線形増幅媒介のPCR - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

本実験の全体的な目的は、ゲノム内における組み込みウイルスベクターの正確な位置を特定することである。これは、まずビオチン標識プライマーを用いた線状PCR反応を行い、一連の反応を通じて固相上でゲノムDNAからベクターゲノム接合配列を濃縮することで達成される。これにより、産物の両端に既知のDNA配列を持つ二本鎖DNAが生成され、ベクターゲノム接合部の指数関数的な増幅が可能となる。次に、λ-PCR産物にシーケンシングアダプターを組み込む。

未知の隣接DNAをディープシーケンシングで配列決定し特性解析することで、これらの断片からベクター組み込みの正確な位置を明らかにできます。その結果、ゲル電気泳動で確認できるように、増幅されたジャンクションの多様性が示されます。この手法は、臨床遺伝子治療を受けた患者におけるウイルスベクター組み込み部位の分布に関する知見を提供します。

また、この手法は、挿入変異誘発、スクリーニング、ウイルス感染、癌、幹細胞のクローナリティ、あるいはT細胞の多様性などの他の研究にも適用可能です。本手順は、私の研究室の技術者であるRAによって実演されます。まず、リンカーカセットを準備します。マイクロ遠心チューブ内で、2種類のLCO Legoを各40 µL、tris hydrochloride 110 µL、およびmagnesium chloride 10 µLを混合します。次に、この混合液を95 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートし、その後、一晩かけて室温まで徐々に冷却します。

翌日、調製した二本鎖リンカーDNAに300 µLの水（water）を加え、マイクロ遠心チューブを用いてフィルターろ過します。フィルターを遠心分離し、チューブ底部に濃縮されたリンカーDNAを回収します。次に、フィルターから回収液を回収します。

80 µLの水を加え、ピペッティングします。PCRチューブに10 µLずつ分注します。50 µL反応チューブを用いて、lambのベクターゲノム接合部をPCRでプレアンプリファイします。

50 µLの反応液あたり、1 ngから1 µgのサンプルDNAを添加します。NR lambの場合は、少なくとも100 ngのDNAを使用してください。25 µLを超えて添加せず、本文中の表2に従ってPCRを実行してください。

完了後、各反応液にさらに0.5 µLのtechを添加し、PCRプログラムを2回目に回します。まず、磁性ビーズを準備します。1.5 mLチューブにstrept ENCコーティング磁性ビーズを20 µL加え、室温で1分間磁性ビーズセパレーターに静置します。

その後、上清を除去します。BSAを含むPBS 40 µLでビーズを懸濁させ、再度セパレーターに置いて1分間放置します。上清を、3 M 塩化リチウム溶液 20 µLの洗浄液に置き換えます。

再度、ビーズをセパレーターに1分間置きます。最後に、上清を50 µLの6 M塩化リチウム溶液に置換して完了します。次に、磁気ビーズミックスをPCR反応産物に加え、この混合物を室温で緩やかに振盪しながら2時間から一晩インキュベートします。

ビオチン化DNA、ストリップtava、およびコート済みビーズは複合体を形成し、4°Cで最大4日間保存可能です。高い感度を持つため、lambまたはNR lambを用いて進めてください。L-A-M-P-C-Rは、注意深く実施されない場合、汚染が起こりやすいため注意が必要です。

これはPCRグレードの環境です。極めて高い清浄度に細心の注意を払う必要があります。サンプルを汚染することなく未知の隣接DNAを正常に増幅させるために、まず複合体をセパレーターに1分間曝露させ、次にDNAビーズを100 µLの水で再懸濁させます。

次に, コンプレックスをセパレーターに1分間さらします。そして今回は, 8.25 µLの水, 1 µLのHEXAヌクレオチド緩衝液, 0.25 µLのD DN NTPs, および0.5 µLのcanoポリメラーゼを混合した液にDNAビーズコンプレックスを再懸濁します。

この混合物を37 °Cで1時間インキュベートします。次に、90 µLの水を加え、反応液をセパレーターにさらに1分間かけます。その後、DNAビーズ複合体を100 µLの洗浄用水で再懸濁します。

