マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離
April 14th, 2016
ここでは、実験用マウスから後肢の長骨(大腿骨と脛骨)を解剖するためのプロトコルを提示します。さらに、骨髄空間から骨髄を除去するために遠心分離を利用する、これらの骨からの骨髄分離のための迅速な技術について説明します。
この長骨解剖および骨髄分離手順の全体的な目標は、長骨を迅速かつ体系的に除去し、骨髄を採取してさらに下流の分析を行うことです。この方法は、骨髄生物学、がん転移、免疫学に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、解剖プロセスが迅速かつ標準化されていること、骨髄分離手順がかなり無菌であること、マウスを仰臥位に配置することから始めることです。
次に、足首関節の下に4つの足パッドをすべて固定し、マウスに70%エタノールをスプレーし、脚を完全に浸します。次に、股関節のすぐ上の下腹部の正中線の右側に小さな切開を行い、切開部を脚の下まで延長して足首の関節を過ぎます。皮膚を引き戻します。
次に、大腿骨の近位端に固定されている大腿四頭筋を切断して大腿骨の前面を露出させ、ボードから45度の角度でピンで脚から筋肉をピンで固定します。はさみを大腿骨の後側に当てて、ハムストリングスを膝関節から切り取ります。次に、大腿骨の近位端に固定されている皮膚とハムストリングの筋肉を引き戻して骨の後側を露出させ、ハムストリングの筋肉を脚からピンで固定し、ピンを45度の角度で配置します。
鉗子で、膝関節のすぐ上の大腿骨の遠位端をつかみます。次に、大腿骨シャフトの両側にあるシザーブレードを股関節に導きます。大腿骨頭に到達した後、はさみをひねり、トップブレードを大腿骨頭の真上に動かして大腿骨を脱臼させます。
次に、鉗子で大腿骨シャフトの上部をつかみ、軟組織を大腿骨頭から切り離して、大腿骨を寛骨臼から解放します。次に、大腿骨、膝、脛骨を含む脚の骨全体を上に引っ張って体から離し、脚を皮膚に付着させている結合組織と筋肉を慎重に切り取ります。結合組織をすべて取り除いたら、足首の関節を過度に伸ばし、ささみをひねって脛骨を脱臼させます。
脛骨の遠位端をつかみ、腱を切断しないように注意しながら、脛骨を引き上げ、体とピンボードから離します。次に、膝の長骨に付着している残りの結合組織と、大腿骨と脛骨に付着している追加の筋肉または結合組織をすべて取り除きます。骨髄分離のために長骨を準備するには、膝蓋骨を反対側に向け、大腿骨頭を下に向けて大腿骨をつかみます。
膝関節を過度に伸ばし、はさみをひねって脛骨を大腿骨から脱臼させます。次に、大腿骨と脛骨を一緒に保持している結合組織をすべて取り除きます。次に、大腿骨の前面を背にして大腿骨頭を下に向けて掴み、ハサミで大腿骨軸を顆まで誘導します。
はさみを前後にゆっくりと回転させて、顆、膝蓋骨、骨端を取り除き、骨端を露出させます。次に、鉗子、はさみ、キムワイプを使用して、大腿骨に付着している追加の筋肉または結合組織を取り除きます。次に、脛骨の前面を反対側に向け、足首の端を下に向けてつかみます。
脛骨骨端が損傷していない場合は、ハサミを脛骨シャフトから顆に導き、ハサミを前後にゆっくりと回転させて顆と骨端を取り除き、脛骨骨幹端を露出させます。次に、先ほど示したように、脛骨に付着している追加の筋肉または結合組織をすべて取り除きます。骨髄を採取するには、まず18ゲージの針を0.5ミリリットルの微量遠心チューブの底に押し込みます。
次に、長骨をチューブに入れ、膝の端を下にして蓋を閉めます。0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れ子にし、チューブを10,000倍以上のgでマイクロ遠心分離機で15秒間遠心分離します。骨髄が骨からスピンアウトしたことを目視検査で確認します。
骨は白く見え、大きなチューブに大きなペレットが見えるはずです。次に、0.5ミリリットルの微量遠心チューブに骨を捨て、骨髄を適切な溶液に懸濁して、目的の下流分析を行います。この迅速な解剖技術は、組織形態測定法や組織学など、多くのダウンストリーム分析に適しています。
実際、この代表的な組織形態組織測定マイクロCT 3D再構成で実証されたように、海綿骨と皮質殻の両方が維持されるため、骨組織形態測定の標準化された構造パラメータを正確に定量化できます。HおよびE染色された形式的および固定および脱灰した脛骨のこの代表的な組織学的切片では、組織学的分析のための石灰化した骨と細胞骨髄の両方の完全性の維持を観察することができます。さらに、この手順によって単離された骨髄は、破骨細胞または骨芽細胞の初代細胞培養を含む多くの下流アプリケーションに適しています。
一度習得すれば、長骨の解剖から骨髄の分離まで、適切に行えば、約7分で技術を完了することができます。手順を試みている間は、解剖を容易にするためにマウスの位置を忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、FACSや他のシングルセルプロセスなどの他の方法を実行して、骨髄細胞集団の変化に関する追加の質問に答えることができます。
このビデオを見た後、マウスの長骨をすばやく解剖する方法と、遠心分離によって骨髄を分離する方法をよく理解しているはずです。
概要
この記事では、実験用マウスの後肢長骨の解剖と、遠心分離法を用いた骨髄分離の迅速な技術について説明しています。この方法は、骨髄の生物学と免疫学に関連する下流の分析を容易にすることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 骨髄の生物学
- がん転移
- 免疫学
背景
- 長骨の解剖は、骨関連の疾患を研究する上で重要です。
- 骨髄の分離は、様々な細胞分析に不可欠です。
- 標準化された技術は研究における再現性を向上させます。
- 迅速な手順は実験ワークフローの時間を節約します。
研究の目的
- 長骨解剖のための体系的なアプローチを提供すること。
- 分析のための効率的な骨髄収集を可能にすること。
- 下流のアプリケーションのために骨と骨髄の完全性を維持すること。
使用された方法
- マウスの位置決めと解剖の準備。
- 大腿骨と脛骨の段階的な解剖。
- 遠心分離による骨髄の分離。
- 髄液抽出の視覚的確認。
主な結果
- この技術は約7分で完了できます。
- 骨髄の完全性が組織学的分析のために保たれます。
