Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Summary

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Abstract

We beschrijven een methode voor het bereiden van de hersenen infiltreren leukocyten (Bils) van muizen. Laten we zien hoe aan muizen infecteren met murine encephalomyelitis Theiler's virus (TMEV) via een snelle intracraniële injectie techniek en hoe je een leukocyten-verrijkte populatie van infiltrerende cellen uit hele brein te zuiveren. Kortom, muizen zijn verdoofd met isofluraan in een gesloten kamer en zijn de vrije hand ingespoten met een Hamilton spuit in de frontale cortex. Muizen worden dan gedood op verschillende tijdstippen na infectie door isofluraan een overdosis en de hele hersenen worden geëxtraheerd en gehomogeniseerd in RPMI met een tissue Tenbroeck slijpmachine. Hersenhomogenaten worden gecentrifugeerd door middel van een continu 30% Percoll helling aan de myeline en de andere cel vuil te verwijderen. De celsuspensie wordt vervolgens gespannen op 40 um, gewassen en gecentrifugeerd op een discontinue Ficoll-Paque Plus gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten. De leukocyten worden vervolgens gewassen en geresuspendeerd in de juiste buffers voor immunofenotypering door flowcytometrie. Flowcytometrie onthult een populatie van aangeboren immuuncellen in de vroege stadia van de infectie in C57BL / 6 muizen. Na 24 uur na infectie, meerdere subsets van immuuncellen aanwezig zijn in de Bils, met een verrijkte bevolking van Gr1 ^+, CD11b ⁺ en F4/80 ⁺ cellen. Daarom is deze methode is handig in het karakteriseren van de immuunrespons tegen acute infectie in de hersenen.

Protocol

1. Intracraniële virus injectie:

De volgende techniek is aangepast en uitgebreid gebruikt door ons lab en collega's. In het kort, intracraniële injectie van de stam Daniel's van muizen encefalomyelitis Theiler's virus (TMEV) of sham-infectie (1, 10) wordt uitgevoerd op jonge muizen (bij voorkeur 5-6 weken oud) naar de hersenen infiltreert leukocyten (Bils) te lokken. Houdt u er rekening mee dat resultaten zullen verschillen tussen de stam van de Daniel, de Bean stam, en de GDVII stam. Voor de toepassing van de oogst Bils, muizen krijgen 2x10 ⁵ PFU van TMEV en geïnfecteerd zijn voor 24 uur.

1. Bevestig de injectienaald (27 gauge, ¼ in, Kendall), om een ​​automatische 1 ml Hamilton spuit en ingesteld op 10 ul van het virus te leveren.
2. Het opstellen van TMEV in 10 pi DMEM in de spuit met zorgvuldige aandacht voor luchtbellen. Indien nodig, sham geïnfecteerde muizen ontvangen 10 ul van virus-vrij DMEM.
3. Net voor injectie, giet ongeveer 1 mL van isofluraan in een stolp die een draadrooster met katoenen ondergrond eronder bevat.
4. Plaats muizen direclty op draadrooster in de glazen stolp tot ze licht verdoofd, ongevoelig voor teen-knijpen en geïmmobiliseerd door de inhalatie-anesthesie, ongeveer 10-15 seconden. Muizen mag niet in direct contact komen met isofluraan, zoals stof kan irriterend zijn en bijtende.
5. Terwijl onder narcose, voor te bereiden muizen voor injectie door snel te zoeken naar de juiste coördinaten in de frontale cortex regio op de schedel met scheren en inkten. De algemene locatie voor injectie is 1 mm anterior tot bregma en 1 mm lateraal van de pijlnaad aan de rechterkant (figuur 1). Terwijl de stereotactische injectie kan geschikt zijn voor sommige experimentele situaties, hebben we ontdekt dat de vrije hand injectie zonder scheren of inkt is geschikt voor het merendeel van de experimenten. Afscheid van de vacht met de naald punt langs beide assen geschikt is voor injectie.
6. Om een ​​injectie te maken, richt u de naald loodrecht op de schedel en druk op door het bot tot ongeveer een 3 mm diepte.
7. Express virus in de hersenen door te drukken op de Hamilton spuit knop ingedrukt en wacht 2 seconden voor het virus naar de hersenen in te voeren voordat trekken.
8. Verwijder voorzichtig de naald en leg de muis in een schone, droge kooi. Muizen ontwaken uit narcose en snel weer de normale functie binnen enkele minuten. Geef de juiste aandacht voor muizen die abnormale symptomen vertonen, zoals overmatig bloeden uit de injectieplaats, zoals euthanasie van het dier kan worden geschikt. De juiste dieren omgaan ⁶ en naleving van de National Institutes of Health en institutionele Dierverzorging en gebruik Comite richtlijnen moeten worden gevolgd.

