マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

この長骨解剖および骨髄分離手順の全体的な目的は、長骨を迅速かつ体系的に取り除き、その後の詳細な解析のために骨髄を回収することです。この手法は、骨髄生物学、癌転移、および免疫学に関連する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、解剖プロセスが迅速かつ標準化されており、骨髄分離手順がかなり無菌的に行えることです。まず、マウスを仰臥位に配置することから始めてください。

次に、4つの足底パッドをすべて足関節より下の位置で固定し、マウスに70% ethanolをスプレーして、脚全体を十分に濡らします。続いて、下腹部の股関節直上の正中線右側に小さな切開を加え、その切開線を脚に沿って足関節を越えるまで延長します。その後、皮膚を剥ぎ取ります。

次に、大腿骨近位端に付着している大腿四頭筋を切断して大腿骨の前面を露出させ、ピンをボードから45度の角度に刺して、筋肉を脚から外側に固定します。ハサミを大腿骨の背面にあて、膝関節からハムストリングを切除します。その後、大腿骨近位端に付着している皮膚とハムストリングを後方に引き、骨の背面を露出させ、ピンを45度の角度に刺してハムストリングを脚から外側に固定します。

ピンセットを用いて、膝関節の直上の大腿骨遠位端を把持します。次に、大腿骨幹の両側にハサミの刃を添えて、股関節に向かって進めます。大腿骨頭に達したら、ハサミをひねり、上の刃を大腿骨頭の真上に移動させて大腿骨を脱臼させます。

次に、鉗子で大腿骨幹部の上端を掴み、大腿骨頭から軟部組織を切り離して、大腿骨を寛骨臼から解放します。その後、大腿骨、膝、脛骨を含む脚の骨全体を体から上方へ引き離し、脚を皮膚に付着させている結合組織と筋肉を慎重に切り離します。すべての結合組織が除去されたら、足関節を過伸展させ、今デモンストレーションしたようにハサミをひねって脛骨を脱臼させます。

脛骨の遠位端を把握し、腱を切断しないように注意しながら、脛骨を体およびピンボードから引き離して上に持ち上げます。次に、膝関節部の長骨に付着している残りの結合組織、および大腿骨と脛骨に付着している追加の筋肉や結合組織を除去します。骨髄分離に向けて長骨を準備するため、膝蓋骨を外側に向け、大腿骨頭を下に向けた状態で大腿骨を把握します。

膝関節を過伸展させ、ハサミをひねって脛骨を大腿骨から脱臼させます。次に、大腿骨と脛骨を繋いでいる結合組織を除去します。続いて、大腿骨の前側を外に向け、大腿骨頭を下に向けた状態で大腿骨を把握し、ハサミを大腿骨幹に沿って顆粒まで移動させます。

ハサミをゆっくりと前後に動かして、顆 {condyles}、膝蓋骨 {patella}、および骨端 {epiphysis} を除去し、骨幹端 {metaphysis} を露出させます。次に、鉗子、ハサミ、およびキムワイプを使用して、大腿骨に付着している不要な筋肉や結合組織を取り除きます。続いて、脛骨の前側を外側に向け、足首側を下にして把持します。

脛骨骨端が完全な状態である場合は、ハサミを脛骨幹から顆部に向かって導き、ハサミを前後にゆっくりと回転させて顆部と骨端を取り除き、脛骨骨幹端を露出させます。次に、今実演したように、脛骨に付着しているその他の筋肉や結合組織を取り除きます。骨髄を採取するには、まず18ゲージの針を0.5 mLマイクロ遠心チューブの底に刺し通します。

次に、長管骨の膝側を下にしてチューブに入れ、蓋を閉じます。0.5 mLマイクロセントリフュージチューブを1.5 mLマイクロセントリフュージチューブに入れ、マイクロセントリフュージを用いて10,000 ×g以上の条件で15秒間遠心分離します。目視により、骨髄が骨から完全に抽出されたことを確認してください。

骨は白く見え、大きなチューブ内には大きなペレットが確認できるはずです。次に、0.5 milliliter マイクロ遠心チューブ内の骨を廃棄し、骨髄を目的の下流解析に適した溶液に懸濁させます。この迅速な解剖技術は、組織形態計測法や組織学を含む多くの下流解析に適しています。

実際に、この代表的な組織形態計測用マイクロCT 3D再構築像で示されているように、海綿骨と皮質骨の両方が維持されており、骨組織形態計測のための標準化された構造パラメータの正確な定量化が可能です。H&E染色を施し、ホルマリン固定および脱灰を行った脛骨のこの代表的な組織切片では、組織学的解析のための石灰化骨と細胞性骨髄の両方の完全性が維持されていることが観察できます。さらに、この手順で分離された骨髄は、破骨細胞や骨芽細胞の初代細胞培養を含む、多くのダウンストリームアプリケーションに適しています。

適切に行えば、長骨の解剖から骨髄の分離まで、この手法に習熟すれば約7分で完了できます。処置を行う際は、解剖しやすいようにマウスを配置することが重要です。本手順の後、FACSやその他のシングルセル解析などの手法を用いることで、骨髄細胞集団の変化に関するさらなる疑問を解明することができます。

このビデオを視聴することで、マウスの長管骨を迅速に解剖し、遠心分離によって骨髄を分離する方法について十分に理解できるはずです。