Name: 長期的な慢性緑膿菌気道感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 学ぶ アガロースビーズ法によるマウス慢性緑膿菌気道感染モデルの構築方法。Pseudomonas aeruginosaを用いた長期的な細菌負荷維持と感染症研究への応用を解説します。

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Bragonziの研究室での研究は、イタリアの嚢胞性線維症財団（CFaCore）とEU-F7-2009から223670によって資金を供給されています。この研究の一部は、アレンビック、高度な顕微鏡実験室で行った、マウス組織病理は病理解剖学（サンラファエルバッグ研究所）の単位で行った。

1。慢性感染の準備菌（前マウスの挑戦への3つの二日） <ol><li>適切なPを切り替える緑膿菌の菌株は試験される。 </li><li> Pの白金耳を接種トリプチケースソイ寒天（TSA）プレートに-80℃で保存培養から緑膿菌とは、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>シングルコロニーを採取し、15ミリリットルスナップキャップ付きチューブに5ミリリットルトリプチケースソイブロス（TSB）に接種し、200 rpmで振とう培養器で37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 2。慢性感染症のために寒天ビーズ中の細菌を埋め込む（感染前に一日） <ol><li> 、細菌の一晩培養物の少量のアリコートを取り、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で1:50に希釈し、600nmでの光学密度（OD）を測定する。 </li><li>新鮮なTSBの20ミリリットルを含む新しいスナップインキャップのチューブに2 ODを追加することで、一晩細菌培養を希釈します。 </li><li>約3 37℃で培養する -10月15日ODの合計に達するまで、200 rpmで振とう培養器で期まで4時間。 </li><li>一方、TSAを調製、1.5％寒天、オートクレーブTSB製の水浴中で50℃で平衡化。水浴中で50℃で三角フラスコにpreautoclaved重質鉱油150mlの平衡化。 </li><li> P.回緑膿菌は対数期に到達し、4℃で15分間、2,700×gでの遠心分離により菌体を回収し、上清を捨てる。 </li><li>完全にペレットを再懸濁するために徹底的に細菌の滅菌PBS 1ミリリットル中のペレットと渦を懸濁します。 </li><li>液体TSAの9ミリリットル、50℃で予め平衡と混合1ミリリットル細菌懸濁液</li><li> 10ミリリットルTSA-Pを追加緑膿菌 （50℃で温めておいた）重質鉱油と混合し、直ちに、室温で6分間撹拌する。攪拌は、油で目に見える渦を生成しなければならない。 </li><li>最小種で撹拌し、4℃に混合物を冷却35分（ 図1）のためのEED。 </li><li>さらに20分間氷中の寒天ビーズ - オイル混合物を置き。 </li><li> 4℃で15分間2700×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機に寒天ビーズを転送</li><li>正確に鉱油を除去し、ステップ2.11に記載のように、滅菌PBSで6回洗浄する。 3回洗浄後、ビーズを代わりに遠心分離機を使用する重力によってペレット化することができる。最後の洗浄の後に20〜30 mlのPBSで寒天ビーズを懸濁します。 </li><li>ビーズ（約0.5ミリリットル）の一定量を取り、無菌的に均質化する。 </li><li>均質化されたビーズを100μlを取り、滅菌PBS900μlの中に希釈する。シリアルに10 -6まで1:10希釈する。 </li><li> 10 -6まで希釈されていないサンプルを含むTSAプレート上にプレート段階希釈し、37℃でプレートをインキュベート</li><li>いくつかの分野での倒立光学顕微鏡を用いてビーズ径を測定します。ビーズ直径は、（100〜200ミクロンの間である必要があります<strオング&gt;図1）。 </li><li> 4℃で一晩ビーズを保存</li></ol><img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> 図1。寒天ビーズの準備と、マウスの感染の概要。P. 緑膿菌細胞を1mlのPBSに再懸濁し、液体TSA（50°C）を9mlに添加する。この混合物をフラスコ中で50℃での重質鉱油150mlに加え、室温で6分間、高速で撹拌する。フラスコを35分間ゆっくり撹拌しながら4℃に冷却されると、寒天が固化ビーズを作成し、この混合物中に存在する細菌を寒天ビーズ内に埋め込まれている。