2. Brain-infiltrerende leukocyten celpreparaat:

1. Bereid ronde bodem Oak Ridge centrifugebuizen met een capaciteit van 30 ml kan bevatten met 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll en 1 ml 10X PBS en buizen moeten bij RT zitten op de bank tijdens de hersenen verwijderen proces.
2. Breng Ficoll-Paque Plus op kamertemperatuur (RT).
3. Euthanaseren van dieren door de gewijzigde isofluraan overdosis ⁵ en snel te verwijderen van de hersenen met behulp van een roestvrij stalen weefsel spatel en plaats in een 15 ml conische buis met 5 ml RPMI op ijs. Onder bepaalde omstandigheden kan PBS-perfusie geschikt zijn om te verwijderen circulerende perifere bloedcellen van de Bils voorbereiding. Muizen moeten volledig en correct verdoofd voorafgaand aan de PBS-perfusie.
4. Overdracht hersenen en RPMI oplossing voor een 7 ml glazen Pyrex merk Tenbroeck weefsel molen en voorzichtig homogeniseren met 10-15 slagen.
5. Pipet een extra 5 ml RPMI in de homogenisator en pipet op en neer tweemaal. Transfer hersenhomogenaat (ca. 10 ml) aan eerder bereid ronde bodem buis en voorzichtig omkeren 2-3 keer om te mengen.
6. Spin hersenhomogenaat op 7800g _ave gedurende 30 min bij RT in een F0360 met vaste hoek rotor in een Beekman Allegra X-22R klinische centrifuge.
7. Na het centrifugeren, verwijder myeline puin dat heeft gedreven naar de top van het verloop. Verzamel de leukocyten laag die zweeft boven de rode bloedcellen pellet (figuur 2).
8. Zeef leukocyten laag door een 40 um cel zeef in een 50 ml conische. Breng de oplossing tot 50 ml volume met RMPI.
9. Spin tubes met verdunde celsuspensie in een klinische centrifuge bij 1500 rpm (600g _ave) gedurende 5 min bij RT.
10. Zuig het supernatant en het verzamelen van de cel pellet. Resuspendeer de pellet in 1 ml FACS buffer (1% bovine serum albumine, 0,02% natriumazide aan calcium en magnesium-vrij PBS) en breng de celsuspensie tot 5 ml met ronde bodem FACS buizen.
11. Zorgvuldig onderlaag ophanging met 1 ml Ficoll-Paque Plus.
12. Spin buis bij 2500 toeren per minuut (1400 gaf) in de klinische centrifuge gedurende 25 min bij RT zonder rem.
13. Verwijder de witte, pluizige laag op de interface (figuur 2) met 1 ml pipet en transfer naar het nieuwe 5 ml FACS buis. Was cel met 4 ml FACS buffer.
14. Spin buis bij 1500 tpm (600 g _ave) gedurende 5 min bij RT in de klinische centrifuge tot pellet cellen.
15. Aspireren supernatant en het verzamelen van celpellet. Resuspendeer de leukocyten pellet in de juiste buffer en te houden op het ijs in nieuwe FACS buis.
16. Tellen cellen, te beoordelen levensvatbaarheid van de cellen door trypan blauw uitsluiting en analyseren flowcytometrie. In het algemeen kunnen de onderzoekers verwachten dat ongeveer 5 x 10 ⁵ cellen / dier te verwerven.

