Summary
एक तेजी से विधि murine मस्तिष्क से घुसपैठ leukocytes प्राप्त वर्णित है. इस पद्धति का इस्तेमाल एक सतत Percoll ढाल और असंतत Ficoll का चयन करने के लिए और ढाल परत ल्युकोसैट समृद्ध शुद्ध. पृथक leukocytes तो प्रवाह cytometric माप द्वारा विशेषता जा सकता है.
Abstract
हम चूहों से मस्तिष्क घुसपैठ leukocytes (BILs) की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन. हम प्रदर्शन कैसे एक तेजी से intracranial इंजेक्शन तकनीक और कैसे पूरे दिमाग से घुसपैठ कोशिकाओं की ल्युकोसैट समृद्ध आबादी को शुद्ध के माध्यम से Theiler murine Encephalomyelitis वायरस (TMEV) के साथ चूहों को संक्रमित करने के लिए. संक्षेप में, चूहों के साथ एक कक्ष में बंद कर दिया isoflurane anesthetized हैं और मुक्त हाथ ललाट प्रांतस्था में एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ अंतःक्षिप्त. चूहे तो isoflurane अधिक मात्रा और पूरे दिमाग से संक्रमण के बाद विभिन्न समय पर मारे गए हैं और निकाले homogenized RPMI में एक Tenbroeck ऊतक बनाने की मशीन के साथ. ब्रेन homogenates एक सतत 30% Percoll ढाल के माध्यम से centrifuged माइलिन और अन्य सेल मलबे को हटाने के. सेल निलंबन 40 सुक्ष्ममापी में फिर तनावपूर्ण है, धोया और एक असंतत ढाल Ficoll Paque प्लस पर centrifuged leukocytes का चयन करने के लिए और शुद्ध. leukocytes और फिर धो रहे हैं प्रवाह cytometry द्वारा immunophenotyping के लिए उपयुक्त बफ़र्स में resuspended. प्रवाह cytometry C57BL 6 / चूहों में संक्रमण के प्रारंभिक चरणों में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आबादी का पता चलता है. 24 घंटे के बाद संक्रमण से कम, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई सबसेट BILs में मौजूद GR1 +, CD11b + और F4/80 + कोशिकाओं के एक समृद्ध आबादी के साथ, कर रहे हैं. इसलिए, इस विधि मस्तिष्क में तीव्र संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निस्र्पक में उपयोगी है.
Protocol
1. Intracranial वायरस इंजेक्शन:
निम्नलिखित तकनीक को संशोधित किया गया है और हमारी प्रयोगशाला और उनके सहयोगियों द्वारा बड़े पैमाने पर उपयोग. संक्षेप में, Theiler murine Encephalomyelitis (TMEV) वायरस या नकली संक्रमण के डैनियल तनाव का intracranial इंजेक्शन (1, 10) युवा चूहों (अधिमानतः उम्र के 5-6 सप्ताह) पर किया जाता है मस्तिष्क घुसपैठ leukocytes (BILs) प्रकाश में लाना. कृपया ध्यान दें कि परिणाम डैनियल तनाव, बीन तनाव, और GDVII तनाव के बीच अलग होगा. BILs कटाई के प्रयोजन के लिए, चूहों 2x10 TMEV के 5 Pfu प्राप्त और 24 घंटे के लिए संक्रमित कर रहे हैं.
- इंजेक्शन सुई संलग्न (27 गेज, ¼ में, केंडल), एक स्वत: 1 मिलीलीटर हैमिल्टन सिरिंज और वायरस के 10 μl देने के लिए सेट.
- हवाई बुलबुले के लिए सावधान ध्यान के साथ सिरिंज में TMEV ड्रा 10 μL DMEM में. जब उचित हो, नकली संक्रमित चूहों वायरस मुक्त DMEM 10 μl प्राप्त करते हैं.
- बस पहले इंजेक्शन के लिए एक घंटी जार है कि कपास के नीचे सब्सट्रेट के साथ एक तार ग्रिड शामिल में isoflurane के लगभग 1 एमएल डालना.
- घंटी जार में तार ग्रिड पर प्लेस चूहों direclty है जब तक वे हल्के anesthetized हो जाते हैं, पैर के अंगूठे चुटकी असंवेदनशील और inhalant चतनाशून्य करनेवाली औषधि द्वारा immobilized, लगभग 10-15 सेकंड. चूहे isoflurane के साथ सीधे संपर्क में नहीं आते हैं, के रूप में परेशान और कास्टिक पदार्थ किया जा सकता है चाहिए.
- संज्ञाहरण के तहत हालांकि, जल्दी पता लगाने का उपयोग कर हजामत बनाने का काम और भनक खोपड़ी पर ललाट प्रांतस्था क्षेत्र में उपयुक्त निर्देशांक द्वारा इंजेक्शन के लिए चूहों को तैयार हैं. इंजेक्शन के लिए सामान्य स्थान 1 bregma के लिए पूर्वकाल मिमी और 1 मिमी सही पक्ष पर बाण के समान सिवनी (चित्रा 1) के लिए पार्श्व है. जबकि stereotactic इंजेक्शन कुछ प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए उपयुक्त हो सकता है, हमने पाया है कि मुक्त हाथ हजामत बनाने का काम या भनक बिना इंजेक्शन प्रयोगों के बहुमत के लिए उपयुक्त है. दोनों axes साथ सुई बिंदु के साथ फर बिदाई इंजेक्शन के लिए उपयुक्त है.
