Name: 線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶLAM-PCR法でウイルスベクター挿入部位を正確に同定し、遺伝子治療のクローン動態とバイオセーフティを評価する。ゲノム解析と深層シーケンスを活用した革新的アプローチです。

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資金は、Divie Forschungsgemeinschaft (SPP1230, Tumor Center Heidelberg/Mannheimの助成金), Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), 欧州委員会のVIth + VIIth Framework Programs (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST)によって提供されました。ビデオでプロトコル技術を実演してくれたIna Kutscheraに感謝します。

リンカーカセット1。準備（LC） <ol><li> LC1オリゴヌクレオチド（ 表1）の40μL、LC2オリゴヌクレオチド（適切な制限酵素オーバーハングを有する表1）の40μL、110μLのTris-HCl（100ミリモル、pH7.5）にし、10μlの250のMgCl 2を混ぜる。 </li><li> 5分間95℃でインキュベートし、反応を室温までゆっくりと冷ましてみましょう。 300μlのH 2 Oを加え、遠心分離フィルターにdsLinker-DNAを集中。 0.2 PCRチューブで準備リンカーカセットの溶出液を、アリコート10μlに80μlのH 2 Oを追加します。 </li></ol>ベクターゲノム接合の2。プレ増幅<ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 <ol><li> DNAサンプルの濃度を決定する。 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（LAM/100-1のため1〜1,000 ngの、nrLAM 000 NG）。 DNAの量は、各サンプルにし、RANに等しくなるはずである0.5から25μLのGE。 </li><li> 表2に記載したようにPCRマスターミックスを調製ミックス（50 - x）を0.2ミリリットルのPCRチューブ中の各DNAサンプルとマスターミックス液。 </li></ol></li><li> 表2に例示したPCR条件を用いて、プリアンプするベクターゲノム接合部。PCRの完了後、各PCRチューブおよびPCR再放送番組に0.5μlのTaqポリメラーゼを加える。 PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる</li></ol> PCR産物の3。磁気分離<ol><li>磁性ビーズの作製<ol><li>ピペット1.5ミリリットルチューブにストレプトアビジン被覆磁性ビーズを20μl（200μgの）、室温で磁性粒子分離（MPS）に1分間さらすこと。上清を捨てる。 </li><li> MPSからチューブを外し、40μLPSB / 0.1％のBSA（pH7.5）中の磁気ビーズを懸濁します。 1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。一度この手順を繰り返します。 </li><li>洗浄ビーズWI3 MのLiCl溶液20μl（3 MのLiCl、10mMトリス-HCl、1mMのEDTA）番目1分間のMPSに公​​開し、上澄みを捨てる。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）50μlに再懸濁ビーズ。 </li></ol></li><li>作製した磁気ビーズを50μlのステップ2.2からの全体のPCR反応を混ぜる。少なくとも室温で2時間、水平振とう器（300 rpm）の上でインキュベートする。このステップでは、コーティングされたビーズ（DNA-ビーズ複合体）をストレプトアビジンビオチン化PCR産物に結合できます。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。 </li><li>室温で1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁すぐにLAMやnrLAMステップ5ステップ4に進みます。 </li></ol> 4。LAM-手順<ol><li>二本鎖DNA（dsDNAの）合成（LAMのみ） <ol><li> 1分間のMPSとDIS、ステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開カード上清。 H 2 Oを8.25μL、1μlの10倍ヘキサバッファー、0.25μLのdNTP（10 mM）および0.5μL（2 U）ノウポリメラーゼを追加します。 1時間37℃でインキュベートする。 </li><li> H 2 Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁</li></ol></li><li>制限消化<ol><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。制限酵素バッファー、制限酵素0.5μlの1μLの10倍、8.5μlのH 2 Oを加え、1時間反応をインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。 注：制限酵素のメーカーが推奨する温度で反応をインキュベートする。内に存在するか、目的のDNAで前増幅のために使用されるプライマー結合部位の下流に制限部位が存在しないことを確認してください。適当な制限酵素/制限酵素の組み合わせの選択のために9を参照してください。 </li></ol></li><li> DSリンカ（LK）の連結<ol><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μlのH 2 O、1μLの10X FastLinkバッファー、1μlのATP（10mM）を、ステップ1.2〜2μLリンカーカセット、および1μlの高速リンクDNAリガーゼ（2単位/μl）を追加します。 5分間室温でインキュベートする。ステップ4.1.2を繰り返します。 </li></ol></li><li>合成したdsDNAの変性<ol><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 5μLの0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。