Name: ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶ ナノ材料のタンパク質・代謝物コロナ解析法。キャピラリー電気泳動質量分析法（CESI-MS）を用いて、生体試料からのバイオマーカー検出とナノ材料表面の分子相互作用を高感度に評価する手法です。

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A.J.C、J.A.T、I.Lは、ホライゾン2020プロジェクトACEnano(グラントno.H2020-NMBP-2016-720952)。W.Zは、中国奨学金評議会(CSC、no. 201507060011からの博士号の資金調達を認めています。R.Rは、オランダ科学研究機構(NWO Vidi 723.0160330)のVidi補助金スキームの財政的支援を認めています。

人間のバイオ流体の使用は、ライデン大学とインスブルック医科大学からのIRBプロトコルガイドラインに従って承認されました.ヒトまたは動物の生物流体が調査される場合、研究機関からの倫理的承認が必要であり、本プロトコルに示された結果の場合に得られた。さらに、将来の作業9、29、30におけるデータの透明性と再利用性を確保するために、適切なレポートを実行する必要があります。
1. バックグラウンド電解質の調製(BGE)
注:すべての溶剤は、適切なヒュームフードで準備する必要があり、適切な個人用保護具は、すべてのステップ(ラボコート、手袋、ゴーグル)に使用する必要があります。各ステップでは、低結合プラスチックバイアルは、ガラス製品から浸出した塩でサンプルの検体損失と汚染を最小限に抑えるために必要とされます。
<ol><li>10%酢酸BGE(v/v)、pH 2.2を毎日メタボロミクス用に調製します。<ol>
<li>10 mLの体積フラスコに酢酸1 mLを加え、続いて脱イオン(DI)水をマークされたラインに添加し、完全に混合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテオミクス用の100 mM酢酸、pH 2.9を毎日準備します。<ol>
<li>10 mLの体積フラスコに酢酸57 μLを加え、続いてDI水を印のラインに加えて、完全に混合します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM製剤
<ol><li>公表されたガイドライン31、32、33を使用して、NMを水に激しく分散させる。 注:このプロトコルの開発では、7つのNMが次のように使用されました:100および1,000 nmカルボキシレートポリスチレンは、それぞれタンパク質および代謝物コロナに使用されました。100 nm未修飾ポリスチレンNMs、ポリアクリレートまたはPVPポリマーのいずれかで未修飾またはコーティングされた13nmアナターゼTiO2 NMsおよび22nm未修飾SiO2 NMsをタンパク質および代謝物コロナの両方に使用した。この方法は、これらのNMを用いて開発および実証されたが、このアプローチは、NMの組成、サイズ、形状、および形態の広い配列に適用可能であろうことに留意すべきである。</li>
	<li>動的光散乱34、35、単粒子誘導結合プラズマ質量分析36、ナノ粒子追跡解析37、またはゼータサイザー34を用いたゼータ電位としての透過電子顕微鏡および表面電荷のいずれかを使用して、粒子サイズを特徴付け。</li>
</ol>3. 生体分子コロナ形成
<ol><li>2 mLのヒト血漿(または選択した生体液)を1 mLのアリコートに分割し、1つは代謝産物とタンパク質のコロナ用、もう1つは血漿メタボローム特性評価用に割り込みます。</li>
	<li>サーモミキサーで500rpmで軽く混合しながら、37°Cで1時間、ヒトプラズマ中の1mg/mLのNMをインキュベートします。インキュベーション遠心分離機に続いて、4°Cで15分間4,000 x g でサンプルをペレット化し、NMsをペレット化します。</li>
	<li>血漿上清を収集し、コロナの代謝物を分析します。タンパク質コロナ特性評価のためのNM-タンパク質コロナ複合体を保持します。</li>
</ol>4. タンパク質コロナ分離
<ol><li>NM-タンパク質複合体(ペレット)を1mLの10x PBSバッファーに再懸濁し、渦を2分間激しく再懸濁させて、アンバウンドタンパク質を除去します。PBS溶液を4000xgで4°Cで15分間遠心し、NMsをペレット化し、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去する。</li>
	<li>ペレットを1mLの炭酸水素アンボネート緩衝液(ABC)(100mM、pH 8.0)と渦を2分間激しく再懸濁し、結合していないタンパク質および望ましくない塩を除去する。4°Cで15分間4,000 x g で遠心分離機をNMsをペレットにする。上清を削除し、廃棄します。この手順を繰り返します。</li>
	<li>10 mMジチオアシトールを含む20 μLのABCバッファー(100 mM pH 8)にNM-タンパク質ペレットを溶解することにより、タンパク質ジスルフィド結合を低減します。56°Cで30分間の還元液をインキュベートします。</li>
	<li>タンパク質を消化するには、0.1%界面活性剤を含むABCの20 μLに2μgのシーケンシンググレードトリプシンを加えます。37°Cで16時間消化液をインキュベートする。</li>
	<li>アルキル酸試料は、100mM ABCで55mMで20μLのヨウドアセトアミドを添加し、室温で20分間インキュベートする。</li>
	<li>20 μLの0.1 M HClを加えて界面活性剤を切断し、室温で10分間放置します。</li>
	<li>C18パック脱塩ピペットチップを用いてペプチドを濃縮・脱塩する。<ol>
<li>80 μL 0.1%のギ酸50%の酢酸50%の酸でチップを湿らせ、80 μL 0.1%のギ酸を5回洗浄し、サンプルを10回引き上げて溶出し、80 μL 0.1%のギ酸を5回洗い流してサンプルを2回溶出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを凍結乾燥し、分析まで-20 °Cで保存します。</li>
