脳スライスにおける GABA のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

このパフ技術の全体的な目標は、全細胞パッチクランプ記録における薬理学的投与を行うことです。この方法は、薬理学的投与など、電気生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、記録部位周辺の薬物濃度が急速に増加するため、膜受容体の脱感作を防ぐことができることです。

一般に、この方法に不慣れな個々の人は、急性前頭前野スライスの準備とパフマイクロピペットの位置が比較的難しいため、苦労します。この手順を開始するには、凍結した切断液を粉砕してスラッシュを取得します。ぬるぬるした溶液を氷の上に保ち、95%の酸素、5%の二酸化炭素で泡

次に、解剖したヘッドを氷冷した切断液で満たされたビーカーに入れ、数秒後に取り出します。頭蓋骨を正中線に沿って尾側-吻側方向に細いハサミで切り取り、頭蓋骨の外側部分を取り除きます。次に、細かいヘラで脳を取り出し、氷冷した切断液に落とします。

その後、氷で満たされた9センチメートルのシャーレの蓋に脳を置きます。氷冷した切断液で脳をすすぎます。次に、カミソリの刃で小脳と嗅球を切り取ります。

その後、シアノアクリレート接着剤をビブラトーム試料ホルダーに塗布します。吻側を上にして、ブレインブロックを接着剤の滴の上に慎重に置き、すぐに氷冷した切断液に浸します。ブレードホルダーを水平面を基準にして15度の角度に調整します。

脳組織を350ミクロンの冠状スライスに切片化します。次に、スライドをACSFで満たされた回収チャンバーに移し、95%酸素、5%二酸化炭素の一定のバブリングで1時間インキュベートします。私たちの実験では、急性前頭前野スライスの準備も手順で重要です。

健康な脳スライスとは、しっかりとパッチを当てることができる活動的なニューロンを意味します。この手順では、記録電極またはパフマイクロピペットとして使用するためのガラスホウケイ酸マイクロピペットを作成します。記録電極の場合、チップ抵抗は4〜6メガオームの範囲ですが、パフマイクロピペットのチップ直径は2〜5マイクロメートルの範囲です。

ACSFにソディオンチャネルブロッカーを添加して、高速ソディオンチャネルを遮断し、活動電位を遮断し、記録チャンバー内でこの溶液の流量を毎分2〜3ミリリットルの一定流量に維持します。ACSFを95%の酸素、5%の二酸化炭素で常に泡立てて、スライスの生存率を確保します。スライスのサイズに合うように先端が細いカットされたパスツールピペットを使用して、脳スライスを記録チャンバーに移します。

次に、プラチナスライスアンカーをスライスの上に置き、プラットフォームに固定します。その後、記録マイクロピペットに内部溶液を充填し、パフマイクロピペットに10マイクロモル、50マイクロモル、100マイクロモルのGABAを充填するか、車両制御としてACSFを充填します。破片による詰まりを防ぐため、記録電極をACSFに浸す前に、1ミリリットルのシリンジでわずかな陽圧を加えてください。

顕微鏡下で、記録電極とパフマイクロピペットを、先端がモニターの中央に見えるように配置します。次に、ターゲットニューロンを特定します。パフマイクロピペットを徐々に下げながら顕微鏡の焦点を調整し、記録ニューロンの上に45度の角度で置きます。

パフマイクロピペットの先端とターゲットニューロンの間の距離を20〜40マイクロメートルの範囲に保ちます。記録電極でニューロンにゆっくりと慎重に近づき、陽圧を解放します。電極ホルダーに接続されたチューブに弱く短時間の吸引を加えて、ギガオームシールを作成します。

電圧をゼロミリボルトに保ちます。ギガオームシールの形成後、高速および低速の静電容量を手動または自動で補正します。次に、チューブを通して短時間かつ強力に吸引し、全細胞モードに入ります。

続いて、電圧クランプモードで誘発されたIPSC電流を記録します。シングルまたはペアのGABAパフは、Master-8電圧ステップジェネレーターによって制御されるパフマイクロピペットを介して送達されます。puff duration を変更して、最適な誘発 IPSC 電流結果を取得し、LPS 誘発抑制モデルで誘発 IPSC 電流を測定します。

ここに示されているのは、10、50、および100マイクロモルのGABAによって誘導されたサンプルIPSCです。そして、これがパフ持続時間の応答曲線です。ここでは、GABAが50マイクロモルのパフで1秒、2秒、または3秒のインターパフ間隔で引き起こす反復電流を示します。

このテクニックをマスターすれば、適切に実行すれば2時間で完了します。この手順を試みるときは、健康な脳スライスを取得することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、薬理学的投与の分野の研究者が電気生理学における薬物の影響を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、全細胞パッチクランプ記録における薬理学的投与の方法について十分に理解できるはずです。TTXでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。