水平シェーカー上で室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む前置増幅、ベクターゲノム接合を収集します。すぐに-20℃で、ステップ6またはストア上清を進める</li></ol></li></ol> 5。nrLAM - 手順<ol><li>一本鎖リンカーのライゲーション（SSLC）（nrLAMのみ） <ol><li> MPSにステップ3.3からDNA-ビーズ複合体を公開1分間、上澄みを捨てる。 6.5μlのH 2 Oを追加し、1μlを10倍反応バッファーを、CircLigase 0.5μLのMnCl 2（50mm）で、0.5のATP（1 mM）をμL、1μlのssLinkerオリゴヌクレオチドおよび0.5μlのCircLigase（100 U /μL）。 1時間60℃でインキュベートする。 </li><li> H 2 Oを90μLを加え、1分間のMPSに公開。上澄み液を捨て、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を洗うこの場合も、1分間のMPSに公開上清を廃棄し、10μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁</li></ol></li></ol> 6。指数関数的増幅I <ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 <ol><li> （ステップ4.4.2（LAM）または5.1.2（nrLAM）から）、ピペット2μlのテンプレートDNA 0.2ミリリットルのPCRチューブに。 </li><li> 表3に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ6.1.1から各サンプルにマスターミックス48μLを追加し、PCR conditioによりベクターゲノム接合部を増幅する表3に例示したナノは、PCR産物は、-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。 </li></ol></li></ol> PCR産物の7。磁気分離<ol><li> 3.1.3 - ステップ3.1.1に例示したように磁気ビーズを準備します。 6 M LiCl溶液（6M LiClと10 mMのトリス-HCl、1mMのEDTA）の（nrLAM用）（LAM用）20μLまたは50μLに再懸濁ビーズ。作製した磁気ビーズ（ステップ7.1）でステップ6.1.2から20μL（LAM）またはPCR反応液50μl（nrLAM）を混合し、室温で2時間、水平振盪（300回転）上でインキュベートする。 DNAビーズ複合体を一晩振とう器上でインキュベートし、又は最大4日間4℃で保存することができる。 </li><li> 1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を公開、上清を除去し、100μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間のMPSへのDNA-ビーズ複合体を露出させ、上澄みを捨てる。 </li><li> 20μL（LAM）または5μL（nrLAM）0.1NのNaOHに再懸濁DNA-ビーズ複合体。 Incu水平シェーカー上で室温で10分間BATE、1分間のMPSに公​​開し、新しい1.5 mlチューブに上清を含む増幅されたDNAを収集します。すぐに-20℃でステップ8.1またはストア上清を進める</li></ol> 8。指数関数的増幅II <ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 <ol><li> 0.2ミリリットルのPCRチューブに（ステップ7.3から）ピペット2μlのテンプレートDNA。 </li><li> 表4に記載したようにPCRマスターミックスを調製する。ステップ8.1.1からの各サンプルにマスターミックス48μlを添加し、表4に例示したPCR条件によってベクターゲノム接合を増幅する。PCR産物は、最大4 4℃で保存することができる-20℃での日または長期</li></ol></li><li>可視化するために（NR）LAM-PCR産物を2％アガロースゲル上で、ステップ8.1.2からのPCR産物の10μlを負荷。バンドが可視である場合、高解像度のゲル上でLAM-PCR産物を10μlを分析する。注意：のEthidium臭化変異原性である。非常に慎重に作業し、常に適切な手袋を着用してください。 </li></ol>ハイスループット配列決定のための9。準備<ol><li> （NR）LAM-PCR産物の精製<ol><li>室温AMPure XP磁性ビーズ44μlのステップ8.1.2から40μlのPCR産物を混合します。室温で5分間インキュベートし、さらに2分間、MPSに公​​開。 </li><li>上澄み液を捨て、MPSに200μlの70％エタノールで二度洗い。 </li><li>上澄み液を捨て、30μlのH 2 O中のDNA-ビーズ複合体を再懸濁1分間インキュベートし、新鮮な0.2ミリリットルチューブに上清を移す。精製したDNAの濃度を測定する。 </li></ol></li><li> Fusionprimer PCRは、特定のアダプターの配列を決定する追加します。 <ol><li>分析される各サンプルを50μlのPCR反応物を調製するため。 </li><li> 0.2ミリリットルのPCRチューブにDNAをピペットXμL（40 NG）。 DNAの量は、各試料中および0.5〜25μLの範囲で同じにする必要があります。 </li><li>表5に記載したようにPCRマスターミックスを調製入れる。（50 - x）が、ステップ9.2.2からの各サンプルにマスターミックス液を、表5に例示したPCR条件によって（NR）LAM-PCR産物をシーケンシングアダプターを導入するPCR産物-20℃で最大4日間または長期間、4℃で保存することができる。 </li><li> Fusionprimer-PCR産物を可視化するためには、2％アガロースゲル上で、ステップ9.2.3からのPCR産物10μlのロード。 9.1.3 - 9.1.1の手順に記載されるように、残りのPCR産物を精製する。正確Fusionprimer-PCR産物の濃度およびフラグメントサイズを定量化するための自​​動化された高分解能電気泳動デバイス上の工程9.4から1μlの精製PCR産物を分析する。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