</ol>5. 代謝物コロナ分離
<ol><li>ステップ3.3からNMプラズマインキュベーションから制御プラズマと上清を取り出し、サンプル調製中に氷の上に保管してください。</li>
	<li>それぞれ50μLを別々のバイアルに取り、DI水で10分の1を希釈します。希釈したサンプルを50μLずつ取り、ステップ5.3の新しいバイアルに移動します。</li>
	<li>200 μL クロロホルム、250 μL メタノール、350 μL DI 水を加え、2分間の渦混合物を2分間激しく加えます。4°Cで20,800 x g で10分間の遠心分離機。</li>
	<li>上清500μLを取り、4°Cで10,000 x g で2時間の3kDa遠心フィルターを通してフィルターを取ります。430 μLの超浸透液を取り、速度で乾かします。分析の前にサンプルを凍結できるようになりました。</li>
</ol>6. CESI-MSシステムの作成38
注意:毛細血管の取り付け前に、毛細血管の入口と出口の端がそのままであり、毛細血管に目に見える破損がないことを確認してください。
<ol><li>タンパク質コロナ分析のための中性コーティング毛細管の設置39.<ol>
<li>メーカーのガイドラインに従って、新しいニュートラルコーティングされたキャピラリー(30 μmの内部直径の90 cmの長さ)をCESI機器に取り込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテオミクス解析のためのCESI毛細血管の調製<ol>
<li>100 psiで5分間HClの100 mMを使用して分離キャピラリーを前方方向に洗い流し、毛細管の出口で液滴形成を確認します。BGEで100 psiで10分間の分離キャピラリーをフラッシュし、100 psiでDI水を30分間洗浄します(これは新しい毛細血管にのみ必要です)。</li>
		<li>分離毛細血管と導電性キャピラリーの両方を90 psiでBGEで5分間洗い流し、両方の毛細血管の出口端に液滴が形成されるようにします。</li>
		<li>90 psiでDI水で分離キャピラリーを10分間洗い流し、0.1 M HClで10分間50 psi、続いてDI水で10分間90 psi、最後に90 psiで10分間BGEを洗い流します。先に説明したナノスプレーソースとアダプタを使用して、CESIをMSに結合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>代謝物コロナ特性評価のための裸の融合シリカ毛細管の設置38.<ol>
<li>新しい裸のシリカキャピラリー(30 μmの内部直径の90 cmの長さ)を製造者のガイドラインに従ってCESIの器械に入れる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メタボロミクス分析のためのCESI毛細血管の調製<ol>
<li>分離キャピラリーを50psiで100%MeOHで15分間使用して前方方向に洗い流し、毛細管の出口で液滴形成を確認します。分離毛細管と導電性キャピラリーの両方を90 psiで90 psiで5分間洗い流し、両方の毛細血管の出口で液滴が形成されるようにします。</li>
		<li>90 psiで10分間DI水で分離キャピラリーを洗い流し、0.1 M NaOHで10分間50 psi、続いてDI水で10分間90 psi、最後に90 psiで10分間BGEを行います。先に説明したように、ナノスプレーソースとアダプタを使用してESI-MSにCESIを結合します。38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. タンパク質コロナ分析用CE-MS
<ol><li>50 mM酢酸アンモニウム pH 4.0 のステップ 4.8 から 20 μL のサンプルを再中断します。</li>
	<li>5 psi 10 s の流体力学的注入をサンプルの実施します。30 kV分離電圧を使用して、1 psiで0-10分、1.5 psiで10〜35分、100 mMを使用して5 psiで35-45分、BGEとしてpH 2.9酢酸を使用して分離します。</li>
	<li>top-10 データ依存フラグメンテーション取得により、250 ~ 2000 m/z の質量スペクトルを収集します。</li>
	<li>サンプル間、0.1 M HClを用いて0.1 M HClを3分間100 psiで、BGEの10分100 psiで分離キャピラリーを分離し、導電性液体毛細管の場合は100 psiで3分間リンスします。</li>
</ol>8. 代謝物コロナ分析用 CESI-MS
注: すべてのサンプルは、陽イオン検出用に正のモードで 1 回、陰性モードで 1 回、陰性検出のために 2 回分析する必要があります。制御プラズマサンプルは、少なくとも5回分析する必要があります。
<ol><li>ステップ5.4から430μLのDI水と2分間の激しい渦中のNM露光および未露出したプラズマサンプルを再中断します。0.1 μmの膜フィルターを通してフィルター。</li>
	<li>95 μLの濾液を取り、200 μMでイオン(L-メチオニンスルホン)、陰イオン(2,2,4,4-D4-クエン酸)と渦に対して400 μMの内部標準を5 μL加え、渦を活発に加えます。CESI-MS分析前の4°Cで4,000 x g の遠心分離機を10分間行います。</li>
	<li>2 psiで30 s(カチオン)と40 s(陰イオン)のサンプル流体力学的に注入します。</li>
	<li>10% 酢酸で代謝産物を分離し、分離電圧は 30 kV で前方(カチオン)、逆(陰イオン)モードで分離します。逆分離モードは分離毛細管の0.5 psi前方圧力で補助される。</li>
	<li>質量分析計を設定して、質量範囲 65~1000 m/z で正(陽イオン)または負(陰イオン)モードでデータを収集します。サンプル間、0.1 M HCl、0.1 M NaOH、DI水、BGEを50 psiで2分間リンスします。</li>
</ol>

