あたり0.11ドル（労働を含む0.26ドル）で、コストが同等の98％以上低い商用システム（ 図2）。 いくつかの未解決の制限は、システムに、しかし、存在する。各粗細胞抽出物調製の端効率は、ユーザの習熟度に、環境条件に基づいて変化し得るもののトンypical収量の変動を5〜10％（ 図4b）の間にある。その結果、両方のエンドポイントでの発現および発現動態におけるバッチ間変動性が予想される。抽出液の作成が完全に自動化されるまで、抽出物を完全に特徴づけされるまで、またはこれらの変化は、おそらく残ります。無細胞発現系が敏感な定量的な実験を行うために使用する場合は、粗細胞抽出物の同じバッチですべての実験を実行することをお勧めします。シングル粗細胞抽出物のバッチからの収率、約3000の反応は、典型的な実験のコースで十分です。我々は変化がスケールアップし、処理を自動化することにより除去することができる疑いがあるが、このような試みは、実質的な資源投資を伴うだろう。 エンドポイントの発現レベルを決定するために合理的に容易であるが、さらに、より多くの作業が無細胞系に固有の理解の動態で行われる必要がある。ことが知られているリソースの両方competitionおよびリソース制限が発現動態に影響を与えることができる。例えば、限られた内因性のシグマ70が増大DNAテンプレートは、ヌクレオチドまたはアミノ酸枯渇のものと類似の発現プロファイルを生成して飽和レジームをもたらすことができる。9,27が、動力学は完全にシステムを利用すると理解されるべきではない。収率の純粋な増大のために、最適化は、機械学習の手法によって行うことができる。リソース競合限定の28の質問は、実験データを用いて検証数学的モデルによって対処することができる。 ここで紹介するプロトコルは、BL21-Rosetta2株に最適化されたが、他のEに一般化されている大腸菌株 。このような遺伝子をコードする経度プロテアーゼおよび稀なtRNAをコードする遺伝子の付加の除去などBL21-Rosetta2における修飾は、最大のタンパク質産生を可能にする。我々は2つの他の抽出株とプロトコルを試みている-だけBL21およびBL21 のTrxAノックアウト -ANをDは50％少ないタンパク質収量を発見した。私たちは、他の株を使用する際に歩留まりが同様に減少すると仮定した。例えば、LB及びその他のリッチブロスのための2×YT増殖培地を切り替えるなどのパラメータにおける他の変化は、減少したタンパク質収量をもたらした。 内因性および外因性の転写-翻訳機構と制御機構の両方を利用する無細胞発現系は、タンパク質および代謝産物発現の両方において、合成生物学の広い用途を有する。代わりT7-調節回路に限定されるもので、一つは、複雑な生体分子を産生想定することができる3,29ネイティブEのミックスを使用して、ユーザ制御可能な設定で大腸菌プロモーターおよび外因的に供給転写および規制のメカニズム。細胞分裂および代謝の制限なしに、そのようなアルテミシニンの製造業者などrepressilator合成回路内または代謝の変動操作された経路を減少またはより良く理解することができる。30,31私たちは海Eは、遺伝子スイッチを実装するだけでなく、シグマ因子の隔離を理解するために、これらの利点を使用9,32このような技術は、「最小」または「人工」のセルのバックボーンを形成することができます- 。小さな、十分に特徴づけられたとの自給自足型身体ユニットエキス。33,34 最終的には、合成生物学のためのプロトタイピング環境として、この内因性の無細胞発現系の即時利用を期待しています。基本的なプラスミド、線形、または化学的に合成さDNA上のテストのサイクル、続く-の愛称「TX-TL生体分子ブレッドボード、「無細胞発現系は、プロトタイピングのラウンドを受けることができる合成回路は、最終的にはin vivo発現宛て制御可能な環境を提供します分析と迅速な修飾による。プロトタイピングのラウンドは、現在開発中の予測数学モデルによって支援することができます。非最終回路のためのクローニングおよびインビボ操作を除去することにより、我々は縁起を予想エンジニアリングサイクル時間ではなく、現在の週の標準1-3日に短縮される。