3. Flowcytometrische immunofenotypering

1. Na het isoleren en tellen van de leukocyten, draai de cellen gedurende 3 minuten bij 1500 rpm (600 _gaf) in een klinische centrifuge.
2. Resuspendeer de pellet in het blokkeren van buffer met het volgende: FACS buffer, supernatans van 2.4G2 hybridoma (Fc blokkeren; anti-CD16/32) en foetaal runderserum in een verhouding van 10:05:01 en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C .
3. Voor te bereiden en voeg geconjugeerde antilichamen tegen het extracellulaire antigenen om de geblokkeerde cellen in een concentratie van 1:200 en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. Vlek en incubeer cellen in 200 pl in een 96-wells V-bodemplaat. Passende controles zijn ongekleurd cellen en fluorochroom schadevergoeding monsters, als dat nodig is.
4. Spin de gekleurde cellen bij RT gedurende 3 minuten bij 1500 rpm (600 _gaf) in een klinische centrifuge met behulp van een rotor geschikt voor 96-wells platen.
5. Zuig het supernatant en was de cellen met 200 ul FACS buffer door zachtjes en neer te pipetteren 3 keer.
6. Twee keer herhaalt u de bovenstaande was-techniek.
7. Na het wassen, resuspendeer de cellen in 2% paraformaldehyde en transfer naar FACS buizen. Fixatie is nodig voor flowcytometrische analyse van cellen geïnfecteerd Bioveiligheid Level 2 reagentia.
8. Voer de vaste cellen op een BD FACS Calibur na een aangepaste flow cytometrie methode ⁸ en analyseren van bestanden offline met behulp van FlowJo, WinMDI of andere beschikbare flowcytometrie-analyse software.
9. De analyse van 50-100,000 gebeurtenissen per monster is over het algemeen nodig voor een adequate immunofenotypering.

Direct geconjugeerde antilichamen gebruikt in dit experiment:

CD45 werd gedetecteerd met kloon 30-F11. Ly6C / G werd gedetecteerd met kloon Gr1, RB6-8C5. CD11b werd gedetecteerd met kloon M1/70. F4/80 werd gedetecteerd met kloon BM8.

4. Representatieve resultaten:

We tonen cel fenotyperen resultaten voor muis Bils 24 uur na infectie (figuur 3). Leukocyten werden gekleurd met PerCP-geconjugeerd anti-muis-CD45 om het immuunsysteem cellen te detecteren, PE-geconjugeerd anti-muis Ly6C / G om inflammatoire monocyten, APC-geconjugeerd anti-muis-CD11b en APC-geconjugeerd anti-muis F4/80 te detecteren om cellen te detecteren van monocyten afstamming. De analyse werd uitgevoerd met een BD FACS Calibur instrument.

Figuur 1. Anatomische lokalisatie van de plaats van injectie. De plaats van de injectie ligt 1 mm anterior tot bregma en 1 mm lateraal van de pijlnaad aan de rechterkant.

Figuur 2. Illustratie van de gradiënt scheiding van leukocyten en Bils. Leukocyten worden in eerste instantie, die rechtstreeks onder de myeline laag puin en boven de RBC pellet in de Percoll verloop. De witte, pluizige laag (Bils) op de interface is verzameld uit de Ficoll verloop.

Figuur 3. Immunofenotype van de hersenen-infilatrating leukocyten op 24 uur na infectie. Mouse leukocyten werden geïsoleerd uit de hersenen door differentiële centrifugatie dichtheid van weefsel homogenaten bereid uit dieren in 24 uur na intracraniële infectie. Cellen werden gekleurd met fluorescent-geconjugeerde antilichamen tegen muis CD45, Ly6C / G, CD11b, en F4/80. Eerste gating werd uitgevoerd door het plotten van CD45, een marker voor immuuncellen, tegen voorwaartse verstrooiing (FSC), een indicator van de celgrootte (C). De CD45 ^hi (A, D), CD45 ^lo (B, E), en CD45 ^neg (F, G) populaties werden vervolgens geanalyseerd voor relatieve expressie niveaus van de monocyten en macrofagen markers Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), en CD11b (D, E, G). Ly6C / G ^{+ +} F4/80 CD11b ⁺ inflammatoire monocyten werden bijna uitsluitend in de CD45 ^hi bevolking (A, D), in overeenstemming met de infiltratie van deze cellen uit de periferie. Daarentegen werden Ly6C/G-F4/80 ^lo CD11b ⁺ macrofagen bijna uitsluitend te vinden in de CD45 ^lo (B, E) en CD45 ^neg (G) populaties, in overeenstemming met een inwoner fenotype. In tal van experimenten, hebben we nooit gezien CD45 ^hi cellen of Ly6C / G ^{+ +} F4/80 CD11b ⁺ inflammatoire monocyten in de hersenen van niet-geïnfecteerde of sham-infectiesTed muizen (gegevens niet getoond).