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J.A.Tは、ACEnanoプロジェクト、J.A.Tの業界パートナーとして参加しているAB Sciex UK Ltdの従業員であり、他のすべての著者はこの作業に利益相反はありません。

これは、CESI-MSを使用して、同じサンプルからタンパク質および代謝産物を組み込んだ完全な生体分子コロナを特徴付けるために提案された最初の方法です。同じサンプルからタンパク質と代謝産物の両方を特徴付ける能力は、単一の実験的暴露から収集されたデータの量を大幅に増加させ、コロナ形成のプロセスとナノ医薬品としてのNMs毒性および有効性に対する新しい洞察を可能にします。さらに、CESI-MSは、必要なキャピラリーの変更だけで生体分子の両方のクラスを特徴付けるための理想的なプラットフォームです。今後、非水性CE用に開発された新しい方法により、CE-MS40 を用いて脂質工学を実行することが可能となり、単一のプラットフォームを用いてタンパク質、代謝物、脂質を分析できるようになりました。現在の従来のアプローチでは、タンパク質コロナ用と代謝物コロナ用の2つの専用LC-MSプラットフォームが必要です。したがって、このアプローチでは、単一の分析プラットフォームを使用して 2 倍のデータを収集できます。
このプロトコルはコロナの間接的な測定を提案しているので、このアプローチには特に代謝物コロナでいくつかの注意点があります。したがって、代謝産物レベルがNMsに対して高濃度で存在し、その後のマトリックス中の代謝産物濃度の低下が小さい場合に問題が生じることがある。しかし、タンパク質コロナとは異なり、各NMがユニークな表面化学を有するため、代謝物コロナを単離するための「1つのサイズがすべてに適合する」アプローチが開発される可能性は低い。今後は、代謝物コロナを分離するためのNM固有のアプローチが開発され、検証される可能性が高くなります。これは、その特定の NM にのみ適用されます。それにもかかわらず、CESI-MSは、それらがどのように分離されているかに関係なく、極性荷電代謝物の特性化に非常に適したプラットフォームです。また、NMsをペレット化するように設計された遠心分離工程中にペレットが形成されない場合、より高い遠心力が必要になる可能性があります。これは、密度の低い NM で発生する可能性が最も高いです。また、毛細孔の狭い穴のために、すべてのフィルタリングステップがプロトコル内に付着していることも重要であり、粒子状物質がサンプルから十分に除去されていない場合に容易にブロックされる可能性があります。
タンパク質コロナは、代謝物コロナとそれを組み合わせる能力は、バイオナノインターフェース6、14を研究する科学者のための新しい関心分野であるが、長年にわたって研究の強烈な領域であった。現在までに、これらの研究の大部分は、代謝物コロナ9,28の非極性、脂質分率に焦点を当ててきた。この電流法は、エネルギー代謝、解糖、およびDNA合成に関与する重要な代謝産物を含むコロナにおける極性および荷電代謝物の特性評価を可能にする。その結果、プロテオミクスワークフローと組み合わせると、生体分子コロナのより全体的な特徴付けが可能となる。これにより、バイオナノ相互作用の詳細な分析が可能になります。この方法は、タンパク質および膜受容体との代謝産物相互作用を介して、受容体媒介性エンドサイトーシスに対する強化された機械化的洞察を可能にする。さらに、タンパク質と小分子間のコロナ相互作用とコロナ内相互作用が探索される可能性がある。例えば、最近、コロナ中のタンパク質が代謝産物15の募集において重要な役割を果たしていることが示されている。図3と図4の代表的な結果は代謝産物の絶対定量化ですが、多変量データ分析を用いた非標的型アプローチは、露出したプラズマと比較してコントロール内のすべてのCE-MS機能を比較することで、代謝産物の結合も解明します。したがって、代謝産物およびタンパク質がNMコロナへのそれぞれの採用に影響を与える方法と、どのタンパク質を調査する重要な範囲があります。これらの追加研究は、ナノ医薬品の送達を最適化するためのコロナの設計や、生体分子コロナブロッキングやマスキングターゲティング機能による医薬品作用の抑制などの開発のさらなるハードルを明らかにするのに役立つ可能性があります。
約20 nL/minのナノスケールの流量と有機溶剤の使用の最小限の使用を有するCESI-MSは、それぞれ、メタボロミクスおよびプロテオミクス研究の主な課題である溶媒使用の点で、標準的なLC-MSおよびnanoLC-MSよりもグリーンおよび経済的な信任状の改善を提供する。CESI-MS は、LC-MS ベースの方法11,15と比較して、移行時間とピーク領域の両方に対して非常に再現性の高い結果を提供します。さらに、持ち越しは、CESI-MSでは、nanoLC-MSと比較して問題ではありません。したがって、サンプル分析の間の広範なシステムクリーンアップは必要とされず、サンプルスループット11が大幅に向上します。
要約すると、提案されたワークフローは、NMsの完全な生体分子コロナのタンパク質および代謝産物成分の両方を特徴付けるアプローチを最初に詳述するものである。これは、バイオナノ相互作用の新しい側面、代謝物コロナを解き放ち、同じサンプルから2倍のデータを収集することができ、バイオナノ界面での相互作用をより完全に理解することができます。

