ナノ材料で獲得したタンパク質と代謝物コロナの特性解析のためのキャピラリー電気泳動質量分析法

このプロトコールは、タンパク質コロナだけでなく、ナノマテリアルの代謝物コロナの特性評価にもCESI-MSを実装した最初のプロトコルです。CESI は、従来の LCMS メソッドと相補的な分離を提供し、わずか数ナノリットルのサンプルを使用しながら、高い再現性と感度を兼ね備えています。まず、ヒト血漿の2ミリリットルを1ミリリットルのアリコートに分割し、1つは代謝物とタンパク質コロナ用、もう1つは血漿メタボロームの特性評価用です。

ヒト血漿中のナノマテリアル1ミリグラム/ミリグラムを摂氏37度で1時間インキュベートし、サーモミキサーで毎分500回転で穏やかに混合します。次に、4,000倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離することにより、ナノ材料をペレット化する。代謝物コロナ分析のために血漿上清を収集し、タンパク質コロナの特性評価のためにナノ材料タンパク質コロナ複合体を保持します。

ペレットを1ミリリットルの10X PBSバッファーに再懸濁し、2分間激しくボルテックスして未結合のタンパク質を除去します。溶液を4, 000倍Gで摂氏4度で15分間遠心分離し、ナノ材料をペレット化し、ペレットを乱さずに上清を慎重に除去します。ペレットを1ミリリットルのABCバッファーに再懸濁し、2分間激しくボルテックスして、未結合のタンパク質と未結合の塩を除去します。

遠心分離ステップを繰り返し、上清を捨てます。ペレットを10ミリモルジチオスレイトールを含む20マイクロリットルのABCバッファーに溶解して、タンパク質ジスルフィド結合を減らします。溶液を摂氏56度で30分間インキュベートします。

0.1%の界面活性剤を含むABC緩衝液の20マイクロリットルにシーケンシンググレードのトリプシンを2マイクログラム加え、消化液を摂氏37度で16時間インキュベートします。100ミリモルABCに20マイクロリットルの55ミリモルヨードアセトアミドを加えてサンプルをアルキル化し、室温で20分間インキュベートします。0.1モルの塩酸を20マイクロリットル加えて界面活性剤を切断し、サンプルを室温で10分間放置します。

本文原稿に記載されているように、C18充填脱塩ピペットチップを使用してペプチドを濃縮および脱塩します。その後、サンプルを凍結乾燥し、分析まで摂氏マイナス20度で保存します。ナノ材料プラズマインキュベーションからコントロールプラズマと上清を取り出し、氷上に置きます。

各サンプルから50マイクロリットルを別々のバイアルに分注し、蒸留水で10倍に希釈します。ボルテックス後、この希釈したサンプルの50マイクロリットルを新しいバイアルに移します。200マイクロリットルのクロロホルム、250マイクロリットルのメタノール、350マイクロリットルの蒸留水を加え、2分間激しく渦

20、800倍のGで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清の500マイクロリットルを取り、摂氏4度でGの10, 000倍で2時間、3キロダルトンの遠心フィルターを通してそれをろ過します。430マイクロリットルの超濾液をスピード真空で乾燥させ、サンプルを凍結します。

キャピラリーをCESI装置に取り付ける前に、キャピラリーの入口と出口の端が無傷であること、およびキャピラリーに目に見える破損がないことを確認してください。次に、メーカーのガイドラインに従って、新しいニュートラルコード化されたキャピラリーを機器に挿入します。テキスト原稿に記載されている条件を使用して、分離キャピラリーを100ミリモルの塩酸で前方に洗い流し、次にBGEで、最後に蒸留水で洗い流します。

次に、分離キャピラリーと導電性キャピラリーの両方をBGEでフラッシュし、続いて蒸留水、100ミリモル塩酸、再び蒸留水、最後にBGEでフラッシュします。ナノスプレーソースとアダプターを使用して、CESIをMSに結合します。タンパク質コロナ分析では、凍結乾燥したサンプルを pH 4 の 50 ミリモル酢酸アンモニウム 20 マイクロリットルに再懸濁します。

テキスト原稿に記載されているサンプルのCESI-MS分析を実行します。250 から 2, 000 m/z までの質量スペクトルデータを収集し、上位 10 個のデータ依存性フラグメンテーション取得を行い、サンプル間のキャピラリーをすすぎます。新しい裸の溶融シリカキャピラリーをCESI装置に挿入します。

100%メタノールを使用して分離キャピラリーを前方にフラッシュし、次に分離キャピラリーと導電性キャピラリーの両方をBGEでフラッシュして、出口端に液滴が形成されるようにします。次に、キャピラリーを蒸留水で洗い流し、続いて0.1モルの水酸化ナトリウム、再び蒸留水、最後にBGEで洗い流します。ナノスプレーソースとアダプターを使用して、CESIをSEMSに結合します。

代謝物コロナ分析を行うには、ナノマテリアルの曝露および非曝露のプラズマサンプルを430マイクロリットルの蒸留水に再懸濁し、2分間激しくボルテックスします。0.1マイクロメートルのメンブレンフィルターでサンプルをろ過します。本文原稿に記載されているように、5マイクロリットルの内部標準を95マイクロリットルの濾液に加え、激しく渦

16、Gの100倍、摂氏4度で遠心分離します。テキスト原稿に記載されているサンプルのCESI-MS分析を実行します。プロテオミクスおよびメタボロームの分離と検出にCESI-MSを使用すると、各アプローチで両方のキャピラリーで良好な分離ウィンドウが示され、生体分子コロナの包括的な特性評価が可能になります。

プロテオミクスCESI-MS法は、広範囲のナノ材料組成にわたって、コロナ中のタンパク質の配列とタンパク質濃度を区別することができ、各ナノ材料に固有のタンパク質コロナを区別することができます。このCESI-MSメタボロミクスアプローチにより、代謝物コロナの定量分析が可能になり、そのユニークなフィンガープリントを明らかにするために使用できます。このアプローチは、ナノ物質の代謝物コロナを受動的に特徴付けていますが、異性体の吸収差など、生体分子コロナにおける代謝物の役割に関する興味深い洞察を明らかにすることができます。

この技術により、タンパク質と代謝物コロナの両方を特徴づけることが可能になり、完全な生体分子コロナが細胞によるナノマテリアルの取り込みにどのように影響するかについての理解を深めることができます。