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

無細胞発現技術は、T7バクテリオファージDNAを用いて、結合された転写翻訳機構を包含する年後に進んで、純粋に並進として1950年に始まった。11,12それ以来、数々の努力が粗細胞抽出物の作成 ​​（またはEを最適化するために行われてきた大腸菌 S30抽出物）。13,14これらの最適化は、ATPの再生又は歪みの修正を介して無細胞タンパク質合成を延長し、プロトコルの時間とコストを低減することが挙げられる。15-17代替の無細胞発現系が存在し、その粗製の代わりに使用する再構成成分発現のための細胞抽出物。5粗細胞抽出物および再構成の両方の方法は、商業用に開発されてきた。 合成生物学の出現により、生物学的なモジュール、および回路設計のテストと表現する十分に特徴付けられたプラットフォーム用の増加が必要とされている。18,19このプラットフォームは、である必要があります、汎用性の高い、十分に特徴付けられ、操作が簡単で、ユーザが指定するコンポーネントに焦点を当てた。半世紀以前に開発されているにもかかわらず、無細胞系は、 大腸菌に基づく彼らは成長と代謝の複雑ずに細胞プロセスのインビトロでの表現に簡略化されているように大腸菌は、本質的に、これらの要件を共有しています。さらに、E.上の生体内作業での基礎知識のすべて大腸菌は、大腸菌に容易に適用されます大腸菌無細胞系。 無細胞発現系は、ほとんどの無細胞発現系の目標を現在までに、合成生物学での用途を持つことができますが、タンパク質や代謝物収量の最大化されています。これは、T7プロモーターによって駆動される配列のT7バクテリオファージ転写を用いることによって達成される。20発現が、 ​​効率的かつ堅牢であるが、これらのシステムは高度に特殊目的を果たす。細胞調節方法は限られている、標的DNAテンプレートは、でなければならないT7プロモーターを含むように再設計し、リボソーム複合体のような特定の配列が転写され、組み立てることができない。21,22既存の無細胞発現系は、内因性の調節機構、合成生物学のために必要な汎用性を維持しながら高い収率を維持することができない。 私たちは、内因性Eを開発しました従来のシステムで実証タンパク質発現の効率を維持しますが、内因性および外因性（T7または他の）メカニズムの両方に基づく発現および調節を可能にすることにより、追加の融通性を付加した大腸菌無細胞発現系。ここで説明するプロトコルは、もともと。木川らもとにして（2004）、Liu ら （2005）が、有意な修飾を有している。それは、効率向上のためのMg-およびK-アセテート上でのMg-およびK-グルタミン酸を利用し、2 -メルカプトエタノールを除去し、ビーズビーターを用いて細胞を溶解する。17,23,24ビーズ-鼓動が均質化を介して選択され、圧力ベースの方法、又はによる競合システムに対するその低コストと同等の収率を超音波処理23 3 -ホスホグリセリン酸（3-PGA）がクレアチンリン酸と比較した場合に優れたタンパク質収量を与えることが見出されたように、エネルギー源として使用され、ホスホエノールピルビン酸。4,25私たちのシステムは、他の商用システムからの収量と同様ラムダファージ事業者とシグマ70ベースのプロモーターまたはT7駆動のプロモーターのいずれかを使用して、レポータータンパク質の0.75 mg / mlの最大生成することができます。4,6 5日すべての必要な試薬（ 図1）を生成するために必要とされる。また、同等の商用無細胞系に比べて98％のコスト削減を提供します-材料費が（ 図2）に含ま労働で0.26ドルに上昇し10μL反応あたり0.11ドルである。