LAM-PCR法は、既知のDNA領域に隣接する未知のDNA配列を同定することができる。なぜなら公知のDNA配列にハイブリダイズする特異的プライマーを用いた接合の前増幅から得られる高感度のではなく、単一細胞レベルまでさえ稀接合を増幅して検出することができる。反して、ポリクローナル状況でLAM-PCRは、単一の反応において異なる数千の接合部を増幅することができる。 しかしながら、制限酵素の使用にin​​tegromeのみサブフラクションは、すべての特定の制限酵素を用いた接合部の存在についてLAM-PCRにより分析することができる。このように、異なる酵素と同一試料を繰り返し分析が9をお勧めします。まだLAM-PCRアンプリコンをゲル上に存在しない場合、最も可能性の高い公知のDNA断片の位置と選択された制限酵素の認識に最も近い部位との間の距離は、LAM-PCR産物を生じるには大きすぎる9。この場合、他の酵素は、ジャンクションを増幅するために使用されるべきである。 nrLAMは、制限酵素の...

PCR（LAM-PCR）媒介線形増幅は、任意の起源の既知のDNAに隣接する未知の隣接DNAを同定し、特徴づけることができます。具体的には、LAM-PCRは、宿主ゲノム内に1,2（IS）ウイルスベクター組込み部位を局在化するために開発された。レトロウイルスやトランスポゾンのような遺伝的要素が（半）ランダムに3-6で宿主ゲノムにそれらのゲノムを統合。多くの場合、これらのベクターは、集積正確に位置を知ることが決定的である。 LAM-PCRは、ライゲーション媒介PCR法7およびその変種またはインバースPCR 8のような代替技術よりも優れていることが証明されています。この方法の感度およびロバスト性は、ベクターゲノム接合の初期前置増幅、増幅されたPCR産物の磁気選択から生じる。上記の代替的な方法と同様に、LAM-PCR法は、IS 9月11日の検索能力に偏りを導入し、制限酵素の使用に依存している。このように、ISレパートリー（integrome）のサブセットのみが1の反応で検出することができる。このバイアスは、制限酵素9の最適な組み合わせを使用して所与の試料の平行分析することによって最小化される。近年、非制限LAM-PCR（nrLAM-PCR）と呼ばれる技術の変形は、制限酵素の使用を回避し、単一の反応9,12試料の公平なゲノムワイドな解析を可能にする開発されている。 過去には、LAM-PCRは、原因レトロウイルスは、臨床遺伝子治療試験13-15における少数の患者における白血病を引き起こすIS同定するために使用されている。それ以来、LAM-PCRを識別するように適合されている他の組込みベクター（レンチウイルスベクター、トランスポゾン）にも受動的にアデノ随伴ベクター（AAV）またはインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（IDLV）のようなベクトルを統合する統合パターンを識別するためにからのものである16 -21。 LAM-PCR法の応用を広げている。伝統的なLY、技術が広く遺伝子治療を受けた患者における遺伝子改変細胞のクローン組成を研究するために、またはそれらの積分15,16,22-24挙動を解明することにより、新規なベクター系の生物学的安全性を評価するために使用される。最近では、LAM-PCRはIDLV捕獲アッセイ25でデザイナーのヌクレアーゼの特異性とオフターゲット活性を測定することができました。 また、LAM-PCR法は簡単に生物中で時間をかけて導入細胞の運命を追跡することができます。このことは、癌原遺伝子、ならびに腫瘍抑制遺伝子を同定するために、また、造血又は癌幹細胞生物学26-28を研究することを可能にする。少なくとも最後のではなく、LAM-PCR法は、ヒト29（および未発表データ）におけるT細胞受容体の多様性を研究するようになった。 テクノロジーの本質的なパワーは、一塩基rで未知のフランキングDNAの何百万人を特徴づけることができ、深いシーケンシング技術にメソッドをリンクすることによって強化されている全ゲノム中esolution。以下のプロトコルでは、レンチウイルスベクターを特定するために例示的に知られていない隣接DNAの増幅および識別は、ステップバイステップを説明します。プロトコルで使用したオリゴヌクレオチドを表1に示す。抽出DNA又は任意の供給源のcDNAをLAM-PCRおよびnrLAM-PCRのためのDNA鋳型として使用することができる。

<table><tbody><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3001.5000</td><td>代替Taqポリメラーゼを使用することができます</td></tr><tr><td>PCRバッファー</td><td>Qiagen</td><td>201203</td><td>このバッファーの使用は、</td></tr><tr><td>dNTP混合物</td><td>Genaxxon Bioscience GmbH</td><td>M3015.4020</td><td>またはその他のdNTPs</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド(プライマー)</td><td>MWG Biotech</td><td></td><td>HPLC精製</td></tr><tr><td>Dynabeadsをお勧めしますM-280 ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-086</td><td>0.1% wt/vol BSA</td></tr><tr><td>6 M