生体ナノ相互作用は、生体分子がNMに吸い込むナノ材料(NM)表面と生物学的マトリックスとの界面において、ナノセーフティとナノメディシン1を支える研究の激しい分野である。この吸着された生体分子の層は、生物学的同一性をNMsに与え、したがって細胞はそれらを「自己」として識別し、その後細胞の取り込み、分布および生物学的エンドポイント2、3、4に影響を与える。バイオナノ研究の大半は、コロナ内のタンパク質に焦点を当てており、タンパク質が異なる組成5のNMs間で定量的および定性的に変化することを実証している。この変動は、組成および塩分5を含む生物学的マトリックスの特性に加えて、サイズ、機能化、および材料などのNMの特性の両方に依存する。バイオナノインターフェースの関心の高まりの領域は、NMs6に吸い付ける代謝産物である。いくつかの研究は、タンパク質と同様に、NM特性がコロナ中の代謝産物の組成を決定する重要な要因であり、それらがNM曝露6、7、8の生物学的転帰に影響を与えることができることを実証している。
生体分子コロナの研究では、その特徴付けに4つの異なる相があり、コロナ形成、コロナ内の生体分子の単離、定性的または定量的質量分析および同定を介したそれらの検出9。現在までに、SDS-PAGEランニングバッファーでの沸騰、溶媒および塩抽出、またはNMsの表面上のタンパク質の直接消化を含むタンパク質コロナを単離する様々な技術が採用されています。コロナ中の代謝産物の観点から、分離は、溶液8、10、11として提案された溶媒またはNMsの溶解を用いた様々な方法でより複雑である。しかし、タンパク質コロナとは異なり、「1つのサイズがすべてに適合する」アプローチは、メタボロームが占める広い化学空間と可能なNMsの多様性のために、NMsからの代謝産物の単離に適用される可能性は低い。別のアプローチは、NMsへの代謝産物の吸着に起因する代謝産物濃度の差を有するNM曝露の前後の生物学的マトリックスを特徴付ける。
この代替アプローチは、すべてのバイオ流体とNMに適用され、2倍の分析が必要ですが、結果的に代謝物コロナのはるかに正確な尺度を提供し、NM表面からの低代謝物回収が特定の代謝産物の低結合と間違えられるリスクはありません。
生体分子コロナ解析の第2ステップは生体分子の検出です。伝統的にコロナのタンパク質のために、これはナノLC-MS、プロテオミクスの役馬のレビットでした。NMR13、1D、2DSDS-PAGEなどの他のアプローチも適用されています。代謝物コロナLC-MS7の観点から、GC-MS8および直接注入質量分析が利用された14.しかし、新しいアプローチは、最近、牽引力を得るために始まった、すなわち毛細血管電気泳動質量分析(CE-MS)11、15とNMsの様々な物理的および化学的特性を特徴付けるためのスタンドアロン技術としてNMラボに存在している。CE-MSは、nanoLC-MSおよびGC-MSに対する直交分離技術であり、極性および荷電代謝物17、18の検出を可能にすることができる。さらに、CE-MSは、タンパク質の分析およびリン酸化およびグリコシル化19、20、21、22などの翻訳後修飾に適している。最後のステップは、定量的/定性的または標的/対象化されていないアプローチが使用されている場合、これは、このプロトコルの残数の外にある場合に応じて、いくつかの方法で行うことができる。
CEI-MSは、CEとnanoESIインターフェースの組み合わせであり、シースレスインターフェースを利用したCE技術の最近の進歩です。これにより、超低流量CE(<20 nL/min)を希釈のない高分解能質量分析計に直接接続できるため、検出感度が23、24、25と大幅に向上する。CESI-MS は、高感度分析26を維持しながら、体積制限サンプル (< 10 μL) を分析できます。CESI-MSはまた、再現性27、28、スループットの点でプロテオミクスおよびメタボロミクスで使用される従来の低流量nanoLC-MSアプローチと良好に比較し、完全な生体分子コロナ特性評価のためのエキサイティングな見通しを作ります。
この研究は、完全な生体分子NMコロナのタンパク質および代謝産物の両方の側面からのデータを最大化するような方法で、単一のヒト血漿サンプルからNM生体分子コロナを単一の血漿サンプルから分離するために必要なサンプル調製物を説明する。我々は、ヒトの血漿の使用について報告するが、このプロトコルは、血清、完全な細胞培養培地、細胞リセート、脳脊髄液または尿などの他の生体流体に対して同様に適切であろう。これらの2つの成分(タンパク質および代謝産物)の分析は、カチオン性およびアニオン性代謝産物の両方に対して、タンパク質コロナおよび裸の融合シリカ毛細血管に対する中性コーティングされたCESI毛細血管を使用して記述される。