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP バイオメディカル</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD Diagnostics</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ビーズビートチューブ(ポリプロピレンマイクロバイアル)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ビーズ、直径0.1mm</td><td>バイオスペック</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 ロゼッタ 2 大腸菌 Novagen</td><td></td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>キュベット、1.5ml</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>フォリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロバイオスピンクロマトグラフィーカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 384ウェル光学ボトムプレート</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nuncシーリングテープ</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>プロメガ</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RTSアミノ酸サンプラー5</td><td>プライム</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析カセット、10k MWCO(キット)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャー</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA(大腸菌)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>のUSB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1L 遠心分離機ボトル</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A98813</td><td>これは Avanti J-シリーズ専用です。遠心分離機と同等のサイズを使用してください。</td></tr><tr><td>4L三角フラスコ</td><td>キンブルチェイス</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>393127</td><td>または 1L 対応遠心分離機相当。</td></tr><tr><td>Forma 480 オービタルシェーカー</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>または胸部サイズの6x4Lシェーカー相当品です。</td></tr><tr><td>JLA-8.1000ローター</td>ベ<td>ックマン・コールター</td><td>363688</td><td>または1L対応、遠心分離機用の5000 x gローター相当。</td></tr><tr><td>ミニビーズビーター-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">補足資料1。Items. のレシピ
クロラムフェニコール、34 mg / ml:0.51 gのクロラムフェニコールを調製し、15 mlにエタノールを加えます。.フィルター滅菌(0.22&mu;M)、1mlチューブに分注し、-20°Cで保存します。後で使用するためのC. 
2xYT+P+Cm寒天プレート:1.24 g 2xYT、1.6 mlリン酸カリウム二塩基性溶液@ 1 M、0.88 mlリン酸カリウム一塩基性溶液@ 1 M、0.6 g寒天、および水を40 mlに調製します。50°Cまで冷まします。C に 40 &mu; を加算します。100x15 mmのシャーレに25 mlを分注し、1時間冷まします 
2xYT+P 媒体: 124 g 2xYT、160 ml リン酸カリウム二塩基性溶液 @1 M、88 ml リン酸カリウム一塩基性溶液 @ 1 M、および 4 L に水を準備します。アリコートを 2x1.88 L と 0.24 L に分注します><。
Trisベース、2 M: 60.57 gのトリスベースと250mlまでの水を準備します。滅菌し、後で使用するためにRTに保管します. 
DTT、1 M:2.31 g DTTと水を15 mlに調製します。フィルター滅菌(0.22&mu;M)、1mlチューブに分注し、-20°Cで保存します。後で使用するためのC. 
S30A緩衝液:10.88 gのMg-グルタミン酸と24.39 gのK-グルタミン酸、50 mlのトリスを2Mで調製し、酢酸(pH 7.7まで)、および水を2 Lに調製します。C、使用前に4 ml 1 M DTTを追加します. 
S30B緩衝液:10.88 gのMg-グルタミン酸と24.39 gのK-グルタミン酸を調製し、トリスを2 M(pH 8.2まで)、水を2 Lに調製します。C、使用前に2 ml 1 M DTTを追加します. 
HEPES:1.91 gのHEPES(MW 238.21)、KOH(pH 8まで)、および水を4 ml. に調製します
tRNA: 30 mgのtRNAと水を600 μl. に調製します
CoA: 30 mg の CoA (MW 767.53) と 600 μl. までの水を準備します
NAD:34.83 mgのNAD(MW 663.43)、2 Mのトリス(pH 7.5-8まで)、水を300 &mu;lまで加えます(27 &mu;溶液をpH 7.5-8). にするための2 Mのトリスのl
cAMP:42.80 mgのcAMP(MW 329.22)、2 Mのトリス(pH 8まで)、および水を200 μlまで加えます(73 μ;溶液をpH 8). にするために、2 Mのトリスをlで
フォリン酸(33.9 mM):20 mgの固体フォリン酸カルシウム塩(MW 511.5)に、1.15 mlの水を加えます 
スペルミジン: 23.55 &mu;スペルミジン(MW 145.25)のlと水は150 &mu;l。37°C. で短時間溶融した後、室温で調製します。
3-PGA: 1.03 gの3-PGA(MW 230.02)、2 Mのトリス(pH 7.5まで)、および水を3.2 mlに加えます(2 Mで1.73 mlのトリスを加えて溶液をpH 7.5にします). 
ヌクレオチドミックス: 145 mg の ATP 二カリウム塩二水和物 (MW 619.4)、133 mg の GTP 二ナトリウム塩 (MW 567.14)、79.4 mg の CTP 二ナトリウム塩二水和物 (MW 563.16)、82.6 mg の UTP 三ナトリウム塩二水和物 (MW 586.12)、15% 希釈時の KOH (pH 7.5 まで)、水を 1.5 ml に加えます (353 &mu;溶液をpH 7.5). にするための15%希釈でのKOHのl
補足資料2。ブラッドフォードアッセイ.
<オール>
	<li>ブラッドフォードエージェントを4&degから削除します。Cで、室温で設定します。</li>
	<li>50 &mu;l 1 mg/mL および 0.1 mg/mL.</>li の BSA 標準液
	<li>40 &mu;l ステップ1.47.</liからの抽出物の20倍希釈>
	<li>800 &mu;lは7キュベットに水を入れます。</li>
	<li>0 mg/ml、1 mg/ml(10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA)、2 mg/ml(20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA)、4 mg/ml(4 &mu;l 1 mg/ml BSA)、6 mg/ml(6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>2 &mu;サンプルのlと4&mu;サンプルのl.</li>
	<li>200 &mu;各キュベットにブラッドフォード剤のlをピペッティングしてよく混ぜます。室温で少なくとも10分間インキュベートします</li>
	<li>ステップ6.5のキュベットを使用して、OD595nmで標準曲線を作成します。r2 < の場合、標準曲線を拒否します。0.95.</li>
	<li>tep 6.6.</liのキュベットを使用して、OD595nmでの抽出物濃度を測定します>
</オール>
補足資料3。バッファキャリブレーションスプレッドシート. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>を参照してください。 
補足資料 4.セルフリー式 run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">TXTL _JoVE.xlsx</a>を参照してください。</td></tr></tbody></table>