細菌細胞を含有する寒天ビーズの詳細については（A）に示されている。滅菌PBSを用いて数回洗浄して鉱物油を除去した後、寒天ビーズ懸濁液をf準備ができているまたは気管内注入（B）によるマウスの肺における接種。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 3。寒天ビーズを用いたマウスの挑戦 倫理声明：このプロトコルおよび実験はサンラファエル科学研究所の動物のケアと倫理委員会からのガイドラインに従ってください。 <ol><li>寒天ビーズ懸濁液中にCFU / mlの数を決定するために、TSAプレート上でコロニー形成単位数（CFU）を数える。 50μlの1〜2×10 6の最適な接種物に到達するために2-4×10 7 CFU / mlに滅菌PBSで寒天ビーズを希釈する。 </li><li> 0.002ミリリットル/ g体重の容量で投与し、0.9％NaCl中C57Bl/6NCr（20〜22 gで6〜8週齢）雄性マウスにケタミン（50 mg / mlで）およびキシラジン（5 mg / mlで）を麻酔腹腔内注射。 注：麻酔がADEQ考えられている動物が静かに静止しuateは、外部刺激に反応しない、かつ一定の心臓や呼吸数を持っています。 </li><li>仰臥位でマウスを置きます。 70％エタノールでマウスのコートを消毒する。 </li><li>皮膚の縦カットで気管を露出し、無菌の、柔軟性のある22のG 0.9ミリメートル×25ミリメートルIVカテーテルで気管挿管、気管内に下降しながら、スタイレットを除去するために注意を保つ。あまりにも深く気管にカテーテルを挿入します。カリーナ（分岐部）に到達する前に停止します。 </li><li>すぐに1ミリリットルの注射器で寒天ビーズ懸濁液の50μlの容量を取得し、カテーテルに取り付けます。ビーズは穏やかに肺内に注入されることを可能にする、シリンジのプランジャを押す。縫合糸クリップを使用して切開を閉じます。 </li><li>完全に目覚めまで加熱パッド上に動物を配置します。 </li></ol> 4。マウス評価<ol><li>コー​​トの質、姿勢を含む臨床徴候について毎日マウスを観察し、歩行、および水和状態。毎日の体重を監視します。 ≥20％の体重を失うのマウスは安楽死させなければなりません。 </li><li> BAL、サイトカイン分析の合計と差分細胞数の面で気管支肺胞洗浄液（BAL）及び肺の収集と、総CFUの分析、組織学的分析、炎症反応のためのポイント6または7を収集するためのポイント5に従い、ミエロ（MPO）活性。 </li></ol> 5。 BAL液の収集と分析<ol><li> CO 2吸入によりマウスを安楽死させる。 </li><li>仰臥位でマウスを置きます。 70％エタノールでマウスのコートを消毒する。 </li><li>皮膚の縦カットで気管および胸郭を公開します。振動板を切断することによって肺を公開します。 </li><li>ピンセットを用いて気管の下に縫合糸を挿入し、滅菌した、柔軟性のある22グラム0.9ミリメートル×25ミリメートルIVカテーテルで気管挿管。約を結合するために縫合糸の両端を引っ張る気管にtheterや気管の周りの糸を結び目。 </li><li> 1ミリリットルの注射器を使用したRPMI 1640の1ミリリットルの容量を取得し、カテーテルに取り付けます。肺を洗浄し、すぐに15ミリリットルチューブに格納し、液体を回収するために、注射器のプランジャーを押してください。 NOTE：サイトカインが分析される場合には、RPMI 1640にプロテアーゼ阻害剤を加える。 </li><li>のRPMI 3ミリリットルの合計で、この手順を3回繰り返します。今後は、氷上でBAL液を保存する。肺の収集と分析のための手順6に進みます。 注：（2.8ミリリットル最大）すべての液体が取得​​されますのでご注意ください。 </li><li> BAL液中に存在する細菌の定量のために、少量のアリコート（300μl）をサンプリングし、直列TSAプレート上に、滅菌PBSでプレートを1:10に希釈し、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>ビルケル細胞計数チャンバ内Tuerk溶液でBAL液を1:2のアリコートを希釈光倒立光学顕微鏡を用いて総細胞数を数える。 </li><li> Rを遠心分離4℃で8分間、330×gでBAL流体をemaining -80℃で保管する、ELISAサイトカイン分析用上清を取りサイトスピンによる差動細胞計数のためのステップ5.10から5.13に従ってください。 </li><li>ペレットが赤色の場合、RBC溶解緩衝液の250〜300μlにペレットを再懸濁し、赤血球を3分間超純蒸留水で1:10に希釈溶解する。 