<table><tbody><tr><td>1,4-ジチオスレイトール</td><td>Σ</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>内部標準陰イオン</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム >98%</td> <td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム >99.5%</td> <td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー カートリッジ クーラント</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000機器</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI キャップ</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI バイアル</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>650498</td><td>有毒、ヒュームフードでの使用</td></tr><tr><td>氷河酢酸</td><td>シグマ</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 1mol/L</td><td>シグマ</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>イオアセトアミド</td><td>シグマ</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニンスルホン</td><td>シグマ</td><td>M0876-1G</td><td>内部標準カチオン</td></tr><tr><td>メトナール (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>シグマ</td><td>14262</td><td>ヒュームフードでの使用</td></tr><tr><td>マイクロバイアル</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>ナノバイアル</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラル サーフェス カートリッジ 30 & マイクロ;M ID x 90 cm 全長</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS アダプター Sciex Nanospray III ソース</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 および B83386 サーモ質量分析計用、B85397 ウォーターズ質量分析計用、B86099 ブルカー製質量分析計用</td></tr><tr><td>OptiMS フューズドシリカカートリッジ 30 &micro;m ID x 90 cm 全長</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>ホスパス緩衝生理食塩水 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 チップ、100 & マイクロ;L ベッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン 100 nm</td><td>ポリサイエンス</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンカルボキシル化 100 nm</td><td>ポリサイエンシズ</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンカルボキシレーション 1000 nm</td><td>ポリサイエンシズ</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>ラピゲスト SF (界面活性剤)</td><td>ウォーターズ</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシング グレード 修正トリプシン</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispexコーティング</td><td>されたPromethion粒子</td><td>オーダーメイドの粒子</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVPコーティング</td><td>されたPromethion粒子</td><td>オーダーメイドの粒子</td><td></td></tr><tr><td>TiO2コーティングされていない</td><td>Promethion粒子</td><td>特注の粒子</td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