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくtx-tlの無細胞発現系

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

理想的な無細胞発現系は、理論的には体外プラットフォームでも、管理環境下でのin vivo細胞環境をエミュレートすることができます。1これは制御された方法でタンパク質や遺伝子回路を表現するためだけでなく、合成生物学のためのプロトタイピング環境を提供するのに有用である。2,3後者の目的を達成するために、保存する無細胞発現系は、内在大腸菌転写翻訳機構はより正確にT7 RNAポリメラーゼ転写に基づくものよりインビボ細胞動態を反映することができる。我々は、効率的な内因性Eの準備と実行を記述する同じような商用システムへの98％のコスト削減にT7ベースのシステムのようなタンパク質の等量を生成することができ、大腸菌ベースの転写-翻訳（TX-TL）の無細胞発現系。4,5バッファと粗細胞抽出物の調製であるの実行だけでなく、記載され3チューブTX-TL反応。プロトコル全体を準備するために5日かかると1準備で最大3000の単一反応のための十分な材料が得られます。準備された後、各反応は、データ収集と分析のセットアップから8時間の下になります。 Eに規制および転写外因性のメカニズムこのようなラック/ tetリプレッサーおよびT7 RNAポリメラーゼのような大腸菌を 、補充することができる。例えば、mRNAおよびDNAの分解速度などの6内因性特性をも調整することができる。7 TX-TL無細胞発現系は、大について実証されている規模回路組立、生物学的現象を探求し、両方のT7-と内因性プロモーターの下でタンパク質の発現。6,8付随数学モデルが用意されています。9,10結果のシステムは、プロトタイピング環境のような合成生物学のユニークなアプリケーションを持っている、または「TX- TL生体分子ブレッドボード。 &quot;

この5日間のプロトコルは、すべての手順、機器、およびベースの効率的な内在大腸菌ゼロからTX-TLの無細胞発現系を作成し、実行するために必要な追加ソフトウェアの概要を説明します。試薬を用いて、プロトコルは8セットアップ時間以下の反応、収集、およびプロセスデータをとる。

