線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

次の実験の全体的な目標は、ゲノムにウイルスベクターを組み込む正確な位置を特定することです。これは、ビオチン化プライマーを用いた最初の線形PCR反応により、固相上のゲノムDNAからベクターゲノムジャンクション配列を濃縮することで達成され、一連の反応では、製品の両端に既知のDNA配列を持つ二本鎖DNAが生成され、ベクターゲノムジャンクションの指数関数的な増幅が可能になります。次に、シーケンシングアダプターをラムPCR製品に組み込みます。

未知の隣接DNAをディープシーケンシングでシーケンシングし、特性評価するために、これらのフラグメントはベクター統合の正確な位置を明らかにします。その結果、ゲル電気泳動で見た増幅された接合部の多様性が得られます。この手法により、臨床遺伝子治療患者におけるウイルスベクター統合部位の分布に関する知見が得られます。

また、挿入、突然変異誘発、スクリーニング、ウイルス感染、がん、幹細胞のクローン性、T細胞の多様性など、他の研究にも適用できます。この手順では、私の研究室の技術者であるina RAによってデモンストレーションされますこの手順では、最初にリンカーカセットを準備し、2つのLCOレゴのそれぞれ40マイクロリットルを110マイクロリットルの塩酸トリスと10マイクロリットルの塩化マグネシウムをマイクロ遠心チューブに混合します。次に、混合物を摂氏95度のヒートブロックで5分間インキュベートするように設定し、その後、一晩で室温までゆっくりと冷却します。

翌日、調製した二本鎖リンカーDNAに300マイクロリットルの水を加え、マイクロ遠心チューブでろ過します。フィルターをスピンダウンして、濃縮されたリンカーDNAを尿に集めます。次に、フィルターから ouit を回復します。

80マイクロリットルの水を尿とピペットに加え、10マイクロリットルのアリコートをPCRチューブに加えます。PCRを使用して、子羊の50マイクロリットル反応チューブでベクターゲノムジャンクションを事前に増幅します。

50マイクロリットルの反応ごとに1ナノグラムから1マイクログラムのサンプルDNAを添加します。NRラムの場合、少なくとも100ナノグラムのDNAを使用してください。本文中の表2に従ってPCRを実行する25マイクロリットル以上を追加しないでください。

そして、完了したら、各反応にさらに0.5マイクロリットルの技術を追加し、PCRプログラムを2回目に実行します。まず、磁気ビーズを準備します。1.5ミリリットルのチューブに20マイクロリットルのSTEPT ENCコーティング磁気ビーズを加え、室温で1分間磁気ビーズセパレーターに置きます。

次に、上澄みを捨てます。ビーズをBSAで40マイクロリットルのPBSに懸濁し、ビーズをさらにセパレーターに戻します。上清を20マイクロリットルの3モル塩化リチウム溶液の洗浄液と交換します。.

そして再び、ビーズをセパレーターに1分間置きます。上清を50マイクロリットルの6モル塩化リチウム溶液に交換して仕上げます。次に、PCR反応の生成物に磁気ビーズミックスを加え、この混合物を室温で2時間から一晩、穏やかに振とうしながらインキュベー

ビオチン化されたDNAとストリップタバ、およびコーティングされたビーズは、摂氏4度で最大4日間保存できる複合体を形成します。ラムまたはNRラムに進みます 感度が高いため。L-A-M-P-C-Rは、注意深く実行すると汚染されやすいです。

これがPCRグレードの環境です。そして、最も重要な清潔さに特別な注意を払います。サンプルを汚染することなく未知の隣接DNAをうまく増幅するには、まず複合体をセパレーターに1分間さらし、DNAビーズを100マイクロリットルの水に懸濁します。

次に、複合体をセパレーターに1分間さらします。そして今度は、DNAビーズ複合体を8.25マイクロリットルの水との混合物に再懸濁します。1マイクロリットルのHEXAヌクレオチドバッファー、4分の1マイクロリットルのD DN NTP、および半マイクロリットルのカノポリメラーゼ。

この混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、90マイクロリットルの水を加え、反応をセパレーターにさらに1分間さらします。次に、DNAビーズ複合体を100マイクロリットルの水洗浄液に再懸濁します。

セパレーターをさらに1分間使用し、制限酵素反応を準備します。上清を取り除いた後。8.5マイクロリットルの水、1マイクロリットルの制限酵素バッファー、および半マイクロリットルの制限酵素を追加します。