周囲の生体マトリックスからナノ材料(NMs)の表面に生体分子を吸着してコロナを形成することは、過去10年間注目されてきました。バイオナノ界面への関心は、生体分子コロナが生物学的アイデンティティをNMに与え、身体がそれらを「自己」として識別するという事実から生じる。例えば、以前の研究では、コロナのタンパク質が細胞の取り込みに影響を与えるために膜受容体と相互作用することができることを実証し、コロナがNMsの細胞密売とその最終的な毒性を担っていることを確立しました。これまで、ほとんどの研究はタンパク質コロナに焦点を当て、完全な生体分子コロナの成分間のコロナまたは相乗効果に含まれる代謝産物の可能性のある影響を見落としてきました。このように、この研究は、ボトムアッププロテオミクスとメタボロミクスアプローチを並行して使用して、生体分子コロナのタンパク質成分と代謝産物成分の両方を特徴付ける方法論を実証する。これには、タンパク質回収を高めるために使用される界面活性剤を含むタンパク質コロナのオン粒子ダイジェストと、NM曝露前後の代謝物マトリックスを分析することによって代謝産物コロナの受動的特徴付けが含まれます。NMコロナ特性解析の新技術として、キャピラリー電気泳動(CESI-MS)を新たな技術として紹介します。ここで概説するプロトコルは、CESI-MSを使用して、NMsによって取得されたタンパク質と代謝物コロナの両方の信頼性の高い特性評価にどのように使用できるかを示しています。CESI-MSへの移行は、必要なサンプルの量を大幅に減少させます(従来の液体クロマトグラフィーと比較して – 質量分析(LC-MS)アプローチ) サンプルの少なくとも5 μLから複数の注入を可能にし、それは容量制限されたサンプルに最適です。また、CESI-MSの低流量(<20 nL/min)や有機溶剤の必要性を排除する水性電解質の使用により、LC-MSに対する環境負荷が低減されます。

記載された方法は、同じヒト血漿サンプルを用いてNM生体分子コロナ中のタンパク質および代謝産物の両方を特徴付ける最初の方法である。この方法は、&gt;200タンパク質および&gt;150代謝産物を検出することができ、完全な生体分子コロナの最も包括的な概要を決定することができ、NMsの細胞の取り付け、取り込みおよび影響の理解を強化することができます。
プロテオミクス(図1)とメタボロミクス(図2)の両方にCESI-MSを使用すると、分離と検出が各アプローチの両方の毛細血管に良好な分離ウィンドウを示しています。
この方法は、広範囲のNMs組成にわたってコロナ中のタンパク質を区別することができるため、幅広い物理的および化学的特性にわたるNMsへの方法の適用性を実証する(表1)。
代謝物コロナの一意の指紋は、この方法論のメタボロミック枝を使用して区別することもできる(図3)。このアプローチは、NM代謝物コロナを特徴付ける受動的なアプローチを利用しているが、異性体の微分吸着などの生体分子コロナにおける代謝産物の役割に関する興味深い洞察を明らかにすることができる(図4)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> 図1:SiO2タンパク質コロナ分離の例示的な粒子消化に続くCESI-MSを用いた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> 図2:CE-MSにより血漿中の内因性化合物から得られたイオンエレクトロフェログラムの抽出例。 番号付き化合物は次のとおりです: 1. オルニチン;2. リジン;3. アルギニン;4. ヒスチジン;5. クレアチン;6. グリシン;7. アラニン;8. ヴァリン;9. イソロイシン;10. ロイシン;11. セリン;12. スレオンニン;13. アスパラギン;14. メチオニン;15. グルタミン;16. グルタミン酸;17. フェニル-D5-アラニン;18. フェニルアラニン;19. チロシン;20. プロリン;21. メチオニンスルホン (内部標準).オープンアクセスクリエイティブコモンズCC BYライセンスで公開され、Zhangら17から再現. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:6つのNMsアレイにわたるタンパク質コロナの分析。シリカ(SiO2)、チタニア(TiO 2)、PVPキャップチタニア(TiO2-PVP)、ディスペックスキャップチタニア(TiO2-Dispex)、ポリスチレンおよびカルボキシ化ポリスチレンNMsに対するタンパク質の豊富度を示す割合。異なるNMコロナにおけるタンパク質の相対的な存在量に観察された違いを考えると、この提案されたプロトコルは、異なるNMsのタンパク質コロナを区別するのに十分に敏感であることは明らかである。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">こちらの表をダウンロードしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> 図3:NMコロナにおけるカチオン代謝産物の標的分析。SiO2およびTiO2のNMsへのカチオンの吸着は、赤は代謝産物の初期濃度を指し、青は37°CでのNMsとの1時間のインキュベーション後の代謝産物の濃度を指す。溶液中の代謝産物濃度の低下は、NM表面への代謝産物吸着の結果である。ポリスチレンNMsに対して代謝物の有意な吸着は認められなかった。ボックスプロットは最小値と最大値、中央値および四分位間範囲を表す。オープンアクセスクリエイティブコモンズCC BYライセンス15の下で公開された代謝物コロナのCESI-MSターゲット分析から再現された図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> 図4:異性体吸着に焦点を当てたNMコロナ中のアニオン性代謝産物の標的分析。 チタニアのNMsの範囲への陰イオンの吸着は、例の糖リン酸塩のような様々な異性体の間に明確な違いを示す。赤色は代謝産物の初期濃度を指し、一方、青色は37°CでNMとの1時間のインキュベーション後の代謝産物の濃度を指す。溶液中の代謝産物濃度の低下は、NM表面への代謝産物吸着の結果である。SiO2 には代謝物の有意な吸着は認められず、ポリスチレンNMs.Boxプロットは最小値と最大値、中央値および四分位間範囲を表す。オープンアクセスクリエイティブコモンCC BYライセンス15の下で公開された代謝物コロナのCESI-MSターゲット分析から再現された図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>アナライト</td>
			<td>平均RSDピーク面積</td>
			<td>平均 RSD 移行時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928ペプチドの日中(n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 カチオンインデイ (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 カチオン間 (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ペプチドおよびカチオン代謝産物に対するCESI-MS技術複製の再現性RSD:相対標準偏差、再現性の尺度として。CESI-MSのピーク領域と移行時間の再現性は非常に良好で、すべての検体は平均RSD&lt;15%、移行時間は2.2%&lt;。これらの結果は、この手法を用いて収集されたデータに起因する高い信頼度を示し、検出された変動が分析的変動ではなくサンプル組成(NMの濃縮)の真の違いによるものであることを確認した。表 2 は、前に11,15で示した結果から生成されます。

