Name: 線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶLAM-PCR法でウイルスベクター挿入部位を正確に同定し、遺伝子治療のクローン動態とバイオセーフティを評価する。ゲノム解析と深層シーケンスを活用した革新的アプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

資金は、Divie Forschungsgemeinschaft (SPP1230, Tumor Center Heidelberg/Mannheimの助成金), Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), 欧州委員会のVIth + VIIth Framework Programs (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST)によって提供されました。ビデオでプロトコル技術を実演してくれたIna Kutscheraに感謝します。

リンカーカセット1。準備（LC） <ol><li> LC1オリゴヌクレオチド（ 表1）の40μL、LC2オリゴヌクレオチド（適切な制限酵素オーバーハングを有する表1）の40μL、110μLのTris-HCl（100ミリモル、pH7.5）にし、10μlの250のMgCl 2を混ぜる。 </li><li> 5分間95℃でインキュベートし、反応を室温までゆっくりと冷ましてみましょう。 300μlのH 2 Oを加え、遠心分離フィルターにdsLinker-DNAを集中。 0.2 PCRチューブで準備リンカーカセットの溶出液を、アリコート10μlに80μlのH 2 Oを追加します。 </li></ol>ベクターゲノム接合の2。プレ増幅<ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 <ol><li> DNAサンプルの濃度を決定する。 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（LAM/100-1のため1〜1,000 ngの、nrLAM 000 NG）。 DNAの量は、各サンプルにし、RANに等しくなるはずである0.5から25μLのGE。 </li><li> 表2に記載したようにPCRマスターミックスを調製ミックス（50 - x）を0.2ミリリットルのPCRチューブ中の各DNAサンプルとマスターミックス液。 </li></ol></li><li> 表2に例示したPCR条件を用いて、プリアンプするベクターゲノム接合部。PCRの完了後、各PCRチューブおよびPCR再放送番組に0.5μlのTaqポリメラーゼを加える。 PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる</li></ol> PCR産物の3。磁気分離<ol><li>磁性ビーズの作製<ol><li>ピペット1.5ミリリットルチューブにストレプトアビジン被覆磁性ビーズを20μl（200μgの）、室温で磁性粒子分離（MPS）に1分間さらすこと。上清を捨てる。 </li><li> MPSからチューブを外し、40μLPSB / 0.1％のBSA（pH7.5）中の磁気ビーズを懸濁します。 1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。一度この手順を繰り返します。 </li><li>洗浄ビーズWI3 MのLiCl溶液20μl（3 MのLiCl、10mMトリス-HCl、1mMのEDTA）番目1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）50μlに再懸濁ビーズ。 </li></ol></li><li>作製した磁気ビーズを50μlのステップ2.2からの全体のPCR反応を混ぜる。少なくとも室温で2時間、水平振とう器（300 rpm）の上でインキュベートする。このステップでは、コーティングされたビーズ（DNA-ビーズ複合体）をストレプトアビジンビオチン化PCR産物に結合できます。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。 </li><li>室温で1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁すぐにLAMやnrLAMステップ5ステップ4に進みます。 </li></ol> 4。LAM-手順<ol><li>二本鎖DNA（dsDNAの）合成（LAMのみ） <ol><li> 1分間のMPSとDIS、ステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開カード上清。 H 2 Oを8.25μL、1μlの10倍ヘキサバッファー、0.25μLのdNTP（10 mM）および0.5μL（2 U）ノウポリメラーゼを追加します。 1時間37℃でインキュベートする。 </li><li> H 2 Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁</li></ol></li><li>制限消化<ol><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。制限酵素バッファー、制限酵素0.5μlの1μLの10倍、8.5μlのH 2 Oを加え、1時間反応をインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。 注：制限酵素のメーカーが推奨する温度で反応をインキュベートする。内に存在するか、目的のDNAで前増幅のために使用されるプライマー結合部位の下流に制限部位が存在しないことを確認してください。適当な制限酵素/制限酵素の組み合わせの選択のために9を参照してください。 </li></ol></li><li> DSリンカ（LK）の連結<ol><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μlのH 2 O、1μLの10X FastLinkバッファー、1μlのATP（10mM）を、ステップ1.2〜2μLリンカーカセット、および1μlの高速リンクDNAリガーゼ（2単位/μl）を追加します。 5分間室温でインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。 </li></ol></li><li>合成したdsDNAの変性<ol><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μLの0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。水平シェーカー上で室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む前置増幅、ベクターゲノム接合を収集します。すぐに-20℃で、ステップ6またはストア上清を進める</li></ol></li></ol> 5。nrLAM - 手順<ol><li>一本鎖リンカーのライゲーション（SSLC）（nrLAMのみ） <ol><li> MPSにステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開1分間、上澄みを捨てる。 6.5μlのH 2 Oを追加し、1μlを10倍反応バッファーを、CircLigase 0.5μLのMnCl 2（50mm）で、0.5のATP（1 mM）をμL、1μlのssLinkerオリゴヌクレオチドおよび0.5μlのCircLigase（100 U /μL）。 1時間60℃でインキュベートする。 </li><li> H 2 Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を洗うこの場合も、1分間のMPSに公開上清を廃棄し、10μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁</li></ol></li></ol> 6。指数関数的増幅I <ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 <ol><li> （ステップ4.4.2（LAM）または5.1.2（nrLAM）から）、ピペット2μlのテンプレートDNA 0.2ミリリットルのPCRチューブに。 </li><li> 表3に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ6.1.1から各サンプルにマスターミックス48μLを追加し、PCR conditioによりベクターゲノム接合部を増幅する表3に例示したナノは、PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。 </li></ol></li></ol> PCR産物の7。磁気分離<ol><li> 3.1.3 - ステップ3.1.1に例示したように磁気ビーズを準備します。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）の（nrLAM用）（LAM用）20μLまたは50μLに再懸濁ビーズ。作製した磁気ビーズ（ステップ7.1）でステップ6.1.2から20μL（LAM）またはPCR反応液50μl（nrLAM）を混合し、室温で2時間、水平振盪（300回転）上でインキュベートする。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。 </li><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 </li><li> 20μL（LAM）または5μL（nrLAM）0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。 Incu水平シェーカー上で室温で10分間BATE、1分間のMPSに公​​開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む増幅されたDNAを収集します。すぐに-20℃でステップ8.1またはストア上清を進める</li></ol> 8。指数関数的増幅II <ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 <ol><li> 0.2ミリリットルのPCRチューブに（ステップ7.3から）ピペット2μlのテンプレートDNA。 </li><li> 表4に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ8.1.1からの各サンプルにマスターミックス48μlを添加し、表4に例示したPCR条件によってベクターゲノム接合を増幅する。PCR産物は、最大4 4℃で保存することができる-20℃での日または長期</li></ol></li><li>可視化するために（NR）LAM-PCR産物を2％アガロースゲル上で、ステップ8.1.2からのPCR産物の10μlを負荷。バンドが可視である場合、高解像度のゲル上でLAM-PCR産物を10μlを分析する。注意：のEthidium臭化変異原性である。非常に慎重に作業し、常に適切な手袋を着用してください。 </li></ol>ハイスループット配列決定のための9。準備<ol><li> （NR）LAM-PCR産物の精製<ol><li>室温AMPure XP磁性ビーズ44μlのステップ8.1.2から40μlのPCR産物を混合します。室温で5分間インキュベートし、さらに2分間、MPSに公​​開。 </li><li>上澄み液を捨て、MPSに200μlの70％エタノールで二度洗い。 </li><li>上澄み液を捨て、30μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間インキュベートし、新鮮な0.2ミリリットルチューブに上清を移す。精製したDNAの濃度を測定する。 </li></ol></li><li> Fusionprimer PCRは、特定のアダプターの配列を決定する追加します。 <ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 </li><li> 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（40 NG）。 DNAの量は、各試料中および0.5〜25μLの範囲で同じにする必要があります。 </li><li>表5に記載したようにPCRマスターミックスを調製入れる。（50 - x）が、ステップ9.2.2からの各サンプルにマスターミックス液を、表5に例示したPCR条件によって（NR）LAM-PCR産物をシーケンシングアダプターを導入するPCR産物-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。 </li><li> Fusionprimer-PCR産物を可視化するためには、2％アガロースゲル上で、ステップ9.2.3からのPCR産物10μlのロード。 9.1.3 - 9.1.1の手順に記載されるように、残りのPCR産物を精製する。正確Fusionprimer-PCR産物の濃度およびフラグメントサイズを定量化するための自​​動化された高分解能電気泳動デバイス上の工程9.4から1μlの精製PCR産物を分析する。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+direct+genomic+sequencing+of+multiple+rare+unknown+flanking+DNA+in+highly+complex+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples.</a> Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).</li>
<li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+%28LAM-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).</li>
<li>Schroeder, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110, 521-529 (2002).</li>
<li>Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+start+regions+in+the+human+genome+are+favored+targets+for+MLV+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration.</a> Science. 300, 1749-1751 (2003).</li>
<li>Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+physical+properties+of+DNA+affecting+target+site+selection+of+sleeping+beauty+and+other+Tc1%2Fmariner+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements.</a> J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).</li>
<li>Lewinski, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+viral+and+cellular+determinants+of+target-site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection.</a> PLoS Pathog. 2, (2006).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+footprinting+of+a+muscle+specific+enhancer+by+ligation+mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
<li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).</li>
<li>Harkey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiarm+high-throughput+integration+site+detection%3A+limitations+of+LAM-PCR+technology+and+optimization+for+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis.</a> Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).</li>