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

この手順の全体的な目標は、転写翻訳またはTX tlと呼ばれる大腸菌ベースの無細胞発現系を作成することです。これは、まずTX TL粗細胞抽出物、アミノ酸溶液、エネルギー溶液の3つの初期成分を作ることによって達成されます。アミノ酸溶液とエネルギー溶液は、後で組み合わせてTX TLバッファーを作ります。2番目のステップは、粗細胞抽出物を較正して、最大レベルの発現でTX TL反応を生成するための最適なマグネシウム、カリウム、およびDTT濃度を決定することです。次に、キャリブレーション結果を使用して、バッファー粗細胞抽出物とDNAで作られた3チューブTX TLシステムを作成します。最後のステップは、作成したばかりの試薬を使用してTX TL反応を実行することです。最終的に、TX TLは、合成生物学回路や従来の無細胞発現アプリケーションの実証に使用されます。この方法は、in vivoでそれをエミュレートするin vitroの等価環境を提供することにより、合成生物学の分野における回路の試験に役立ちます。この手法の意味するところは、in vivoですべてのプロトタイピングステップを行う必要性を排除することにより、合成生物学的設計の速度を上げることにまで及びます。手術を補助するのは、私たちのグループの研究助手であるクレア・ヘイズです。このビデオは、撮影に不可欠なプロトコルの一部のセクションのみを通過することに注意してください。完全なプロトコルは、テキスト記事で入手できます。このプロトコルの早い段階で、細菌細胞を増殖させ、ペレット化しました。次に、細菌細胞をビーズビーターを使用して溶解します。細胞懸濁液を含むすべての50ミリリットルのファルコンチューブを氷上に保管してください。このビデオでは、ビーズビーズのデモンストレーションは1つのチューブのみで行います。ビーズは、全ビーズの3分の1を使用して、それぞれ3つのアリコートでFalconチューブに断続的に加える必要があります。ビーズの最初のアリコートをチューブの渦に30秒間加え、氷の上に置きます。同様に、ビーズの2番目のアリコート、渦、および氷の上に置きます。最後のアリコートを追加し、ボルテックス処理でビーズが均一に分布していることを確認した後、3番目のボルテックスステップの後に濃厚なペーストが形成されます。チューブを氷の上に置きます。滅菌済みのハサミを使用して端を切り取り、5ミリリットルの容量のピペットチップを準備します。3〜4ミリメートルの開口部を作成するには、ピペットを2ミリリットルにダイヤルします。20本の滅菌ビーズビーズチューブを氷の上に置きます。改良したピペットを使用して、ビーズセル溶液の高粘度を確認します。ピペットの先端からかろうじて出るところまで粘性があるはずです。駆出時には、ビーズセル溶液をFalconチューブから取り出し、ビーズビーズチューブに移します。それをミニ遠心分離機で非常に短時間フルスピンで満たします。ビーズを再分配せずに気泡を除去するには、チューブにビーズセル溶液を加えて凹型メニスカスを形成します。次に、ビーズビーズチューブキャップの内側にビーズセル溶液をごく少量加えます。キャップの外側の縁に溶液を入れないように注意してください。そうしないと、ビーズビーズチューブが十分に閉じません。平らな面でキャップを軽くたたき、キャップの底に気泡がないことを確認します。ビードビートチューブにキャップをします。正しく行われた場合、キャップはしっかりと密封されるべきです。気泡が見えてはならず、ビーズセル溶液がここからあふれても、ビーズビーズを効率的に達成するには2人が必要です。充填されたチューブをビーズビーズのアシスタントに渡し、最初のデモンストレーターは残りのビーズセル溶液でさらにビーズビーズチューブを充填し続けます。充填されたビーズビーズチューブを取り、氷の上に置きます。2つの充填されたビーズビーズチューブが収集され、少なくとも1分間氷上に置かれます。1本のチューブに46RPMで30秒間ビーズビーズのビーズ加工を開始します。もう一方のチューブを叩きながら、氷の上に逆さまに30秒間置きます。充填された各ビーズビーズチューブが合計1分間叩かれるように、ビーズとアイシングを繰り返します。充填されたすべてのビーズビーズチューブが処理されたら、15ミリリットルのファルコンチューブからフィルター装置を構築します。まず、新しいビーズビーズキャップの平らな部分をチューブの底に向けて上向きに追加します。次に、処理されたビーズビーズチューブからキャップを取り外し、マイクロクロマトグラフィーカラムを処理されたビーズビーズチューブの端にしっかりと押し付けて、完全に密封します。マイクロクロマトグラフィーカラムのelucian側をはがし、elucianを配置します。