長期的な慢性

本手順の目的は、マウスにおいて持続的な長期的慢性のpseudomonas aerogen気道感染を確立することです。まず、選択したpseudomonas aerogen菌株を培養します。次に、細菌をアガールおよびミネラルオイルと50 °Cで混合し、その後、ゆっくりと連続的に撹拌しながら4 °Cで冷却することで、細菌を小さなアガールビーズに封入します。

次に、PBSで数回洗浄してミネラルオイルを除去し、アガービーズの一部をホモジナイズしてアガープレートに塗布します。細菌含量を決定するための最終ステップとして、アガービーズ懸濁液を数µL、マウスの気管内に注入し、慢性のPseudomonas aerogen肺感染を成立させます。最終的に、感染から異なる時点での気管支肺胞洗浄液および肺を回収し、アガープレートに塗布することで、慢性感染したマウスの割合および生存したマウスの気道内における細菌量を検出できます。既存の方法に対するこれらアガービーズ法の主な利点は、高比率のマウスにおいて安定した長期的な慢性感染が可能であり、最大1ヶ月間にわたって安定した細菌量を維持できることです。

AGAビット法を用いることで、マウスの肺内に細菌がマイクロコロニーとして増殖可能な微好気的条件を構築できます。嚢胞性線維症患者の粘液中での増殖と同様に、これらの手法は、嚢胞性線 fibrosa およびその他の呼吸器疾患の病態生理に関する重要な課題への取り組みや、慢性肺感染症を引き起こす Pseudomonas aeruginosa に対する新規治療法の検討に役立ちます。また、B. subtilis や Staphylococcus aureus を含む他の病原体による慢性感染の導入にも利用可能です。異なる病原体との共感染や競合実験も可能であり、本手順を実演するのは、私の研究室のポストドクターである Pheno 氏と、博士課程の学生である Camil Riva 氏です。マウスへの感染誘導の3日前、-80 °C のストック培養から Pseudomonas aeruginosa をループ一杯分、トリプトサージ大豆アガープレートに接種し、37 °C で一晩培養します。

翌日。37 °Cの振盪インキュベーター（200 RPM）で一晩培養した5 mLの大豆カゼイン消化培地（tryptone soy broth）中の単一コロニーをピックアップします。翌朝、細菌の一晩培養液の少量をリン酸緩衝生理食塩水で1:50に希釈します。その後、600 nmにおける吸光度（OD600）を測定します。

次に、新しいチューブに入れた37°Cでインキュベートした20 millilitersの新鮮なTSBに、細菌懸濁液を2 OD分加えてオーバーナイト培養液を希釈し、振盪インキュベーターを用いて200 RPMで約3〜4時間、合計で10〜50 ODに達するまで対数増殖期まで培養します。Pseudomonas aeruginosaが対数増殖期に達したら、4°Cで2,700 ×gにて15分間遠心分離して細菌細胞を回収し、上清を捨てます。その後。

細菌ペレットを1 mLの滅菌PBSに再懸濁し、ボルテックスで十分に混ぜて完全に分散させます。次に、この細菌懸濁液1 mLを、50 °Cに予熱した液体TSA 9 mLと混合します。この混合液を、50 °Cに予熱した高粘度ミネラルオイルに加えます。

直ちに室温で6分間撹拌します。この際、オイルに目に見える渦が生じるようにしてください。その後、混合物を4 °Cまで冷却し、最低速度で35分間撹拌します。

その後、さらに20分間氷上で静置します。次に、アガービーズを50 mLファルコンチューブに移し、4°Cで15分間、2,700 ×gで遠心分離します。

ミネラルオイルを正確に取り除き、アガービーズのペレットを滅菌PBSで洗浄します。3回の洗浄後、この手順を6回繰り返します。最後の洗浄後は、遠心分離機の代わりに重力による沈降でビーズをペレット化することができます。

アガービーズを20〜30 mLのPBSに再懸濁し、ビーズ0.5 mLを無菌的にホモジナイズします。次に、ホモジナイズしたビーズ100 µLを滅菌PBS 900 µLで希釈し、10倍希釈を6回繰り返し、10⁻⁶まで段階希釈します。

次に、未希釈液を含む段階希釈液をTSAプレートに塗布します。サンプルを10⁻⁶まで希釈し、プレートを37 °Cで培養します。倒立光学顕微鏡を用いて、複数の視野でビーズの直径を測定します。

マウスへの感染させる前に、ビーズの直径が100から200ミクロンであることを確認してください。TSAプレート上のコロニー形成単位数をカウントし、アガロースビーズ懸濁液1ミリリットルあたりのCFU数を決定します。その後、アガロースビーズの量を調節し、50 µLあたり1～2 × 10⁶という最適な接種量になるよう、1ミリリットルあたり2～4 × 10⁷ CFUに調整します。

ケタミンおよびキシラジンで事前に麻酔をかけた6〜8週齢の雄マウスを、ヒートパッドの上に仰臥位で固定し、被毛を70% ethanolで消毒します。皮膚を垂直に切開して気管を露出させます。次に、ピンセットを使用して気管を覆っている筋肉を分離します。