- 細胞培養を含む様々な下流のアプリケーションに適しています。
- 標準化されたパラメータにより、研究における正確な定量化が可能になります。
結論
- この迅速な解剖と分離技術は効果的で効率的です。
- 骨髄細胞集団に関するさらなる研究をサポートします。
- 技術の習得は関連分野における研究能力を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of murine bone marrow enables high-throughput screening of hematopoietic and stromal cell populations, supporting target validation in oncology and immunology. Standardized dissection reduces variability in preclinical models, improving data reliability for go/no-go decisions. Rapid processing facilitates integration into discovery workflows where sample throughput impacts lead identification timelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of bone marrow niche mechanisms in cancer metastasis and immune cell regulation.
- Operational Value: Provides reproducible access to primary bone marrow cells for functional target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Isolated marrow supports assay development for osteoclast/osteoblast differentiation and drug response profiling.
- Operational Value: Centrifugation-based method allows scalable processing of large cohorts for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Preserved marrow integrity enables phenotypic screening of stromal and hematopoietic compartments in disease models.
- Operational Value: Standardized protocol supports cross-lab reproducibility in multicenter preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing by providing a reliable source of primary bone marrow cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in bone-immune crosstalk and metastatic niche formation.
- Screening: Enables preparation of standardized cell inputs for drug sensitivity and cytotoxicity assays.
- Analytics: Yields quantifiable outputs for flow cytometry, cytokine profiling, and genetic analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical validation through consistent cell sourcing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for bone marrow-derived assays across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in bone marrow-dependent disease models.
- Operational Value: Standardization minimizes user variability and processing time.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid sample turnaround.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement through reliable preclinical data generation.
Implementation Considerations
- Requires training in murine anatomy and aseptic dissection technique.
- Needs access to microcentrifuge capable of ≥10,000 × g and sterile tubes.
- Demands standardization across users to ensure marrow yield and viability consistency.
- Adaptation considerations include adjusting bone size for different mouse strains or ages.
- Practical limitation: Protocol is optimized for murine long bones; not directly applicable to larger species without modification.