LiCl</td><td>Roth</td><td>3739.1</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>22637</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr>、<tr><td>EDTA</td>、<td>Applichem</td><td>、A1103,0250</td><td>、またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>、Klenow、ポリメラーゼ</td><td>、ロシュ、診断</td><td>10104523001</td><td></td></tr><tr><td>、ヘキサヌクレオチド混合物</td>、<td>ロシュ、11277081001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、制限、エンドヌクレアーゼ</td><td>、NEB</td><td></td><td>、またはその他のサプライヤー</td></tr>、<tr><td>Fast-Link DNAライゲーションキット</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>LK11025</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase ssDNA Ligase Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CL4111K</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11685660001</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>TBEバッファー</td><td>Amresco</td><td>0658</td><td>またはその他のサプライヤー</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Applichem</td><td>A2273,0005</td><td>Ethidium bromide is mutagenic</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td>or any other DNA ladder</td></tr><tr><td>20 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71393-1L</td><td>or any other supplier</td></tr><tr><td>Magna-Sep Magnetic Particle Separator&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>K158501</td><td>1.5mlチューブ用</td></tr><tr><td>マグナセップ磁性粒子セパレーター</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズK158696</td><td>96ウェルプレート</td></tr>用 <tr><td>Amicon Ultra-0.5、Ultracel-30 メンブレン</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>PerfectBlue Gelsystem Midi S</td><td>PeqLab</td><td>40-1515</td><td>、またはその他の電気泳動システム&nbsp;</td></tr><tr><td>TProfessional 96</td><td>Biometra</td><td>050-551</td><td>またはその他の 96ウェルプレート用サーモサイクラー</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー KS 260 ベーシック</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td>またはその他の水平シェーカー</td></tr><tr><td>PCR ソフトチューブ 0.2 ml</td><td>Biozym Scientific GmbH</td><td>711082</td><td>またはその他の 0.2 ml PCR チューブ</td></tr><tr><td>1.5 ml チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>12682</td><td>またはその他の 1.5 ml チューブ</td></tr><tr><td>ゲルドキュメンテーションシステム</td><td>PeqLab</td><td></td><td>またはその他のゲルドキュメンテーションシステム</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Spreadex EL1200 プレキャストゲル</td><td>Elchrom Scientific</td><td>3497</td><td></td></tr><tr><td>水中ゲル電気泳動装置 SEA 2000&nbsp;</td><td>Elchrom Scientific</td><td>2001E</td><td></td></tr><tr><td>2100電気泳動バイオアナライザーAgilent</td><td>Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr></tbody></table>