4℃で8分間330×gで2ミリリットルのPBSと遠心で中和</li><li>上澄み液を捨て、RPMI中、10％ウシ胎児血清（FBS）でペレットを再懸濁します。総細胞数に基づいて、1×10 6細胞/ mlを、提供するボリュームを使用する。 </li><li>段ボールフィルタはサイトスピンの中心を向くように、サイトスピンでの適切なスロットに顕微鏡スライドとフィルタを配置します。 5分間300×gで細胞遠心でのサイトスピンし、遠心機の適切なウェルに各サンプルの150μlのピペット。 </li><li> MAによると、ロマノフスキーは市販のキットを使用して染色することによって、スライドを染色するnufacturerの指示や、以前に説明したように12。手順MPO​​活性分析のための5.14から5.17に従ってください。 </li><li>遠心機で4℃で5分間、380×gでBALの残量上清を捨て、細胞を溶解するために超純蒸留水にヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロ250μlの0.5％でペレットを再懸濁します。懸濁液は、アッセイを行う前に、数日間-20℃で凍結することができる。 </li><li>遠心機4℃で30分間、16,000×gで試料の各ウェル場合に必要、また適切な希釈物を二重に試料を添加し、96ウェルプレート中でMPOアッセイを行うために上清を使用する。 </li><li>ウェル中の各試料に加える等量の3,3 &#39;、5,5&#39;ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン（TMB）。反応は、少なくとも5分間、そして色のさらなる発展がなくなるまで、暗所で起こることを可能にする。 </li><li> 2 H 2 SO 4 Aを添加して反応を停止させるND 450 nmでのODを測定する。 OD値は、ペルオキシダーゼ活性に正比例する。 </li></ol> 6。肺およびサイトカイン分析における細菌負荷の測定<ol><li>すぐにBAL液を採取後、マウスからの物品の肺には、、、滅菌PBSで別々のローブが、それらを洗い流し滅菌PBS 2mlで丸底チューブに入れ、氷上に保存します。 NOTE：サイトカインが分析される場合には、チューブにPBSにプロテアーゼ阻害剤を加える。 </li><li>無菌的に肺を均質化、ホモジネートから少量（300μl）を取る、シリアルにTSAプレートに、PBS中にプレートを1:10に希釈し、37℃で一晩インキュベートする。総気道細菌負荷は、BAL液および肺で見つかったCFUの合計になりますのでご注意ください。 </li><li> 4℃で30分間16,000×gで、残りのホモジネートを遠心分離ELISAのサイトカイン分析のために上清を取り、-80℃で保存</li></ol> 7。組織学的検査 &lt;OL&gt; <li>肺の側面とプロパティを保持するために、唯一のBAL液が収集されていない中で肺に組織学的分析を実行します。 </li><li> CO 2吸入によりマウスを安楽死させる。 </li><li>皮膚の縦カットで胸郭を公開、振動板を切断することにより、肺を公開します。 </li><li>物品肺を、光から保護し、4℃で5〜10 mlの10％中性緩衝ホルマリン（4％ホルムアルデヒド）およびストアを含むチューブに入れ、ローブを分離し、PBSでそれらをすすぐ。 </li><li>標準的な手順を用いて、パラフィンに埋め込ま肺、。 </li><li>ミクロトームを用いて5μmの厚さの切片を切った。 </li><li>ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色し、スライドを標準的な手順に従って、カバースリップを有するスライドをカバーする。 </li><li>倒立明視野顕微鏡を用いてスライドを検査し、カメラに顕微鏡を接続して画像を取得する。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

P.における重要なステップ緑膿菌ビーズの準備とマウスの課題を以下に報告されています。 マウスの挑戦のために使用される緑膿菌株は非常に重要です。死亡率、慢性感染症やクリアランスは挑戦のために使用された細菌株によって大きく異なる可能性があります。 P.それは、比較的低い死亡率、より深刻な病変、および高い慢性感染をもたらしたため、 緑膿菌 RP73臨床株はPAO1の参照実験室株よりも好まれた。前臨床試験での薬物検査は、Pで実行する必要がありますシュードモナス株は、長期の慢性感染を確立する際に、それらの高い効率のために選択された。これは科学的な検証と統計解析10,11の要件と一致しているマウスの数を最小限に抑えます。 個々のP.緑膿菌寒天ビーズ調製物は、サイズがおよびCFU / mlで異なります。 A150μmの2×10 7 CFU / mLのve...