<li>Wang, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bar+coding+and+pyrosequencing+to+analyze+adverse+events+in+therapeutic+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer.</a> Nucleic acids research. 36, (2008).</li>
<li>Paruzynski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+high-throughput+integrome+analyses+by+nrLAM-PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing.</a> Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO2-associated+clonal+T+cell+proliferation+in+two+patients+after+gene+therapy+for+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1.</a> Science. 302, 415-419 (2003).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).</li>
<li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326, 818-823 (2009).</li>
<li>Matrai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-targeted+expression+by+integrase-defective+lentiviral+vectors+induces+antigen-specific+tolerance+in+mice+with+low+genotoxic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.</a> Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).</li>
<li>Penaud-Budloo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+genomes+persist+as+episomal+chromatin+in+primate+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle.</a> Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).</li>
<li>Kaeppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+largely+random+AAV+integration+profile+after+LPLD+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy.</a> Nature medicine. 19, 889-891 (2013).</li>
<li>Voigt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retargeting+sleeping+beauty+transposon+insertions+by+engineered+zinc+finger+DNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains.</a> Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).</li>
<li>Yanez-Munoz, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+gene+therapy+with+nonintegrating+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors.</a> Nature medicine. 12, 348-353 (2006).</li>
<li>Boztug, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-Cell+Gene+Therapy+for+the+Wiskott-Aldrich+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome.</a> N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Deichmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+integration+is+nonrandom+and+clustered+and+influences+the+fate+of+lymphopoiesis+in+SCID-X1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy.</a> J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).</li>
<li>Schwarzwaelder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gammaretrovirus-mediated+correction+of+SCID-X1+is+associated+with+skewed+vector+integration+site+distribution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo.</a> J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).</li>
<li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unbiased+genome-wide+analysis+of+zinc-finger+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).</li>
<li>Dieter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+tumor-initiating+cells+form+human+colon+cancer+tumors+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases.</a> Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).</li>
<li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).</li>
<li>Zavidij, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+blood+formation+by+stem+cells+in+murine+steady-state+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis.</a> Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).</li>
<li>Martins, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-autonomous+T+cell+development+in+the+absence+of+progenitor+import%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import.</a> J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).</li>
<li>Arens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+clonality+analysis+of+next-generation+sequencing-derived+viral+vector+integration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