次に、1 mLシリンジでアガロースビーズ懸濁液を最大50 µL採取します。その後、カテーテルで気管を挿管し、アガロースビーズ懸濁液が入った1 mLシリンジをカテーテルに接続します。シリンジのプランジャーをゆっくりと押し、ビーズを肺内に注入します。

次に、縫合クリップを用いて切開部を閉じます。このステップでは、安楽死させたマウスを仰臥位に置き、被毛を70%ethanolで消毒します。

次に、皮膚を垂直に切開して気管と胸郭を露出させます。その後、横隔膜を切開して肺を露出させます。ピンセットを使用して気管の下に縫合糸を通し、カテーテルで気管を挿管します。

次に、縫合糸の両端を引いて、気管にカテーテルを固定します。この際、糸を気管に巻き付けないように注意してください。次に、1 mL シリンジを用いて細胞培養液 1 mL を採取し、カテーテルに接続します。シリンジのプランジャーを押し込んで肺を洗浄し、直ちに液体を回収して 15 mL チューブに保存します。

この手順を合計3 mLの培地を用いて3回繰り返し、その後、肺の回収および解析のために気管支肺胞洗浄液を氷上で保存します。マウスから肺を摘出し、滅菌PBSで洗浄します。

次に、肺葉を分離します。これらを 2 mL の滅菌 PBS が入った丸底チューブに入れ、氷上で保存します。肺を無菌的にホモジナイズし、段階的に希釈します。

ホモジネートをPBSで10倍に希釈します。次に、未希釈のサンプルを含む段階希釈液をTSAプレートに塗布し、37°Cで一晩インキュベートします。氷からBAL液を取り出し、倒立光学顕微鏡下でTurk溶液を用いて2倍に希釈します。

分画細胞数計測のため、BAL液を4°Cで8分間、330 ×gで遠心分離し、ビュルカー細胞計数器を用いて総細胞数を計測します。次に、上清を捨て、10%胎児牛血清含有細胞培養培地を用いて、ペレットを1 million cells/mLの濃度で再懸濁します。顕微鏡スライドとフィルターをサイトスピンの適切なスロットに配置し、カードボードフィルターが中心を向くようにセットします。

各サンプル150 µLをサイトスピン用の適切なウェルにピペットで分注し、サイトスピン centrifugeを用いて300 ×gで5分間遠心分離します。その後、細胞のスポットを確認し、染色後、顕微鏡下でスポットの分化計数を行います。この図は、PAO1参照株およびRP73を用いたPseudomonas aerogenosaの慢性感染のタイムコースを示しています。

各タイムポイントにおける臨床株。ヒストグラムは、菌血症によって誘発された死亡率を赤色で、生存率を灰色で、あるいは感染が消失した動物の割合を白色で、慢性感染を成立させた動物の割合を緑色で示している。Pseudomonas aerogen RP 73 臨床株は、PA o1 研究室株と比較して、慢性感染を成立させる効率が高い。

生存したマウスを指示された時点で安楽死させ、肺を採取してホモジナイズした後、TSAプレートで培養して細菌量を測定した。マウス肺におけるP oh one株およびRP 73株の増殖曲線から、感染後3日目の細菌量は、RP 73株と比較してP oh one株でより高いことが示された。その後、慢性感染が成立する7日目以降、両株の細菌量は肺1個あたり10⁴から10⁵ CFUの間で安定した。RP 73臨床株による慢性感染後7日目に、BAL液中の炎症細胞の動員を評価した。

RP 73感染マウスにおける総白血球数は、非感染マウスに比べて大幅に増加しています。最も多く認められる細胞は好中球であり、慢性感染に対する自然免疫系の顕著な反応が示されています。下のボックス内の矢印は、サイトスピン後のスライド上のスポットに見られる好中球とマクロファージを示しています。

ここでは、rp. 73臨床株による7日間の慢性感染後のマウス肺の組織切片におけるヘマトキシリン・エオジン染色を示しています。矢印で示されたビーズが気管支腔内で観察され、細菌細胞のマイクロコロニーも認められます。感染部位において、気管支および肺実質は、大量の炎症細胞の浸潤によって特徴付けられています。

非感染マウスの気道には炎症細胞が見られませんでしたが、BESの直径と最終濃度は非常に重要な詳細事項です。良好な結果を得るためには、ビーズのサイズが冷却相における撹拌速度に影響されること、および細菌の初期量がビーズの最終希釈に影響を与える可能性があることを留意しておくことが重要です。さらに、マウスの死亡率が低く、慢性感染率が高い適切なシュードモナス菌株を選択することで、使用するマウスの数を最小限に抑えることができます。

マウスへの感染後、細菌数を測定します。さらに、細菌感染に対する潰瘍反応を検討するため、総細胞数および分画細胞数による炎症反応の評価、気管支内のVIRレベルの測定、肺液のサイトカイン分析、ミエロペルオキシダーゼアッセイ、および組織学的解析を行うことができます。Pseudomonasのような日和見感染菌を取り扱う際は危険が伴うため、手袋の着用、バイオセーフティキャビネット内での操作、および無菌操作の徹底など、常に適切な対策を講じることを忘れないでください。

適切な動物モデルの開発により、新規の抗菌および抗炎症分子の前臨床試験が可能となりました。これは、嚢胞性線維症やその他の呼吸器疾患に罹患した患者における肺感染症の将来的な治療介入に向けた重要なステップとなります。