Name: 脳スライスにおける GABA のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶパフ法による全細胞パッチクランプ記録における薬理学的投与法。前頭前野スライスを用いてGABAを局所投与し、受容体脱感作を防ぎながら電気生理学的プロセスを解析する方法です。

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動物飼育および南中国師範大学、国立研究所によって確立された動物のケアのためのガイドラインによると動物の研究のための倫理委員会によって承認された手続きに従って実験を行ったすべての動物健康.
 1 です。 ソリューションの準備 <ol><li>表 1 に記載されている当社の出版された仕事の 7 で説明したコンポーネントを含む人工の標準の脳脊髄液 (アプライド) の準備 500 mL。
	<ol><li>使用きれいなガラス ビーカーを脱イオン水新鮮なアプライド溶液を調製します。脱イオン水でへらをきれいにし、NaCl、KCl、NaH を追加する使用する前に乾燥 2 PO 4 NaHCO 3 MgSO 4、D-グルコース、95% O 2/5% ソリューションを持つバブル後 CaCl 2 を追加、CO 2 脱イオン水 500 ml (としての詳細な表 1) 〜 20 分のための混合物。完全に溶解するまで攪拌します</li>。
		任意の沈殿せずオフに <li>、アプライドは完全にことを確認します。7.2 7.4 に pH を調整します。95% O 2 と 5% CO 2 〜 20 分のための混合ガス気泡</li>
	</ol></li> <li>スライス切断溶液について、表 2 の化学物質 7 250 mL を準備します。
	<ol><li>KCl、MgCl 2 NaH 2 PO 4 NaHCO 3 choline·Cl、D-グルコースを追加し、最後 250 mL の脱イオン水を 1.1.1 に示すように CaCl 2 を追加、1.1.1、1.1.2 で説明されているように溶解します</li>。
		<li>95% O 2/5% をバブル後の CO 2、冷たいと凍結切削ソリューションになるように 15 ~ 20 分冷凍庫にソリューションを配置します 。
		注: 我々 は 1-2 か月からのスライスを作るときこの切削ソリューションを使用-古いマウス;2 か月より古いマウスの式が異なる場合があります</li>。
		<li>エンドトキシン等張生理食塩水に溶解することにより準備組合ソリューション (0.9 %nacl)。LPS は腹腔内投与 (0.5 mg/kg)、2 h を後で記録を開始します</li>。
	</ol></li></ol> 2。前頭野スライスの準備 <ol><li>冷凍庫から切削ソリューションを取るし、スラッシュを取得するホモジナイズしてください。氷上ソリューションを配置し、常にバブルの 95% O 2/5% CO 2.</li>
	<li>大規模な鋭いはさみを使用して、すばやく説明 9 としてマウスの首をはねるし、すぐに氷が入ったビーカーに頭を入れて (0-4 ° C) 切削ソリューションです</li>。
	<li>高級はさみで鼻尾側方向に正中線に沿って頭蓋骨の上部を切り取り、外側頭蓋部分を削除します。冷たい切削ソリューションに高級ヘラとドロップで脳を削除します 。
	メモ: 手順 2.2 2.3 急速に実行する必要があります (理想的には &#60; 1 分) です</li>。
	<li>は、氷を入れた 9 cm シャーレの蓋の脳を配置します。冷たい切削ソリューションで脳をすすいでください。小脳およびかみそりの刃と嗅球切断します</li>。