嚢胞性線維症（CF）は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝病である。この遺伝子は、ほとんどの上皮細胞の膜上に発現するクロライドチャネルをコードする。気管支拡張症、粘液詰まりおよび実質破壊は徐々にCF患者1のほとんどの深刻な肺疾患と死亡につながる緑膿菌感染が主な原因。 CFの病因と新しい治療法のさらなる発展を理解することは、CFの特徴を持つ動物モデルに依存しています。遺伝子操作のためのCFTR遺伝子改変いくつかのマウスは、生成されたが、CF-のような肺疾患およびCF患者に見られるいくつかの他の臓器の異常を再現するためにこれらの種の能力には限界が広く2実証されている。 感染症の発症は、CF動物モデルにおける主要な課題の一つである。文献CL初期のマウスは、寒天、アガロース、アルギン酸または海藻までの時間として固定化剤中に埋め込 ​​まれた細菌を接種している場合にのみ、一ヶ月以上持続する慢性感染を達成することができることを示唆している。これらの固定化剤は、細菌が、同様にCF患者6の粘液の成長のために、微小コロニーの形で成長させる微好気/嫌気条件を提供しています。慢性感染症のこのモデルは、気道炎症および損傷7を引き起こす肺における細菌の持続性をもたらす。しかしながら、使用される方法細菌株および肺に接種用量に応じて、異なる時点で、肺で回収慢性感染マウスのパーセンテージおよび細菌負荷はかなり異なることができる。具体的には、長期的な慢性感染症のための主な課題は、P.により低細菌量のままチャレンジ後の緑膿菌感染したマウスの週の低い割合、THAを示すT菌体を徐々にホストによってクリアされます。 P.を選択することによりCFのコレクションから、 緑膿菌の RP73臨床株は8我々は成功し、低死亡率を得、より重度の病変を分離し、C57Bl/6NCrlマウスにおける1ヶ月まで安定細菌負荷による慢性感染の割合が高い。 本論文では、Pを埋め込 ​​むための方法論を詳述寒天ビーズ中緑膿菌 、我々は、気管内注入によりマウスを感染させた肺中の細菌負荷およびサイトカインを測定し、BAL液を採取し、組織学的検査を行った。全体的に、このプロトコルは、病因の8,9に根本的に重要な問題に対処するとP.に対する新規治療法をテストする際に研究者を支援します緑膿菌慢性感染10,11。

<table><tbody><tr><td>バクトトリプシン大豆スープ</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>ディフコ寒天、粒状</td><td>ベクトンディキンソン</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>重鉱物油</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-ケタミン塩酸塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>塩酸キシラジン</td> シ<td>グマアルドリッチ</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>1 mlシリンジ25 G 5/8インチ&nbsp;0.5 mm x 16 mm</td><td>PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>カテーテル 22 G 0.9 mm x 25 mm</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子 - 0.5 mm 先端 湾曲</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11152-10</td><td></td></tr> ハ<tr><td>サミ、アイリス、11 cm、ストレート</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸クリップ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸スレッド</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ロンザ</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>ファストリード 102 バーカー ディスポーザブル チャンバー</td><td>バイオシグマ</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>テュルク溶液</td><td>フルーカ</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC 溶解バッファー</td><td>バイオレジェンド</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ cytofunnel</td><td>Thermo