LAM-PCR法は、既知のDNA領域に隣接する未知のDNA配列を同定することができる。なぜなら公知のDNA配列にハイブリダイズする特異的プライマーを用いた接合の前増幅から得られる高感度のではなく、単一細胞レベルまでさえ稀接合を増幅して検出することができる。反して、ポリクローナル状況でLAM-PCRは、単一の反応において異なる数千の接合部を増幅することができる。 しかしながら、制限酵素の使用にin​​tegromeのみサブフラクションは、すべての特定の制限酵素を用いた接合部の存在についてLAM-PCRにより分析することができる。このように、異なる酵素と同一試料を繰り返し分析が9をお勧めします。まだLAM-PCRアンプリコンをゲル上に存在しない場合、最も可能性の高い公知のDNA断片の位置と選択された制限酵素の認識に最も近い部位との間の距離は、LAM-PCR産物を生じるには大きすぎる9。この場合、他の酵素は、ジャンクションを増幅するために使用されるべきである。 nrLAMは、制限酵素の...

PCR（LAM-PCR）媒介線形増幅は、任意の起源の既知のDNAに隣接する未知の隣接DNAを同定し、特徴づけることができます。具体的には、LAM-PCRは、宿主ゲノム内に1,2（IS）ウイルスベクター組込み部位を局在化するために開発された。レトロウイルスやトランスポゾンのような遺伝的要素が（半）ランダムに3-6で宿主ゲノムにそれらのゲノムを統合。多くの場合、これらのベクターは、集積正確に位置を知ることが決定的である。 LAM-PCRは、ライゲーション媒介PCR法7およびその変種またはインバースPCR 8のような代替技術よりも優れていることが証明されています。この方法の感度およびロバスト性は、ベクターゲノム接合の初期前置増幅、増幅されたPCR産物の磁気選択から生じる。上記の代替的な方法と同様に、LAM-PCR法は、IS 9月11日の検索能力に偏りを導入し、制限酵素の使用に依存している。このように、ISレパートリー（integrome）のサブセットのみが1の反応で検出することができる。このバイアスは、制限酵素9の最適な組み合わせを使用して所与の試料の平行分析することによって最小化される。近年、非制限LAM-PCR（nrLAM-PCR）と呼ばれる技術の変形は、制限酵素の使用を回避し、単一の反応9,12試料の公平なゲノムワイドな解析を可能にする開発されている。 過去には、LAM-PCRは、原因レトロウイルスは、臨床遺伝子治療試験13-15における少数の患者における白血病を引き起こすIS同定するために使用されている。それ以来、LAM-PCRを識別するように適合されている他の組込みベクター（レンチウイルスベクター、トランスポゾン）にも受動的にアデノ随伴ベクター（AAV）またはインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（IDLV）のようなベクトルを統合する統合パターンを識別するためにからのものである16 -21。 LAM-PCR法の応用を広げている。伝統的なLY、技術が広く遺伝子治療を受けた患者における遺伝子改変細胞のクローン組成を研究するために、またはそれらの積分15,16,22-24挙動を解明することにより、新規なベクター系の生物学的安全性を評価するために使用される。最近では、LAM-PCRはIDLV捕獲アッセイ25でデザイナーのヌクレアーゼの特異性とオフターゲット活性を測定することができました。 また、LAM-PCR法は簡単に生物中で時間をかけて導入細胞の運命を追跡することができます。このことは、癌原遺伝子、ならびに腫瘍抑制遺伝子を同定するために、また、造血又は癌幹細胞生物学26-28を研究することを可能にする。少なくとも最後のではなく、LAM-PCR法は、ヒト29（および未発表データ）におけるT細胞受容体の多様性を研究するようになった。 テクノロジーの本質的なパワーは、一塩基rで未知のフランキングDNAの何百万人を特徴づけることができ、深いシーケンシング技術にメソッドをリンクすることによって強化されている全ゲノム中esolution。以下のプロトコルでは、レンチウイルスベクターを特定するために例示的に知られていない隣接DNAの増幅および識別は、ステップバイステップを説明します。プロトコルで使用したオリゴヌクレオチドを表1に示す。抽出DNA又は任意の供給源のcDNAをLAM-PCRおよびnrLAM-PCRのためのDNA鋳型として使用することができる。