	<li>試料へ適用シアノアクリ レート系接着剤、vibratome のホルダーです。慎重に、吻側側の接着剤のドロップに脳ブロックを配置し、すぐに冷たい切削溶液に浸します</li>。
	<li>水平平面と 15 度の角度に vibratome のブレード ホルダーを調整し、コロナ脳スライス 350 μ m を準備 (翼振動周波数 = 85 Hz、速度 0.1 mm/s を =).</li>
	<li>定数バブルで 95% O 2/5% (RT) で 1 時間インキュベート アプライド、満ちている回復室にスライス転送ピペットを使用して、CO 2.</li>
</ol> 3。全細胞パッチ記録 <ol><li>作るガラス ホウケイ酸用マイクロ ピペットについて電極として使用または引き手操作マニュアルの特定のガイドラインに従ってマイクロ ピペットをパフします。電極、チップ抵抗は 4-6 M の範囲の &#8486;、パフ用マイクロ ピペットは、2-5 μ m 範囲の先端の直径を持っている</li>。
	<li>は、ブロック高速 Na + チャネルおよびこうして活動電位、アプライドに + Na チャンネル遮断薬 (TTX、1 μ M) を追加し、商工会議所に蠕動ポンプによって録音室で 2-3 mL/分のこの溶液の一定流量を維持それを吸引。バブルのアプライド 95% O 2/5% CO 2 スライスの存続させるため常にします</li>。
	<li>は、スライスのサイズに合わせてカットされた微細先端変更したパスツール ピペットを使用して録音室に脳スライスを転送します。間隔の並列ナイロン スレッドでプラチナ スライス アンカーでスライスをカバー &#8805; プラットフォーム上のスライスを保持するために 2 mm を離れてします</li>。
	<li>記録マイクロ ピペットを詰めて内部ソリューション 7 (表 3)、10 の μ M、50 μ M、100 μ M (アプライドで解散) や車両制御としてアプライドで GABA とパフ マイクロ ピペットを埋める</li>。
	<li>の破片との閉塞を防ぐために、アプライドに記録電極を浸す前に 1 mL の注射器を使用して光の肯定的な圧力を適用されます。顕微鏡 (4 x 対物レンズ)、マイクロマニピュレーターを使用してヒント ( 図 1 A) のモニターで、ビデオ画像の中央に表示されるように記録電極とパフのマイクロ ピペットを置きます</li>。
	<li>はパフ マイクロ ピペットを徐々 に削減しながら顕微鏡焦点 (40 x 対物レンズ) を調整し、45 ° の角度で記録ニューロン上に配置します。パフ マイクロ ピペットの先端と 20-40 μ m ( 図 1 B) 間に記録されたニューロンとの間の距離を保ちます。ゆっくりと慎重に記録電極を神経細胞にアプローチし、肯定的な圧力を離します。ギガ オーム シールを作成する電極ホルダーに接続されているチューブを弱いと簡単な吸引を適用します</li>。
	<li>維持 0 時電圧 mV。ギガ オーム シールの形成後、高速を補うため、手動でまたは自動的に容量を低下します。全体セル モードに入る上記チューブを介して簡潔で強力な吸引を適用します</li>。
	<li>電圧クランプのレコード eIPSC モード。マスター 8 ステップ電圧によって制御される Picospritzer を使用してシングルまたはペアの GABA のパフ ( 図 2) を実現するパフ ピペットに低ガス圧 (窒素、4-6 psi) を適用します</li>。
	<li>ベスト eIPSC 結果 ( 図 3) を取得し、LPS 誘導性うつ病モデル ( 図 4) で eIPSC を測定パフ期間を変更します</li>。
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