ここでは、毛細血管電気泳動-質量分析手法を用いて、ナノ材料が生体流体から得た完全な生体分子コロナ、タンパク質、代謝産物を特徴付けるプロトコルを紹介します。

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

このプロトコールは、タンパク質コロナだけでなく、ナノマテリアルの代謝物コロナの特性評価にもCESI-MSを実装した最初のプロトコルです。CESI は、従来の LCMS メソッドと相補的な分離を提供し、わずか数ナノリットルのサンプルを使用しながら、高い再現性と感度を兼ね備えています。まず、ヒト血漿の2ミリリットルを1ミリリットルのアリコートに分割し、1つは代謝物とタンパク質コロナ用、もう1つは血漿メタボロームの特性評価用です。ヒト血漿中のナノマテリアル1ミリグラム/ミリグラムを摂氏37度で1時間インキュベートし、サーモミキサーで毎分500回転で穏やかに混合します。次に、4,000倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離することにより、ナノ材料をペレット化する。代謝物コロナ分析のために血漿上清を収集し、タンパク質コロナの特性評価のためにナノ材料タンパク質コロナ複合体を保持します。ペレットを1ミリリットルの10X PBSバッファーに再懸濁し、2分間激しくボルテックスして未結合のタンパク質を除去します。溶液を4, 000倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離し、ナノ材料をペレット化し、ペレットを乱さずに上清を慎重に除去します。ペレットを1ミリリットルのABCバッファーに再懸濁し、2分間激しくボルテックスして、未結合のタンパク質と未結合の塩を除去します。遠心分離ステップを繰り返し、上清を捨てます。ペレットを10ミリモルジチオスレイトールを含む20マイクロリットルのABCバッファーに溶解して、タンパク質ジスルフィド結合を減らします。溶液を摂氏56度で30分間インキュベートします。0.1%の界面活性剤を含むABC緩衝液の20マイクロリットルにシーケンシンググレードのトリプシンを2マイクログラム加え、消化液を摂氏37度で16時間インキュベートします。100ミリモルABCに20マイクロリットルの55ミリモルヨードアセトアミドを加えてサンプルをアルキル化し、室温で20分間インキュベートします。0.1モルの塩酸を20マイクロリットル加えて界面活性剤を切断し、サンプルを室温で10分間放置します。本文原稿に記載されているように、C18充填脱塩ピペットチップを使用してペプチドを濃縮および脱塩します。その後、サンプルを凍結乾燥し、分析まで摂氏マイナス20度で保存します。ナノ材料プラズマインキュベーションからコントロールプラズマと上清を取り出し、氷上に置きます。各サンプルから50マイクロリットルを別々のバイアルに分注し、蒸留水で10倍に希釈します。ボルテックス後、この希釈したサンプルの50マイクロリットルを新しいバイアルに移します。200マイクロリットルのクロロホルム、250マイクロリットルのメタノール、350マイクロリットルの蒸留水を加え、2分間激しく渦を巻きます。20、800倍のGで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清の500マイクロリットルを取り、摂氏4度でGの10, 000倍で2時間、3キロダルトンの遠心フィルターを通してそれをろ過します。430マイクロリットルの超濾液をスピード真空で乾燥させ、サンプルを凍結します。キャピラリーをCESI装置に取り付ける前に、キャピラリーの入口と出口の端が無傷であること、およびキャピラリーに目に見える破損がないことを確認してください。次に、メーカーのガイドラインに従って、新しいニュートラルコード化されたキャピラリーを機器に挿入します。テキスト原稿に記載されている条件を使用して、分離キャピラリーを100ミリモルの塩酸で前方に洗い流し、次にBGEで、最後に蒸留水で洗い流します。次に、分離キャピラリーと導電性キャピラリーの両方をBGEでフラッシュし、続いて蒸留水、100ミリモル塩酸、再び蒸留水、最後にBGEでフラッシュします。ナノスプレーソースとアダプターを使用して、CESIをMSに結合します。