空のビーズビーズチューブに閉じ込めます。この複合体を15ミリリットルのファルコンチューブに入れます。充填されたすべてのビーズビートチューブのフィルター装置を構築し、氷上に保ちます。完全な遠心分離機では、濾過装置の鷹の管は4つの摂氏温度で5分間6、000 Gで空けられてビーズから抽出物そして餌を分けます。遠心分離後、各ビーズビーズチューブが生存可能な抽出物を生成したことを確認します。適切に叩かれた抽出物は濁ることはなく、ペレットは左のチューブで示されているように2つの異なる層を持ちます。右の例に示すように、濁ったチューブは廃棄する必要があります。上清を非濁液チューブから個々の1.75ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、ペレットをできるだけ少なくします。すべてのビーズビーズチューブが処理されるまで、氷上に置いてください。次に、マイクロ遠心チューブをスピンダウンし、上清を回収します。500マイクロリットルのペレットフリー上清を新しいビーズビーズチューブに固めた後。キャップを取り外した状態でチューブを220 RPMおよび37°Cで80分間インキュベートします。これにより、ビーズビーズプロセス中に放出される内因性エキソヌクレアーゼを使用して、残りの核酸が消化されます。インキュベーションが完了すると、抽出物は濁って見えるはずです。抽出物を1.75ミリリットルのマイクロ遠心分離管に1.5ミリリットルまで、12, 000Gで10分間摂氏4度で遠心分離機として統合します。ピペットを使用して、ペレットフリーの上清を1.75ミリリットルのマイクロ遠心チューブに固めて収量を小さくするか、氷上での収量を増やすために15ミリリットルのファルコンチューブに固めます。チューブにキャップをし、反転させてよく混ぜます。後でタンパク質濃度を測定するために、氷上で10マイクロリットルの上清を保存します。生成される抽出物の総量を決定し、必要な数の分子量カットオフ透析カセットをS 30 Bバッファーに2分間浸漬して水和します。最大2.5ミリリットルの抽出物をカセットにロードします。各ビーカーは、摂氏4度で3時間攪拌しながら透析する最大2つのカセットを取ることができます。透析後の処理ステップについては、執筆記事を参照してください。基本的な転写翻訳反応は、粗細胞抽出物、バッファー、DNAの3つの部分から構成されています。反応の量はさまざまですが、このプロトコルでは、事前に作成されたテンプレートを使用して10マイクロリットルの反応を行います。ここは。紫色の項目はユーザー入力値を示し、青色の項目は、マスターミックス調製セクションとDNA調製セクションを使用して、シリでの実験を反応設計に追加するための追加の試薬を示します。一般に、定数はマスターミックス調製セクションに、変数はDNA調製セクションに入れることができます。サンプルの蒸発や実験開始時間の偏りを避けるために、実験あたりのサンプル数を最小限に抑えます。この表にサンプル設定を示します。各サンプルのDNAサンプルを調製するには、示されたDNA水とユーザー提供のアイテムをマイクロ遠心チューブにIDアリコートします。室温で、バッファー抽出物と、氷上およびボルテックス状態に保つグローバルユーザー提供のアイテムからなるマスターミックスを調製します。各項目を添加した後、各DNAサンプルに適量のマスターミックスを加え、室温で保管してください。これを反応開始時間として扱います。各サンプルをボルテックスし、室温で 10 、 000 G で 30 秒間遠心分離して、残留サンプルを下げ、気泡を減らします。384ウェルプレートで29°Cで反応を実行します。実行時間は実験によって異なりますが、通常は8時間未満で終わります。実行の完了時には、プレートリーダーからデータを読み取ることができます。この論文では、内因性大腸菌ベースの転写翻訳または TXTL 無細胞発現システムの調製のための 5 日間のプロトコルを紹介します。このシステムの発現条件は、さまざまなプラスミドプロセッシングメソッドとelucianバッファーの影響をテストすることにより最適化されました。例えば、プラスミド処理方法の比較では、精製方法1ではkaya prep spin mini prep kitのみを使用し、精製方法2では、プラスミドは同じmini prep kitを使用して調製され、その後、カヤックで後処理されます。クイックPCR精製キット。このグラフは、8時間後のエンドポイント蛍光と、12分移動に基づくタンパク質産生の最大速度を示しています:平均エラーバーは、異なる日の4つの独立した実行から1標準偏差です。観察された発現の違いは、塩分含有量の違いによるものです。ただし、elucian bufferなどの他のアイテムはTXTLに影響を与えない場合があります。