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パフ アプリケーション シナプス後受容体機能3,4、7の評価に広く使用、各実験では正確なコントロールが必要です。GABA パフ前頭皮質脳スライスの Ips (すなわち、eIPSCs) の誘導を示す細胞パッチクを含む手順をご紹介します。記録電極の抵抗が約 5 MΩ、パフ用マイクロ ピペットの先端の直径は 2-5 μ m パフ圧力 4 6 psi 間は: この範囲は重要なより低い圧力で発生する可能性より高い圧力は神経の損傷を引き起こす可能性がありますシナプスの GABA 受容体の不十分な活性化。記録されたニューロンにパフ ピペットの先端からの水平距離については 20-40 μ m (1-2 神経細胞の直径)、およびパフ マイクロ ピペットとスライス面の間の角度は約 45 °。パフ ピペットの先端がスライス (z 軸) 上垂直方向に 20-40 μ m です。パフの期間は上記の状況では、10-50 μ M の GABA のパフの下 10 150 さんは適切な...

パッチ ・ クランプの技術、神経細胞の電気信号を調査するための主要なツールは、1970 年代の1,2で開発されました。この手法の主な利点は、どのように特定の治療法の知識を提供すること (例えば、薬理学的) 神経機能やリアルタイムに3チャンネルに変更可能性があります。全細胞脳スライス内の記録の中に神経細胞の機能薬理学的評価には、記録されているニューロンにアゴニストまたは特定の受容体の拮抗薬などの薬物のアプリケーションが必要です。このメソッドは、次のニューロン4の生理学的および病理学的特性のよりよい理解につながる特定の薬剤のアプリケーションに発生する神経の変化の識別を許します。薬理学的管理は、5またはパフ6を灌流といずれかを介して行うことができるが、後者より優れたテクニックです。特に: アプリケーションを急速にパフ (i) 増加薬濃度レベルに記録されたニューロンの膜受容体の脱感作を防止; その(ii) パフ薬物の量は非常に低く、したがって脳のスライスに投与された化学物質の任意の望ましくない影響を軽減入浴ソリューションで少し効果があるよう(iii) パフのプロトコルは、設定、保存、作る実験を非常に正確に再現。(パフ iv) アプリケーションは、アゴニスト/拮抗薬、特に、このような試薬が高価なまたは入手困難の経済的な使用を表します。
ここでは、鋭く準備脳スライス、比較的保存状態の良い脳の回路の利点は、準備で GABA を吹き込むことによって引き起こされる細胞流れを記録に焦点を当てます。パフ誘発抑制電流7を行う方法は、この資料に記載されます。セシウム (Cs+) を使用して-0 でニューロンを押しベースの内部ソリューション、mV、GABA パフ誘発を紹介する適切な技術的な詳細と抑制性シナプス電流 (eIPSCs)。リポ多糖 (LPS) 注入8、我々 は、eIPSC を示す誘発性うつ病のマウスモデルを用いた GABA パフにより誘発される振幅が大幅に車両のコントロールと比較して組合を注入したマウスのスライスで減少します。我々 の意図は、この資料ではパフ手法は脳スライスにおける神経活動の化学物質や化合物の薬剤効果の評価を目的とした研究に広く適用できる方法を表示する必要がありますです。

<table><tbody><tr><td>ガラスホウケイ酸マイクロピペット</td><td>シャッター器具</td><td>BF150-86-10</td><td>外径1.50mm、内径0.86mm</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>シャッター器具</td><td>MODEL P-97&nbsp;</td><td>フレーミング/ブロウマイクロピペットプーラー</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>シャッター計器</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ制御アンプ&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>デジタルアクイジションシステム&nbsp;</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>イメージングカメラ</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>2115001</td><td>検査装置</td></tr><tr><td>顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>エクリプス FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マスター 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>マスター-8 パルス刺激装置</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトームスライサー</td><td>ライカ</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>ジレット</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>ビデオモニター</td><td>パナソニック</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 グルー</td><td>デリ</td><td>7146</td><td>シアノアクリレート接着剤</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>上海 JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>ビデオカメラ</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

脳スライスにおける gaba のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

薬理学的管理は、全細胞パッチク脳スライス内の記録を行う場合に通常使用されます。電気生理学的記録中に新薬承認申請の最善の方法の 1 つは、パフの技術は、薬理学的試薬の脳スライスにおける神経活動に及ぼす影響を研究するためです。パフ アプリケーションの最大の利点はこのように膜受容体の脱感作を防止記録サイト中薬物濃度が急速に増大します。パフのアプリケーションの使用の成功は、次の要素に注意: 薬の濃度、パフ マイクロ ピペット、パフ ピペットと記録、ニューロンの先端と期間の間の距離のパラメーターとパフを運転圧力 (1 平方インチあたりポンド psi)。この資料では、γ-アミノ酪酸 (GABA) 前頭皮質スライスのニューロンに息を切らしによって引き起こされる全細胞の流れを記録するためのステップバイ ステップの手順を説明します。特に、海馬、線条体など他の頭脳区域、細胞培養などの異なる製剤にもマイナー変更と同じ手順を適用できます。