制限酵素を選定する際は、プレエム増幅反応で使用されるプライマル結合部位の内部または下流に部位がないことを確認してください。酵素を理想的な温度で1時間反応させた後、90マイクロリットルの水を加えます。セパレーターを1分間使用し、BDNA複合体を100マイクロリットルの水の洗浄液に再懸濁します。

分離を繰り返し、ライゲーション反応を準備します。ビーズに5マイクロリットルの水、10 x高速リンクバッファの1マイクロリットルを追加します。TPの1マイクロリットル、高速リンクDNAリガーゼの1マイクロリットル、および手順の開始時に作成されたリンカーカセットのマイクロリットル。

この反応を室温で5分間実行させます。90マイクロリットルの水を加えてビーズを分離し、続いて100マイクロリットルの水で洗浄して反応を終了します。次に、合成されたDNAを変性させるための別の分離により、ビーズを5マイクロリットルの0.1正常水酸化ナトリウムに再懸濁し、混合物を室温で5分間振とうします。

次に、複合体を1分間分離し、preem増幅されたベクターゲノム接合を含むSUPナチンを収集します。すぐに指数関数的な増幅を進めるか、摂氏マイナス20度で保存します。複合体をセパレーターに1分間さらすことから始めます。

そして、DNAビーズを100マイクロリットルの水に懸濁させます。そして、それらを再び分離し、上清を取り除きます。ライゲーション反応には、6.5マイクロリットルの水、1マイクロリットルのcirc Ligase、10 x反応バッファーを追加します。

塩化マグネシウムの半分マイクロリットル、TPの半分マイクロリットル、SSリンカーオリゴの1マイクロリットル、およびcirリガーゼの半分マイクロリットル。摂氏60度で1時間後、ビーズセパレーターResusを使用して90マイクロリットルの水で反応を終了し、ビーズをさらに100マイクロリットルの100マイクロリットルに懸濁し、再びセパレーターを使用して洗浄複合体を10マイクロリットルの水に集めます。まず、テキストの表3に記載されているPCRマスターミックスを調製します。

200マイクロリットルのPCRチューブに2マイクロリットルのラムまたはNRラム製品に48マイクロリットルのマスターミックスを加え、前と同様にテキストに記載されているようにPCRを実行し、ビーズでさらにストラットを準備し、6モルの塩化リチウムに再懸濁します。ラムには20マイクロリットル、NRラムには50マイクロリットルを使用してください。次に、同量のPCR反応産物にビーズを添加し、300 RPMのシェーカーで室温で2時間から一晩インキュベートし、DNAビーズ複合体を回収して、前に示したように100マイクロリットルの水で洗浄します。

次に、複合体を0.1の水酸化ナトリウムに懸濁し、ビーズを室温で10分間シェーカーでインキュベートします。次に、ビーズをセパレーターに1分間さらし、増幅されたDNAを含む上清を新しいチューブに集めます。増幅したDNAをテンプレートとして、テキストの表4に示すように、2マイクロリットルのDNAを使用してPCRを実行します。

ゲル電気泳動により製品を可視化し、製品を精製します。そのうちの40マイクロリットルを44マイクロリットルの室温の純粋なXP磁気ビーズと混合し、5分間インキュベートします。次に、磁石でビーズを2分間分離します。

上清を取り除いた後、200マイクロリットルの70%エタノールを使用してビーズを2回洗浄し、次にビーズと30マイクロリットルの水を再懸濁します40ナノグラムのDNAA融合プライマーを使用して。PCRは、シーケンシング特異的アダプターを追加するために使用できます。詳細は表5に示します。

ジェルで製品を確認します。ラム肉PCRの結果を高分解能ゲル電気泳動で見ることは、比較して診断分析するための最良の選択です。2%arosも機能しますが、うまく機能しません。

NR LAMBのクローン性、PCR製品は視覚的に診断できません。ただし、2%アグロスゲルは、プロトコールの成功を判断するのに十分です。PCR産物のシーケンシング後、ベクターの位置は宿主ゲノムに見つけることができます。

このデータから、コーディング領域における挿入部位の位置を記録し、その開発後に転写開始部位に近い位置を記録することができる。この技術は、遺伝子治療の分野の研究者が、前臨床モデルと臨床遺伝子治療試験の両方で遺伝子導入ベクターのバイオセーフティを探求する道を開きました。