<table><tbody><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3001.5000</td><td>代替Taqポリメラーゼを使用することができます</td></tr><tr><td>PCRバッファー</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td>このバッファーの使用は、</td></tr><tr><td>dNTP混合物</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3015.4020</td><td>またはその他のdNTPs</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド(プライマー)</td><td>MWG Biotech</td><td></td><td>HPLC精製</td></tr><tr><td>Dynabeadsをお勧めしますM-280 ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-086</td><td>0.1% wt/vol BSA</td></tr><tr><td>6 M LiCl</td><td>Roth</td><td>3739.1</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>22637</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr>、<tr><td>EDTA</td>、<td>Applichem</td><td>、A1103,0250</td><td>、またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>、Klenow、ポリメラーゼ</td><td>、ロシュ、診断</td><td>10104523001</td><td></td></tr><tr><td>、ヘキサヌクレオチド混合物</td>、<td>ロシュ、11277081001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、制限、エンドヌクレアーゼ</td><td>、NEB</td><td></td><td>、またはその他のサプライヤー</td></tr>、<tr><td>Fast-Link DNAライゲーションキット</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>LK11025</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase ssDNA Ligase Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CL4111K</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11685660001</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>TBEバッファー</td><td>Amresco</td><td>0658</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Applichem</td><td>A2273,0005</td><td>Ethidium bromide is mutagenic</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td>or any other DNA ladder</td></tr><tr><td>20 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71393-1L</td><td>or any other supplier</td></tr><tr><td>Magna-Sep Magnetic Particle Separator&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>K158501</td><td>1.5mlチューブ用</td></tr><tr><td>マグナセップ磁性粒子セパレーター</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズK158696</td><td>96ウェルプレート</td></tr>用 <tr><td>Amicon Ultra-0.5、Ultracel-30 メンブレン</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>PerfectBlue Gelsystem Midi S</td><td>PeqLab</td><td>40-1515</td><td>、またはその他の電気泳動システム&nbsp;</td></tr><tr><td>TProfessional 96</td><td>Biometra</td><td>050-551</td><td>またはその他の 96ウェルプレート用サーモサイクラー</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー KS 260 ベーシック</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td>またはその他の水平シェーカー</td></tr><tr><td>PCR ソフトチューブ 0.2 ml</td><td>Biozym Scientific GmbH</td><td>711082</td><td>またはその他の 0.2 ml PCR チューブ</td></tr><tr><td>1.5 ml チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>12682</td><td>またはその他の 1.5 ml チューブ</td></tr><tr><td>ゲルドキュメンテーションシステム</td><td>PeqLab</td><td></td><td>またはその他のゲルドキュメンテーションシステム</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spreadex EL1200 プレキャストゲル</td><td>Elchrom Scientific</td><td>3497</td><td></td></tr><tr><td>水中ゲル電気泳動装置 SEA 2000&nbsp;</td><td>Elchrom Scientific</td><td>2001E</td><td></td></tr><tr><td>2100電気泳動バイオアナライザーAgilent</td><td>Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

線形増幅媒介のpcr  - 不明隣接するdnaの遺伝的要素と特性の局在

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR)は、遺伝子治療によって治療された患者の遺伝子修正細胞の造血を研究するために開発されました。レトロウイルスベクターは安定して組み込まれているため、組み込み部位を使用して、個々の細胞とその子孫のクローン運命を研究することができます。LAM-PCRは、遺伝子治療で治療された患者における白血病が、隣接するがん原遺伝子の過剰発現を誘発するプロウイルスに由来するという証拠を初めて提供しました。インバースPCRやライゲーション媒介(LM)-PCRなどの既存の方法と比較して、LAM-PCRの高い感度と特異性は、ビオチン化ベクター特異的プライマーを使用した最初の増幅前ステップ(100サイクルの線形PCR)によって達成され、その後の反応ステップを固相(磁気ビーズ)上で実行できます。LAM-PCRは、既知のDNAの近くにある未知のDNAを同定するために現在利用可能な最も感度の高い方法です。最近、制限消化物を回避し、組み込み部位の賦活化バイアスを排除し、宿主ゲノム中のプロウイルス位置の包括的な解析を可能にするLAM-PCRの変異体が開発されました。次のプロトコルでは、統合されたレンチウイルスベクターに隣接する3'-および5'-配列の両方の増幅を段階的に説明しています。

LAM-PCRは、各接合のために定義された断片サイズを有するベクターゲノム接合部の増幅をもたらす。個々のPCR断片のサイズは、ゲノムDNA中の既知の位置と最も近い制限酵素認識部位の間の距離に依存する。これは、例えば 、ゲル電気泳動により分析試料中の増幅された接合部の多様性を可視化することができ、単一の（モノクローナル）、（オリゴクローナ）は、いくつか、又は複数の（ポリクローナル）のバンドがゲル上に存在する場合。 LAM-PCRの結果は、最高の高分解能電気泳動ゲル（ 図2A）によって観察されず、2％アガロースゲル（ 図2B）上で可視化することができる。 nrLAM-PCRは、個々の接合のための様々な長さのPCR断片を生じる。このように、モノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナルサンプルは電気泳動によりスメアとして表示され、視覚的に区別することができない。 2％アガロースゲル上nrLAM-PCR産物を視覚化すること成功を決定するのに十分であるプロトコル（ 図2C）のCESS。回収されたゲノムDNAを配列決定した...