パフ テクニックは、薬の特定の神経細胞の表面に特定の受容体に及ぼす影響の研究に研究できます。この記事では、GABA 受容体を介した電流に着目します。パフと録音用のマイクロ ピペットを図 1に示します。パフは、アプライドによって生成された物理的な圧力の記録されたニューロンに影響を排除するために、ショ糖パフ (図 2A) がコントロールとして使用されます。一方、図 2Bに示すように、アプライド ウォッシュ アウト (ブルー) によって基準状態を回復できます、報告10、ピクロトキシンなどの GABA 受容体阻害剤による GABA パフ (黒) による応答をブロックできます。特に、アプライドもショ糖パフ誘発応答、GABA パフ反応は生理学的な記録された細胞の表面にある GABA 受容体を介...

薬理学的試薬が全細胞パッチ ・ クランプ記録中に投与することができ、その成功に不可欠な機能のさまざまな側面を強調、パフの手法について述べる。

脳スライスにおける GABA のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

このパフ技術の全体的な目標は、全細胞パッチクランプ記録における薬理学的投与を行うことです。この方法は、薬理学的投与など、電気生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、記録部位周辺の薬物濃度が急速に増加するため、膜受容体の脱感作を防ぐことができることです。一般に、この方法に不慣れな個々の人は、急性前頭前野スライスの準備とパフマイクロピペットの位置が比較的難しいため、苦労します。この手順を開始するには、凍結した切断液を粉砕してスラッシュを取得します。ぬるぬるした溶液を氷の上に保ち、95%の酸素、5%の二酸化炭素で泡立てます。次に、解剖したヘッドを氷冷した切断液で満たされたビーカーに入れ、数秒後に取り出します。頭蓋骨を正中線に沿って尾側-吻側方向に細いハサミで切り取り、頭蓋骨の外側部分を取り除きます。次に、細かいヘラで脳を取り出し、氷冷した切断液に落とします。その後、氷で満たされた9センチメートルのシャーレの蓋に脳を置きます。氷冷した切断液で脳をすすぎます。次に、カミソリの刃で小脳と嗅球を切り取ります。その後、シアノアクリレート接着剤をビブラトーム試料ホルダーに塗布します。吻側を上にして、ブレインブロックを接着剤の滴の上に慎重に置き、すぐに氷冷した切断液に浸します。ブレードホルダーを水平面を基準にして15度の角度に調整します。脳組織を350ミクロンの冠状スライスに切片化します。次に、スライドをACSFで満たされた回収チャンバーに移し、95%酸素、5%二酸化炭素の一定のバブリングで1時間インキュベートします。私たちの実験では、急性前頭前野スライスの準備も手順で重要です。健康な脳スライスとは、しっかりとパッチを当てることができる活動的なニューロンを意味します。この手順では、記録電極またはパフマイクロピペットとして使用するためのガラスホウケイ酸マイクロピペットを作成します。記録電極の場合、チップ抵抗は4〜6メガオームの範囲ですが、パフマイクロピペットのチップ直径は2〜5マイクロメートルの範囲です。ACSFにソディオンチャネルブロッカーを添加して、高速ソディオンチャネルを遮断し、活動電位を遮断し、記録チャンバー内でこの溶液の流量を毎分2〜3ミリリットルの一定流量に維持します。ACSFを95%の酸素、5%の二酸化炭素で常に泡立てて、スライスの生存率を確保します。スライスのサイズに合うように先端が細いカットされたパスツールピペットを使用して、脳スライスを記録チャンバーに移します。次に、プラチナスライスアンカーをスライスの上に置き、プラットフォームに固定します。その後、記録マイクロピペットに内部溶液を充填し、パフマイクロピペットに10マイクロモル、50マイクロモル、100マイクロモルのGABAを充填するか、車両制御としてACSFを充填します。破片による詰まりを防ぐため、記録電極をACSFに浸す前に、1ミリリットルのシリンジでわずかな陽圧を加えてください。顕微鏡下で、記録電極とパフマイクロピペットを、先端がモニターの中央に見えるように配置します。次に、ターゲットニューロンを特定します。パフマイクロピペットを徐々に下げながら顕微鏡の焦点を調整し、記録ニューロンの上に45度の角度で置きます。パフマイクロピペットの先端とターゲットニューロンの間の距離を20〜40マイクロメートルの範囲に保ちます。記録電極でニューロンにゆっくりと慎重に近づき、陽圧を解放します。電極ホルダーに接続されたチューブに弱く短時間の吸引を加えて、ギガオームシールを作成します。電圧をゼロミリボルトに保ちます。ギガオームシールの形成後、高速および低速の静電容量を手動または自動で補正します。次に、チューブを通して短時間かつ強力に吸引し、全細胞モードに入ります。続いて、電圧クランプモードで誘発されたIPSC電流を記録します。シングルまたはペアのGABAパフは、Master-8電圧ステップジェネレーターによって制御されるパフマイクロピペットを介して送達されます。puff duration を変更して、最適な誘発 IPSC 電流結果を取得し、LPS 誘発抑制モデルで誘発 IPSC 電流を測定します。ここに示されているのは、10、50、および100マイクロモルのGABAによって誘導されたサンプルIPSCです。そして、これがパフ持続時間の応答曲線です。ここでは、GABAが50マイクロモルのパフで1秒、2秒、または3秒のインターパフ間隔で引き起こす反復電流を示します。このテクニックをマスターすれば、適切に実行すれば2時間で完了します。この手順を試みるときは、健康な脳スライスを取得することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、薬理学的投与の分野の研究者が電気生理学における薬物の影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、全細胞パッチクランプ記録における薬理学的投与の方法について十分に理解できるはずです。TTXでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、GABA活性化単一チャネル電流（GABAAチャネル、GABAA受容体）とそれらが神経細胞で生成シナプスとトニック電流を測定するパッチクランプ技術を使用してください。チャネルの活性化は、健康や​​病気で神経細胞の興奮性を低下させる...