Scientific A78710021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky staining set</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルEIA / RIAプレート</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10%中性緩衝ホルマリン</td><td>バイオオプティカ</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>ハリスヘマトキシリン非パパニコロウ</td><td>バイオオプティカ</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosinとアルコール溶液</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>振とうインキュベーター</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>グラント</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>イストラル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレシジョン</td><td>バランス KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>細胞遠心機</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>低コスト 加熱パッド</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>均質化プローブ</td><td>Ystral</td><td>2366925(小)</td><td></td></tr><tr><td>倒立光学顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>カメラ(顕微鏡)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーミクロトーム</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

モデル自体に関する懸念の数があるが、慢性気道感染症のマウスモデルは、嚢胞性線維症（CF）の研究における重要な資産である。少数の報告は、インビボで長期の慢性感染症に焦点を当ててきたが、炎症および感染の初期相は広く、 緑膿菌寒天ビーズマウスモデルを用いて研究されている。長期的な慢性感染症のための主な課題は、P.により低細菌量のまま細菌細胞が徐々にホストによってクリアされていることを示すチャレンジ後の緑膿菌感染したマウスの週の割合が低い。 本論文では、マウスでは、効率的な長期慢性感染を得るための方法を提示します。この方法は、Pの埋め込 ​​みに基づいていますC57Bl/6NCrlマウスの気管内注入に続いて、in vitroで寒天ビーズ中緑膿菌臨床株、。両肺感染はSEVと関連している体重減少、死亡率、慢性感染症、および炎症性応答を含むERAL測定可能なリードアウト。 P.それは、比較的低い死亡率、より深刻な病変、および高い慢性感染をもたらしたため、 緑膿菌 RP73臨床株はPAO1の参照実験室株よりも好まれた。P.緑膿菌のコロニー形成は、3ヶ月以上の肺に固執することができる。マウス肺の病理は、高度な慢性肺疾患を持つCF患者のそれに似ている。 このマウスモデルに最も近いヒトの疾患の過程を模倣および病原性の研究および新規な治療法の評価のための両方に使用することができる。

プロトコルは、P.、正しく行われているときシュードモナス寒天ビーズは100〜200ミクロンの間を測定し、スライド上の寒天ビーズ懸濁液少量のピペッティングすることによって倒立光学顕微鏡で観察することができる。 図1に詳細に示すように、単一の細菌細胞は、寒天ビーズに見える。 Pの選択寒天ビーズ調製に使用される緑膿菌株は非常に重要です。 図2と表1 Pとマウスの感染後に得られたデータを示している緑膿菌 PAO1の参照実験室株RP73臨床分離株と比較した。死亡率は、感染の最初の3日以内に観察され、両方の株について低いが、PAO1（図2Aおよび2B）より高い。生存マウスにおける慢性感染症の割合の面でかなりの違いがPAO1とRP73チャレンジしたマウスの間で観察することができます。ウコンE 3日目、感染後、すべてのマウ...

我々は、マウスモデルにおいて、長期持続性の慢性緑膿菌気道感染を確立する寒天ビーズ法を記載している。

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