（LAM）-PCR媒介線形増幅は、ゲノムにウイルスベクターを統合の正確な位置を特定するために開発された方法である。技術などの遺伝子治療患者におけるクローン性のダイナミクスを研究するための優れた方法、新規ベクター技術のバイオセーフティ、T細胞の多様性、癌幹細胞モデルであるように進化している

線形増幅媒介のPCR  - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

本実験の全体的な目的は、ゲノム内における組み込みウイルスベクターの正確な位置を特定することである。これは、まずビオチン標識プライマーを用いた線状PCR反応を行い、一連の反応を通じて固相上でゲノムDNAからベクターゲノム接合配列を濃縮することで達成される。これにより、産物の両端に既知のDNA配列を持つ二本鎖DNAが生成され、ベクターゲノム接合部の指数関数的な増幅が可能となる。次に、λ-PCR産物にシーケンシングアダプターを組み込む。未知の隣接DNAをディープシーケンシングで配列決定し特性解析することで、これらの断片からベクター組み込みの正確な位置を明らかにできます。その結果、ゲル電気泳動で確認できるように、増幅されたジャンクションの多様性が示されます。この手法は、臨床遺伝子治療を受けた患者におけるウイルスベクター組み込み部位の分布に関する知見を提供します。また、この手法は、挿入変異誘発、スクリーニング、ウイルス感染、癌、幹細胞のクローナリティ、あるいはT細胞の多様性などの他の研究にも適用可能です。本手順は、私の研究室の技術者であるRAによって実演されます。まず、リンカーカセットを準備します。マイクロ遠心チューブ内で、2種類のLCO Legoを各40 µL、tris hydrochloride 110 µL、およびmagnesium chloride 10 µLを混合します。次に、この混合液を95 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、その後、一晩かけて室温まで徐々に冷却します。翌日、調製した二本鎖リンカーDNAに300 µLの水（water）を加え、マイクロ遠心チューブを用いてフィルターろ過します。フィルターを遠心分離し、チューブ底部に濃縮されたリンカーDNAを回収します。次に、フィルターから回収液を回収します。80 µLの水を加え、ピペッティングします。PCRチューブに10 µLずつ分注します。50 µL反応チューブを用いて、lambのベクターゲノム接合部をPCRでプレアンプリファイします。50 µLの反応液あたり、1 ngから1 µgのサンプルDNAを添加します。NR lambの場合は、少なくとも100 ngのDNAを使用してください。25 µLを超えて添加せず、本文中の表2に従ってPCRを実行してください。完了後、各反応液にさらに0.5 µLのtechを添加し、PCRプログラムを2回目に回します。まず、磁性ビーズを準備します。1.5 mLチューブにstrept ENCコーティング磁性ビーズを20 µL加え、室温で1分間磁性ビーズセパレーターに静置します。その後、上清を除去します。BSAを含むPBS 40 µLでビーズを懸濁させ、再度セパレーターに置いて1分間放置します。上清を、3 M 塩化リチウム溶液 20 µLの洗浄液に置き換えます。再度、ビー

linear-amplification-mediated-pcr-localization-genetic-elements

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

遺伝的関連は、多くの場合、機能レベルで解明されないままである。このメソッドは、転写されたSNPについてヘテロ接合体の細胞を分析することによって遺伝子発現の表現型に関連する遺伝子マーカーの効果を評価することを目的とする。技術は、アレル特異的なプライマー伸長産物を定量化するためにMALDI -...

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、長距離DNA相互作用を同定するための新たな方法です。長い範囲のDNAの相互作用の特徴付けは、私たちは両方の通常の生理機能と疾患状態における遺伝子発現への核アーキテクチャの関係を判別することができます。...

ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。...

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

染色体の絵画は、細胞核の組織化や核型の進化を研究するのに役立つ方法です。ここでは、その場での2次元蛍光化および3次元蛍光(FISH)に使用される単一ポリテン染色体から特定の領域を分離および増幅するアプローチ を...

マラリア蚊の2Dと3D染色体絵画

ここでは、の回復を可能にするために、一緒にワンステップ5μlのマイクロボリューム溶解/ STR増幅を含む強化された増幅プロトコルで、サンプル「DNA触れる」を中に存在するバイオ粒子の収集のために最適化され、効率的な除去戦略を説明短いタンデムリピート（STR）バイオ粒子ドナー（単数または複数）のプロファイル。...

法医学インチタッチDNA」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

ここでは、非コーディング DNA...

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。...

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

学ぶLAM-PCR法でウイルスベクター挿入部位を正確に同定し、遺伝子治療のクローン動態とバイオセーフティを評価する。ゲノム解析と深層シーケンスを活用した革新的アプローチです。

線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

さらに動画を探す