線形増幅媒介のpcr  - 不明隣接するdnaの遺伝的要素と特性の局在

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR)は、遺伝子治療によって治療された患者の遺伝子修正細胞の造血を研究するために開発されました。レトロウイルスベクターは安定して組み込まれているため、組み込み部位を使用して、個々の細胞とその子孫のクローン運命を研究することができます。LAM-PCRは、遺伝子治療で治療された患者における白血病が、隣接するがん原遺伝子の過剰発現を誘発するプロウイルスに由来するという証拠を初めて提供しました。インバースPCRやライゲーション媒介(LM)-PCRなどの既存の方法と比較して、LAM-PCRの高い感度と特異性は、ビオチン化ベクター特異的プライマーを使用した最初の増幅前ステップ(100サイクルの線形PCR)によって達成され、その後の反応ステップを固相(磁気ビーズ)上で実行できます。LAM-PCRは、既知のDNAの近くにある未知のDNAを同定するために現在利用可能な最も感度の高い方法です。最近、制限消化物を回避し、組み込み部位の賦活化バイアスを排除し、宿主ゲノム中のプロウイルス位置の包括的な解析を可能にするLAM-PCRの変異体が開発されました。次のプロトコルでは、統合されたレンチウイルスベクターに隣接する3'-および5'-配列の両方の増幅を段階的に説明しています。

LAM-PCRは、各接合のために定義された断片サイズを有するベクターゲノム接合部の増幅をもたらす。個々のPCR断片のサイズは、ゲノムDNA中の既知の位置と最も近い制限酵素認識部位の間の距離に依存する。これは、例えば 、ゲル電気泳動により分析試料中の増幅された接合部の多様性を可視化することができ、単一の（モノクローナル）、（オリゴクローナ）は、いくつか、又は複数の（ポリクローナル）のバンドがゲル上に存在する場合。 LAM-PCRの結果は、最高の高分解能電気泳動ゲル（ 図2A）によって観察されず、2％アガロースゲル（ 図2B）上で可視化することができる。 nrLAM-PCRは、個々の接合のための様々な長さのPCR断片を生じる。このように、モノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナルサンプルは電気泳動によりスメアとして表示され、視覚的に区別することができない。 2％アガロースゲル上nrLAM-PCR産物を視覚化すること成功を決定するのに十分であるプロトコル（ 図2C）のCESS。回収されたゲノムDNAを配列決定した...

（LAM）-PCR媒介線形増幅は、ゲノムにウイルスベクターを統合の正確な位置を特定するために開発された方法である。技術などの遺伝子治療患者におけるクローン性のダイナミクスを研究するための優れた方法、新規ベクター技術のバイオセーフティ、T細胞の多様性、癌幹細胞モデルであるように進化している