さらに1分間遠心分離を行い、制限酵素反応の準備をします。上清を除去した後、8.5 µLの水、1 µLの制限酵素バッファー、および0.5 µLの制限酵素を添加します。

制限酵素を選択する際は、プリ増幅反応で使用したプライマル結合部位内またはその下流に切断部位が存在しないことを確認してください。最適温度で1時間反応させた後、90 µLの水を加えます。分離器を用いて1分間処理し、100 µLの洗浄水中でBDNA複合体を再懸濁させます。

分離を繰り返し、ライゲーション反応の準備を行います。ビーズに5 µLの水、1 µLの10 x fast link buffer、1 µLのTP、1 µLのfast link DNA ligase、および手順の最初で作成した1 µLのリンカーカセットを加えます。

この反応を室温で5分間進行させます。90 µLの水を加えて反応を停止させ、ビーズを分離した後、100 µLの水で洗浄します。さらに再度分離を行い、合成されたDNAを変性させるため、ビーズを5 µLの0.1 N 水酸化ナトリウムに再懸濁させ、室温で5分間シェーキングします。

次に、コンプレックスを1分間分離させ、一次増幅されたベクターゲノムジャンクションを含む上清を回収します。直ちに指数関数的増幅に進むか、-20 °Cで保存してください。まず、コンプレックスをセパレーターに1分間さらすことから始めてください。

100 µLの水でDNAビーズを再懸濁させます。再び分離し、上清を除去します。ライゲーション反応のために、6.5 µLの水、1 µLのcirc Ligase、10x反応バッファーを加えます。

塩化マグネシウム 0.5 µL、TP 0.5 µL、SSリンカーオリゴ 1 µL、および cir ligase 0.5 µLを添加します。60 °Cで1時間後、90 µLの水で反応を停止させ、ビーズセパレーターを用いてResusを行います。さらに100 µLの水でビーズを懸濁させ、再度セパレーターを用いて洗浄し、洗浄複合体を10 µLの水で回収します。まず、本文の表3に記載されているPCRマスターミックスを調製します。

200 µL PCRチューブに、マスターミックス48 µLとlambまたはNR lamb産物2 µLを加え、本文の記載に従ってPCRを行う。あらかじめstreptビーズを多めに調製し、6 M 塩化リチウムに再懸濁しておく。lambには20 µL、NR lambには50 µLを使用する。次に、PCR反応産物と同量のビーズを加え、室温で300 RPMのシェーカーを用いて2時間から一晩インキュベートする。DNAビーズ複合体を回収し、既報の通り100 µLの水で洗浄する。

次に、複合体を0.1 N 水酸化ナトリウムに懸濁し、シェーカーを用いて室温で10分間ビーズをインキュベートします。その後、ビーズをセパレーターに1分間セットし、増幅されたDNAを含む上清を新しいチューブに回収します。この増幅DNAをテンプレートとして、そのうち2 µLを用いて、本文の表4に記載されている手順でPCRを行います。

ゲル電気泳動で産物を可視化し、産物を精製します。産物40 µLを室温のAMpure XP磁気ビーズ44 µLと混合し、5分間インキュベートします。その後、マグネットを用いてビーズを2分間分離します。

上清を除去した後、200 µLの70% ethanolを用いてビーズを2回洗浄し、次いで40 ngのDNAA fusion primerと30 µLの水を加えてビーズを再懸濁します。シーケンシング専用のアダプターを付加するためにPCRを用いることができます。詳細は表5に記載されています。

ゲルで産物を確認します。ラムPCRの結果を高解像度ゲル電気泳動で視認することは、比較による診断分析として最適な選択肢です。2%のアガロースでも機能しますが、十分な性能は得られません。

NR LAMBのクローナリティについて、PCR産物を視覚的に診断することは不可能です。しかし、プロトコルの成否を判定するには2%アガロースゲルで十分です。PCR産物をシーケンシングすることで、宿主ゲノムにおけるベクターの位置を特定できます。

これらのデータから、開発後、コーディング領域内および転写開始点近傍における挿入部位の場所を記録することが可能になります。この技術は、遺伝子治療分野の研究者が、前臨床モデルおよび臨床遺伝子治療試験の両方において、遺伝子導入ベクターのバイオセーフティを探索するための道を切り拓きました。