本手順の目的は、マウスにおいて持続的な長期的慢性のpseudomonas aerogen気道感染を確立することです。まず、選択したpseudomonas aerogen菌株を培養します。次に、細菌をアガールおよびミネラルオイルと50 °Cで混合し、その後、ゆっくりと連続的に撹拌しながら4 °Cで冷却することで、細菌を小さなアガールビーズに封入します。次に、PBSで数回洗浄してミネラルオイルを除去し、アガービーズの一部をホモジナイズしてアガープレートに塗布します。細菌含量を決定するための最終ステップとして、アガービーズ懸濁液を数µL、マウスの気管内に注入し、慢性のPseudomonas aerogen肺感染を成立させます。最終的に、感染から異なる時点での気管支肺胞洗浄液および肺を回収し、アガープレートに塗布することで、慢性感染したマウスの割合および生存したマウスの気道内における細菌量を検出できます。既存の方法に対するこれらアガービーズ法の主な利点は、高比率のマウスにおいて安定した長期的な慢性感染が可能であり、最大1ヶ月間にわたって安定した細菌量を維持できることです。AGAビット法を用いることで、マウスの肺内に細菌がマイクロコロニーとして増殖可能な微好気的条件を構築できます。嚢胞性線維症患者の粘液中での増殖と同様に、これらの手法は、嚢胞性線 fibrosa およびその他の呼吸器疾患の病態生理に関する重要な課題への取り組みや、慢性肺感染症を引き起こす Pseudomonas aeruginosa に対する新規治療法の検討に役立ちます。また、B. subtilis や Staphylococcus aureus を含む他の病原体による慢性感染の導入にも利用可能です。異なる病原体との共感染や競合実験も可能であり、本手順を実演するのは、私の研究室のポストドクターである Pheno 氏と、博士課程の学生である Camil Riva 氏です。マウスへの感染誘導の3日前、-80 °C のストック培養から Pseudomonas aeruginosa をループ一杯分、トリプトサージ大豆アガープレートに接種し、37 °C で一晩培養します。翌日。37 °Cの振盪インキュベーター（200 RPM）で一晩培養した5 mLの大豆カゼイン消化培地（tryptone soy broth）中の単一コロニーをピックアップします。翌朝、細菌の一晩培養液の少量をリン酸緩衝生理食塩水で1:50に希釈します。その後、600 nmにおける吸光度（OD600）を測定します。次に、新しいチューブに入れた37°Cでインキュベートした20 millilitersの新鮮なTSBに、細菌懸濁液を2 OD分加えてオーバーナイト培養液を希釈し、振盪インキュベーターを用いて200 RPMで約3〜4時間、合計で10〜50 ODに達するまで対数増殖期まで培養します。Pseudomonas aeruginosaが対数増殖期に達したら、4°Cで2,700 ×gにて15分間遠心分離して細菌細胞を回収し、上清を捨てます。その後。細菌ペレットを1 mLの滅菌PBSに再懸濁し、ボルテックスで十分に混ぜて完全に分散させます。次に、この細菌懸濁液1 mLを、50 °Cに予熱した液体TSA 9 mLと混合します。この混合液を、50 °Cに予熱した高粘度ミネラルオイルに加えます。直ちに室温で6分間撹拌します。この際、オイルに目に見える渦が生じるようにしてください。その後、混合物を4 °Cまで冷却し、最低速度で35分間撹拌します。その後、さらに20分間氷上で静置します。次に、アガービーズを50 mLファルコンチューブに移し、4°Cで15分間、2,700 ×gで遠心分離します。ミネラルオイルを正確に取り除き、アガービーズのペレットを滅菌PBSで洗浄します。3回の洗浄後、この手順を6回繰り返します。最後の洗浄後は、遠心分離機の代わりに重力による沈降でビーズをペレット化することができます。アガービーズを20〜30 mLのPBSに再懸濁し、ビーズ0.5 mLを無菌的にホモジナイズします。次に、ホモジナイズしたビーズ100 µLを滅菌PBS 900 µLで希釈し、10倍希釈を6回繰り返し、10⁻⁶まで段階希釈します。次に、未希釈液を含む段階希釈液をTSAプレートに塗布します。サンプルを10⁻⁶まで希釈し、プレートを37 °Cで培養します。倒立光学顕微鏡を用いて、複数の視野でビーズの直径を測定します。マウスへの感染させる前に、ビーズの直径が100から200ミクロンであることを確認してください。TSAプレート上のコロニー形成単位数をカウントし、アガロースビーズ懸濁液1ミリリットルあたりのCFU数を決定します。その後、アガロースビーズの量を調節し、50 µLあたり1～2 × 10⁶という最適な接種量になるよう、1ミリリットルあたり2～4 × 10⁷ CFUに調整します。ケタミンおよびキシラジンで事前に麻酔をかけた6〜8週齢の雄マウスを、ヒートパッドの上に仰臥位で固定し、被毛を70% ethanolで消毒します。皮膚を垂直に切開して気管を露出させます。次に、ピンセットを使用して気管を覆っている筋肉を分離します。次に、1 mLシリンジでアガロースビーズ懸濁液を最大50 µL採取します。その後、カテーテルで気管を挿管し、アガロースビーズ懸濁液が入った1 mLシリンジをカテーテルに接続します。シリンジのプランジャーをゆっくりと押し、ビーズを肺内に注入します。