線形増幅媒介のPCR  - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

本実験の全体的な目的は、ゲノム内における組み込みウイルスベクターの正確な位置を特定することである。これは、まずビオチン標識プライマーを用いた線状PCR反応を行い、一連の反応を通じて固相上でゲノムDNAからベクターゲノム接合配列を濃縮することで達成される。これにより、産物の両端に既知のDNA配列を持つ二本鎖DNAが生成され、ベクターゲノム接合部の指数関数的な増幅が可能となる。次に、λ-PCR産物にシーケンシングアダプターを組み込む。未知の隣接DNAをディープシーケンシングで配列決定し特性解析することで、これらの断片からベクター組み込みの正確な位置を明らかにできます。その結果、ゲル電気泳動で確認できるように、増幅されたジャンクションの多様性が示されます。この手法は、臨床遺伝子治療を受けた患者におけるウイルスベクター組み込み部位の分布に関する知見を提供します。また、この手法は、挿入変異誘発、スクリーニング、ウイルス感染、癌、幹細胞のクローナリティ、あるいはT細胞の多様性などの他の研究にも適用可能です。本手順は、私の研究室の技術者であるRAによって実演されます。まず、リンカーカセットを準備します。マイクロ遠心チューブ内で、2種類のLCO Legoを各40 µL、tris hydrochloride 110 µL、およびmagnesium chloride 10 µLを混合します。次に、この混合液を95 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、その後、一晩かけて室温まで徐々に冷却します。翌日、調製した二本鎖リンカーDNAに300 µLの水（water）を加え、マイクロ遠心チューブを用いてフィルターろ過します。フィルターを遠心分離し、チューブ底部に濃縮されたリンカーDNAを回収します。次に、フィルターから回収液を回収します。80 µLの水を加え、ピペッティングします。PCRチューブに10 µLずつ分注します。50 µL反応チューブを用いて、lambのベクターゲノム接合部をPCRでプレアンプリファイします。50 µLの反応液あたり、1 ngから1 µgのサンプルDNAを添加します。NR lambの場合は、少なくとも100 ngのDNAを使用してください。25 µLを超えて添加せず、本文中の表2に従ってPCRを実行してください。完了後、各反応液にさらに0.5 µLのtechを添加し、PCRプログラムを2回目に回します。まず、磁性ビーズを準備します。1.5 mLチューブにstrept ENCコーティング磁性ビーズを20 µL加え、室温で1分間磁性ビーズセパレーターに静置します。その後、上清を除去します。BSAを含むPBS 40 µLでビーズを懸濁させ、再度セパレーターに置いて1分間放置します。上清を、3 M 塩化リチウム溶液 20 µLの洗浄液に置き換えます。再度、ビーズをセパレーターに1分間置きます。最後に、上清を50 µLの6 M塩化リチウム溶液に置換して完了します。次に、磁気ビーズミックスをPCR反応産物に加え、この混合物を室温で緩やかに振盪しながら2時間から一晩インキュベートします。ビオチン化DNA、ストリップtava、およびコート済みビーズは複合体を形成し、4°Cで最大4日間保存可能です。高い感度を持つため、lambまたはNR lambを用いて進めてください。L-A-M-P-C-Rは、注意深く実施されない場合、汚染が起こりやすいため注意が必要です。これはPCRグレードの環境です。極めて高い清浄度に細心の注意を払う必要があります。サンプルを汚染することなく未知の隣接DNAを正常に増幅させるために、まず複合体をセパレーターに1分間曝露させ、次にDNAビーズを100 µLの水で再懸濁させます。次に, コンプレックスをセパレーターに1分間さらします。そして今回は, 8.25 µLの水, 1 µLのHEXAヌクレオチド緩衝液, 0.25 µLのD DN NTPs, および0.5 µLのcanoポリメラーゼを混合した液にDNAビーズコンプレックスを再懸濁します。この混合物を37 °Cで1時間インキュベートします。次に、90 µLの水を加え、反応液をセパレーターにさらに1分間かけます。その後、DNAビーズ複合体を100 µLの洗浄用水で再懸濁します。さらに1分間遠心分離を行い、制限酵素反応の準備をします。上清を除去した後、8.5 µLの水、1 µLの制限酵素バッファー、および0.5 µLの制限酵素を添加します。制限酵素を選択する際は、プリ増幅反応で使用したプライマル結合部位内またはその下流に切断部位が存在しないことを確認してください。