タンパク質コロナ分析では、凍結乾燥したサンプルを pH 4 の 50 ミリモル酢酸アンモニウム 20 マイクロリットルに再懸濁します。テキスト原稿に記載されているサンプルのCESI-MS分析を実行します。250 から 2, 000 m/z までの質量スペクトルデータを収集し、上位 10 個のデータ依存性フラグメンテーション取得を行い、サンプル間のキャピラリーをすすぎます。新しい裸の溶融シリカキャピラリーをCESI装置に挿入します。100%メタノールを使用して分離キャピラリーを前方にフラッシュし、次に分離キャピラリーと導電性キャピラリーの両方をBGEでフラッシュして、出口端に液滴が形成されるようにします。次に、キャピラリーを蒸留水で洗い流し、続いて0.1モルの水酸化ナトリウム、再び蒸留水、最後にBGEで洗い流します。ナノスプレーソースとアダプターを使用して、CESIをSEMSに結合します。代謝物コロナ分析を行うには、ナノマテリアルの曝露および非曝露のプラズマサンプルを430マイクロリットルの蒸留水に再懸濁し、2分間激しくボルテックスします。0.1マイクロメートルのメンブレンフィルターでサンプルをろ過します。本文原稿に記載されているように、5マイクロリットルの内部標準を95マイクロリットルの濾液に加え、激しく渦巻かせます。16、Gの100倍、摂氏4度で遠心分離します。テキスト原稿に記載されているサンプルのCESI-MS分析を実行します。プロテオミクスおよびメタボロームの分離と検出にCESI-MSを使用すると、各アプローチで両方のキャピラリーで良好な分離ウィンドウが示され、生体分子コロナの包括的な特性評価が可能になります。プロテオミクスCESI-MS法は、広範囲のナノ材料組成にわたって、コロナ中のタンパク質の配列とタンパク質濃度を区別することができ、各ナノ材料に固有のタンパク質コロナを区別することができます。このCESI-MSメタボロミクスアプローチにより、代謝物コロナの定量分析が可能になり、そのユニークなフィンガープリントを明らかにするために使用できます。このアプローチは、ナノ物質の代謝物コロナを受動的に特徴付けていますが、異性体の吸収差など、生体分子コロナにおける代謝物の役割に関する興味深い洞察を明らかにすることができます。この技術により、タンパク質と代謝物コロナの両方を特徴づけることが可能になり、完全な生体分子コロナが細胞によるナノマテリアルの取り込みにどのように影響するかについての理解を深めることができます。

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Research

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Chemistry

化学

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この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

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選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

このプロトコルは、ナノ粒子上のパーソナライズされたタンパク質コロナプロファイリングのためのSDS-PAGE解析を標準化し、がん特異的シグネチャーの再現可能で拡張可能かつ低コストの検出を可能にします。膵管腺癌の早期診断を目的としており、研究および臨床の両面で複雑なプロテオム手法に代わる実用的でREASSUREDに準拠した代替手段を提供します。...

早期がん検出におけるパーソナライズされたタンパク質コロナプロファイリングのための標準化されたSDS-PAGEワークフロー

学ぶ ナノ材料のタンパク質・代謝物コロナ解析法。キャピラリー電気泳動質量分析法（CESI-MS）を用いて、生体試料からのバイオマーカー検出とナノ材料表面の分子相互作用を高感度に評価する手法です。

ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

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