ラット脳スライスにおけるGABA活性化シングルチャネルとトニック電流

このビデオは、マウスの前頭前野皮質脳スライスにおけるγ-アミノ酪酸(GABA)によって誘発される全細胞電流の記録を示しています。GABAの制御された送達は、シナプス後ニューロンの塩化物チャネルを開き、抑制性シナプス後電流(IPSC)を生成します。これらのIPSCは、GABA濃度が高くなると増加し、シナプス伝達に対するGABAの阻害活性を反映しています。...

マウス脳スライスにおけるGABAパフによる全細胞電流の記録

皮質ネットワークは抑制性介在ニューロンの小さいが、多様なセットで制御されます。介在ニューロンの機能的研究は、そのためターゲットを絞った記録や厳密な識別を必要とします。ここで説明するには、単一または細胞内の標識と神経細胞のシナプス結合のペア、事後形態学的および免疫細胞化学分析からホールセル記録を含む組み合わされたアプローチです。...

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

振動は、基本的なネットワークのプロパティであり、病気や薬物によって調節されます。脳スライス振動を研究することは、制御された条件下で分離されたネットワークの特徴付けを可能にします。プロトコルはCA1のγ振動を誘発するための急性脳切片の調製のために提供されます。...

テタヌス刺激による局所CA1γ振動の発生

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

ここでは、生理・薬理のバインドからの GABAAの受容器のアクティブな化合物を発見するためのプロトコルを提案する.

Γ-アミノ酪酸受容体をモジュレート新規化合物の探索の方法を入力、神経伝達

急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性...

齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始

ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG...

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

提示されたプロトコルは、潜在的な抗てんかん物質の前臨床評価ツールとして重要な脳スライスを使用するという究極の目標を持つ切除されたヒト海馬組織の輸送および調製について説明する。...

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

学ぶパフ法による全細胞パッチクランプ記録における薬理学的投与法。前頭前野スライスを用いてGABAを局所投与し、受容体脱感作を防ぎながら電気生理学的プロセスを解析する方法です。

脳スライスにおける GABA のパフアプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

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