最適温度で1時間反応させた後、90 µLの水を加えます。分離器を用いて1分間処理し、100 µLの洗浄水中でBDNA複合体を再懸濁させます。分離を繰り返し、ライゲーション反応の準備を行います。ビーズに5 µLの水、1 µLの10 x fast link buffer、1 µLのTP、1 µLのfast link DNA ligase、および手順の最初で作成した1 µLのリンカーカセットを加えます。この反応を室温で5分間進行させます。90 µLの水を加えて反応を停止させ、ビーズを分離した後、100 µLの水で洗浄します。さらに再度分離を行い、合成されたDNAを変性させるため、ビーズを5 µLの0.1 N 水酸化ナトリウムに再懸濁させ、室温で5分間シェーキングします。次に、コンプレックスを1分間分離させ、一次増幅されたベクターゲノムジャンクションを含む上清を回収します。直ちに指数関数的増幅に進むか、-20 °Cで保存してください。まず、コンプレックスをセパレーターに1分間さらすことから始めてください。100 µLの水でDNAビーズを再懸濁させます。再び分離し、上清を除去します。ライゲーション反応のために、6.5 µLの水、1 µLのcirc Ligase、10x反応バッファーを加えます。塩化マグネシウム 0.5 µL、TP 0.5 µL、SSリンカーオリゴ 1 µL、および cir ligase 0.5 µLを添加します。60 °Cで1時間後、90 µLの水で反応を停止させ、ビーズセパレーターを用いてResusを行います。さらに100 µLの水でビーズを懸濁させ、再度セパレーターを用いて洗浄し、洗浄複合体を10 µLの水で回収します。まず、本文の表3に記載されているPCRマスターミックスを調製します。200 µL PCRチューブに、マスターミックス48 µLとlambまたはNR lamb産物2 µLを加え、本文の記載に従ってPCRを行う。あらかじめstreptビーズを多めに調製し、6 M 塩化リチウムに再懸濁しておく。lambには20 µL、NR lambには50 µLを使用する。次に、PCR反応産物と同量のビーズを加え、室温で300 RPMのシェーカーを用いて2時間から一晩インキュベートする。DNAビーズ複合体を回収し、既報の通り100 µLの水で洗浄する。次に、複合体を0.1 N 水酸化ナトリウムに懸濁し、シェーカーを用いて室温で10分間ビーズをインキュベートします。その後、ビーズをセパレーターに1分間セットし、増幅されたDNAを含む上清を新しいチューブに回収します。この増幅DNAをテンプレートとして、そのうち2 µLを用いて、本文の表4に記載されている手順でPCRを行います。ゲル電気泳動で産物を可視化し、産物を精製します。産物40 µLを室温のAMpure XP磁気ビーズ44 µLと混合し、5分間インキュベートします。その後、マグネットを用いてビーズを2分間分離します。上清を除去した後、200 µLの70% ethanolを用いてビーズを2回洗浄し、次いで40 ngのDNAA fusion primerと30 µLの水を加えてビーズを再懸濁します。シーケンシング専用のアダプターを付加するためにPCRを用いることができます。詳細は表5に記載されています。ゲルで産物を確認します。ラムPCRの結果を高解像度ゲル電気泳動で視認することは、比較による診断分析として最適な選択肢です。2%のアガロースでも機能しますが、十分な性能は得られません。NR LAMBのクローナリティについて、PCR産物を視覚的に診断することは不可能です。しかし、プロトコルの成否を判定するには2%アガロースゲルで十分です。PCR産物をシーケンシングすることで、宿主ゲノムにおけるベクターの位置を特定できます。これらのデータから、開発後、コーディング領域内および転写開始点近傍における挿入部位の場所を記録することが可能になります。この技術は、遺伝子治療分野の研究者が、前臨床モデルおよび臨床遺伝子治療試験の両方において、遺伝子導入ベクターのバイオセーフティを探索するための道を切り拓きました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶLAM-PCR法でウイルスベクター挿入部位を正確に同定し、遺伝子治療のクローン動態とバイオセーフティを評価する。ゲノム解析と深層シーケンスを活用した革新的アプローチです。

線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

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