Discussion

We routinematig gebruik van flowcytometrie om zowel de kwaliteit van de hersenen infiltreren celpreparaat te bepalen, en om verschillende populaties van immuuncellen ^{2, 9} onderscheiden. Bij acute time-punten, onze Bils methode levert hoge percentages van inflammatoire monocyten binnen de CD45hi bevolking, evenals hoge percentages van macrofagen in de CD45lo bevolking. Dit geeft aan dat een reproduceerbare immuunrespons in de hersenen robuust kan worden gekenmerkt door onze methode.

Deze techniek is vooral van belang voor experimenten die een goed gekarakteriseerde populatie van de immuuncellen van de muis hersenen nodig hebben. We hebben eerder uitgevoerde experimenten adoptieve overdracht door het injecteren van onze hersenen infiltreren leukocyten in muizen gastheer via staartader injectie ^7, en we hebben gekenmerkt de Bils via verschillende in vitro experimenten ^9. Onze Bils voorbereiding is bijzonder nuttig in experimenten die moeten onderscheiden verschillende populaties van immuuncellen tussen een ingezetene en cellen van de hersenen, waaronder inwoner macrofagen en microglia. Een andere toepassing van belang bevat real-time RT-PCR-analyse uitgevoerd op totaal RNA geïsoleerd van Bils op 7 dagen na infectie te identificeren effectorfuncties ^3. We bijvoorbeeld meten GAPDH, granzyme B en perforine RNA in Bils verzameld op zeven dagen na infectie van perforine-bekwame en-deficiënte dieren die besmet zijn met TMEV. We hebben ook gebruikt onze Bils methode om te bepalen hoe NKG2D bijdraagt ​​aan de clearing TMEV uit het brein van acuut geïnfecteerde muizen ^4.

Er zijn verschillende kritische aspecten van de methode. Het is essentieel om alle oplossingen op kamertemperatuur worden voorafgaand aan de voorbereiding op onnodige stress te vermijden op de leukocyten en om een ​​goede densitometrische scheiding te waarborgen. Stress op de leukocyten bijdraagt ​​aan celdood, waardoor ze bijzonder onbetrouwbaar voor in vivo experimenten waarbij een live populatie van cellen adoptief wordt overgebracht in een gastheer dier. We hebben ook vastgesteld dat het gebruik van koude Percoll niet alleen de dichtheid van de discontinue gradiënt veranderingen, maar ook van invloed op de kwaliteit van de leukocyten. Een ander cruciaal element is voldoende en zacht homogenisering van hersenweefsel. Wij hebben geconstateerd dat onvoldoende en ruwe homogenisering van hersenweefsel resulteert in grote hoeveelheden celresten gezien door microscopie en flowcytometrie. Celresten kan ook het gevolg zijn van overbelasting niet de hersenhomogenaat met de juiste maat cel zeef. De juiste aandacht voor detail is de sleutel bij de voorbereiding voldoende en voldoende Bils voor verdere experimenten en analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TMEV	Howe Lab	N/A
Daniel’s strain	Invitrogen	21063-029
isoflurane	Novaplus	NDC 0409-3292-49
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes	Nalge Nunc international	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02
10X PBS	Roche Group	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Trypan Blue 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
15 ml conical tubes	BD Biosciences	352097
7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder	Fisher Scientific	08-414-10B
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
50 mL conical	BD Biosciences	352070
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647
sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
FACS tubes	BD Biosciences	352054
fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F4135
2.4G2 hybridoma	ATCC	HB-197
Costar V-bottom plate	Corning	3894
Allegra X-22R centrifuge or equivalent	Beckman Coulter Inc.	N/A
96-well plate bucket and rotor	Beckman Coulter Inc.	S2096
Fixed-angle rotor	Beckman Coulter Inc.	F0360
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD Biosciences	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD Biosciences	557235	clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD Biosciences	553128	clone: RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	clone: M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	clone: BM8