次に、縫合クリップを用いて切開部を閉じます。このステップでは、安楽死させたマウスを仰臥位に置き、被毛を70%ethanolで消毒します。次に、皮膚を垂直に切開して気管と胸郭を露出させます。その後、横隔膜を切開して肺を露出させます。ピンセットを使用して気管の下に縫合糸を通し、カテーテルで気管を挿管します。次に、縫合糸の両端を引いて、気管にカテーテルを固定します。この際、糸を気管に巻き付けないように注意してください。次に、1 mL シリンジを用いて細胞培養液 1 mL を採取し、カテーテルに接続します。シリンジのプランジャーを押し込んで肺を洗浄し、直ちに液体を回収して 15 mL チューブに保存します。この手順を合計3 mLの培地を用いて3回繰り返し、その後、肺の回収および解析のために気管支肺胞洗浄液を氷上で保存します。マウスから肺を摘出し、滅菌PBSで洗浄します。次に、肺葉を分離します。これらを 2 mL の滅菌 PBS が入った丸底チューブに入れ、氷上で保存します。肺を無菌的にホモジナイズし、段階的に希釈します。ホモジネートをPBSで10倍に希釈します。次に、未希釈のサンプルを含む段階希釈液をTSAプレートに塗布し、37°Cで一晩インキュベートします。氷からBAL液を取り出し、倒立光学顕微鏡下でTurk溶液を用いて2倍に希釈します。分画細胞数計測のため、BAL液を4°Cで8分間、330 ×gで遠心分離し、ビュルカー細胞計数器を用いて総細胞数を計測します。次に、上清を捨て、10%胎児牛血清含有細胞培養培地を用いて、ペレットを1 million cells/mLの濃度で再懸濁します。顕微鏡スライドとフィルターをサイトスピンの適切なスロットに配置し、カードボードフィルターが中心を向くようにセットします。各サンプル150 µLをサイトスピン用の適切なウェルにピペットで分注し、サイトスピン centrifugeを用いて300 ×gで5分間遠心分離します。その後、細胞のスポットを確認し、染色後、顕微鏡下でスポットの分化計数を行います。この図は、PAO1参照株およびRP73を用いたPseudomonas aerogenosaの慢性感染のタイムコースを示しています。各タイムポイントにおける臨床株。ヒストグラムは、菌血症によって誘発された死亡率を赤色で、生存率を灰色で、あるいは感染が消失した動物の割合を白色で、慢性感染を成立させた動物の割合を緑色で示している。Pseudomonas aerogen RP 73 臨床株は、PA o1 研究室株と比較して、慢性感染を成立させる効率が高い。生存したマウスを指示された時点で安楽死させ、肺を採取してホモジナイズした後、TSAプレートで培養して細菌量を測定した。マウス肺におけるP oh one株およびRP 73株の増殖曲線から、感染後3日目の細菌量は、RP 73株と比較してP oh one株でより高いことが示された。その後、慢性感染が成立する7日目以降、両株の細菌量は肺1個あたり10⁴から10⁵ CFUの間で安定した。RP 73臨床株による慢性感染後7日目に、BAL液中の炎症細胞の動員を評価した。RP 73感染マウスにおける総白血球数は、非感染マウスに比べて大幅に増加しています。最も多く認められる細胞は好中球であり、慢性感染に対する自然免疫系の顕著な反応が示されています。下のボックス内の矢印は、サイトスピン後のスライド上のスポットに見られる好中球とマクロファージを示しています。ここでは、rp. 73臨床株による7日間の慢性感染後のマウス肺の組織切片におけるヘマトキシリン・エオジン染色を示しています。矢印で示されたビーズが気管支腔内で観察され、細菌細胞のマイクロコロニーも認められます。感染部位において、気管支および肺実質は、大量の炎症細胞の浸潤によって特徴付けられています。非感染マウスの気道には炎症細胞が見られませんでしたが、BESの直径と最終濃度は非常に重要な詳細事項です。良好な結果を得るためには、ビーズのサイズが冷却相における撹拌速度に影響されること、および細菌の初期量がビーズの最終希釈に影響を与える可能性があることを留意しておくことが重要です。さらに、マウスの死亡率が低く、慢性感染率が高い適切なシュードモナス菌株を選択することで、使用するマウスの数を最小限に抑えることができます。マウスへの感染後、細菌数を測定します。さらに、細菌感染に対する潰瘍反応を検討するため、総細胞数および分画細胞数による炎症反応の評価、気管支内のVIRレベルの測定、肺液のサイトカイン分析、ミエロペルオキシダーゼアッセイ、および組織学的解析を行うことができます。Pseudomonasのような日和見感染菌を取り扱う際は危険が伴うため、手袋の着用、バイオセーフティキャビネット内での操作、および無菌操作の徹底など、常に適切な対策を講じることを忘れないでください。適切な動物モデルの開発により、新規の抗菌および抗炎症分子の前臨床試験が可能となりました。これは、嚢胞性線維症やその他の呼吸器疾患に罹患した患者における肺感染症の将来的な治療介入に向けた重要なステップとなります。

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