異なる濃度のTS塩化物を、プラスミドの1つのアノモルの発現に基づく無細胞発現反応で比較しました。記載されている濃度は、塩化トリスの最終濃度です。反応では、使用されるelucianバッファーは10ミリモルトリス塩化物エラーバーは、異なる日の3つの独立した実行から1標準偏差です。この図は、グルタミン酸マグネシウム、グルタミン酸カリウム、およびDTTの追加レベルについてキャリブレーションされた粗細胞抽出物の一般的なキャリブレーションプロットを示しています。8時間後のエンドポイント蛍光と、12分移動平均に基づくタンパク質産生の最大速度が示されています。すべての粗細胞抽出物は、これら3つの変数に対して個別にキャリブレーションする必要があることに注意してください。一般に、結果は、粗細胞抽出物がグルタミン酸マグネシウムレベルに最も敏感であり、次にグルタミン酸カリウムレベルが続くことを示しています。これらのプロットに基づくと、追加のグルタミン酸マグネシウムの許容範囲は4ミリモル、グルタミン酸カリウムは60〜80ミリモル、DTTは下側で0〜3ミリモルです。各粗細胞抽出物調製物の最終効率は、ユーザーの習熟度や環境条件によって異なります。典型的な収率の変動は5〜10%ですが、異なる日に調製された2つの粗抽出物のエンドポイント蛍光をここに示します。エラーバーは、異なる日の3つの独立した実行からの1標準偏差です。無細胞発現系を実証するために、Tet抑制に基づく負帰還ループを構築し、TCの有無にかかわらず同じ回路を実行したテストでは、7倍のエンドポイント発現が示されました。発現エラーバーを8時間経過させた後のD-E-G-F-Pレポーターの変更は、異なる日の3回の独立した実行から1標準偏差です。遺伝的回路は挿入図に示されています。この最終的な図は、競合する粗細胞抽出物のコストと発現分析を示しています。円グラフは、2012年12月現在の試薬コストと1時間あたり14人の人件費に基づいて、TX TL無細胞発現システムの人件費と材料費を内訳したものです。パネルBは、TX無細胞発現システムのコストと他の商用システムを比較しています。コストはマイクロリットルあたりに分類されていますが、反応量はキットごとに異なる場合があります。このシステムの材料費は、マイクロリットル反応あたり約3セントで、これは同等の商用セルフリーシステムと比較して98%のコスト削減です。パネルCは、TX TL無細胞発現系の収量と他の市販系との比較を示しています。このシステムは、ラムダファージオペレーターを備えたSigma 70ベースのプロモーターまたはT 7駆動プロモーターのいずれかを使用して、レポータータンパク質の1ミリリットルあたり最大0.75ミリグラムを生成できます。これらの比較は、TX TL無細胞発現システムが、T 7ベースのシステムが同様の商用システムに大幅なコスト削減を追加するのと同量のタンパク質を産生できることを示しています。この技術が、合成生物学における工学プロセスの簡素化への道を開くことを願っています。

protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7...

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この研究は、 大腸菌(E.coli )からの細胞抽出物の調製とそれに続く無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を24時間未満で記載する。無細胞自己誘導(CFAI)プロトコルの説明は、研究者の監督を減らし、得られる細胞抽出物の量を増やすために行われた改善を詳述する。...

無細胞自己誘導ワークフローを使用した24時間以内に細胞から無細胞タンパク質合成へ

このプロトコルは、 ストレプトマイセスベネズエラ 細胞非転写変換(TX-TL)システムから組み換えタンパク質の高収率を合成するための強化された方法を詳述する。...

合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット

ここに提示するのは、エシェリヒア・コリBL21...

線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。...

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

学ぶTX-TL無細胞発現系の構築と最適化条件の決定。Escherichia coli抽出液を用いた合成生物学回路の試験とタンパク質発現の高速化手法を解説します。

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

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