- एक इंजेक्शन बनाने, पूरबी खोपड़ी और हड्डी के माध्यम से लगभग एक 3 मिमी गहराई के लिए प्रेस करने के लिए सुई सीधा.
- हैमिल्टन सिरिंज बटन दबाने नीचे और वायरस के लिए 2 सेकंड प्रतीक्षा वापस लेने से पहले मस्तिष्क में प्रवेश करके एक्सप्रेस मस्तिष्क में वायरस.
- ध्यान सुई को हटाने और एक साफ, सूखे पिंजरे में माउस जगह है. चूहे संज्ञाहरण से जल्दी से जगाने और मिनट के भीतर सामान्य समारोह को फिर से शुरू. चूहों कि असामान्य लक्षण एक्ज़िबिट, इंजेक्शन साइट से अत्यधिक रक्तस्राव के रूप में जानवर के इच्छामृत्यु के रूप में करने के लिए समुचित ध्यान देना उचित हो सकता है. उचित स्वास्थ्य और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए 6 और पालन से निपटने जानवर पीछा किया जाना चाहिए .
2. मस्तिष्क - घुसपैठ ल्युकोसैट सेल तैयारी:
- दौर नीचे ओक रिज अपकेंद्रित्र ट्यूबों जो 10 मिलीलीटर 1640 RPMI, 9 मिलीलीटर Percoll और 1 मिलीलीटर 10X पीबीएस और ट्यूबों आरटी पर मस्तिष्क को हटाने की प्रक्रिया के दौरान बेंच पर बैठना चाहिए के साथ 30 मिलीलीटर की क्षमता को पकड़ कर सकते हैं तैयार.
- कमरे के तापमान (आर टी) Ficoll Paque प्लस लाओ.
- संशोधित isoflurane 5 अधिक मात्रा द्वारा पशु euthanize और जल्दी से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार बर्फ पर 5 मिलीलीटर RPMI युक्त ट्यूब में एक स्टेनलेस स्टील ऊतक रंग और जगह का उपयोग कर मस्तिष्क को हटाने . कुछ परिस्थितियों के तहत, Pbs छिड़काव BILs तैयारी से परिधीय रक्त कोशिकाओं परिसंचारी हटा दें करने के लिए उपयुक्त हो सकता है. चूहे पूरी तरह से और ठीक से पहले PBS-छिड़काव anesthetized होना चाहिए.
- मस्तिष्क और एक 7 मिलीलीटर कांच Pyrex ब्रांड Tenbroeck ऊतक बनाने की मशीन के लिए RPMI समाधान स्थानांतरण और धीरे 10-15 स्ट्रोक के साथ homogenize.
- Homogenizer और ऊपर और नीचे दो बार pipet में एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर RPMI Pipet. स्थानांतरण मस्तिष्क (लगभग 10 मिलीलीटर) homogenate पहले तैयार दौर नीचे ट्यूब और धीरे पलटना 2-3 बार मिश्रण करने के लिए.
- 7800g एवेन्यू पर F0360 एक Beckman Allegra X-22R नैदानिक अपकेंद्रित्र में निर्धारित कोण रोटर में आरटी पर 30 मिनट के लिए मस्तिष्क homogenate स्पिन.
- Centrifugation के बाद, myelin मलबे कि ढाल के शीर्ष करने के लिए जारी है हटा दें. ल्युकोसैट परत है कि लाल रक्त कोशिका गोली (चित्रा 2) से ऊपर तैरता लीजिए.
- एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में ल्युकोसैट परत तनाव. समाधान RMPI साथ 50 मिलीलीटर मात्रा को ऊपर लाओ.
- स्पिन ट्यूबों आरटी पर 5 मिनट के लिए एक 1500 rpm (600g एवेन्यू) में नैदानिक अपकेंद्रित्र में पतला सेल निलंबन युक्त.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और सेल गोली इकट्ठा. Resuspend गोली (1% गोजातीय सीरम albumin, कैल्शियम में 0.02% सोडियम azide और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस) के 1 मिलीलीटर FACS बफर में और 5 मिलीलीटर दौर नीचे FACS ट्यूबों सेल निलंबन हस्तांतरण.
- ध्यान से 1 मिलीलीटर Ficoll - Paque प्लस के साथ बुनियाद निलंबन.
- 2500 rpm (1400 दिया) पर कोई ब्रेक के साथ आरटी पर 25 मिनट के लिए नैदानिक अपकेंद्रित्र ट्यूब स्पिन.
- इंटरफ़ेस (चित्रा 2) में 1 मिलीलीटर विंदुक और नए 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब स्थानांतरण के साथ सफेद, शराबी परत निकालें. धो ग4 मिलीलीटर FACS बफर के साथ ells.
- गोली कोशिकाओं को चिकित्सीय अपकेंद्रित्र में आरटी पर 5 मिनट के लिए 1500 rpm (600g एवेन्यू) में ट्यूब स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और सेल गोली इकट्ठा. उपयुक्त बफर में ल्युकोसैट गोली Resuspend और नए FACS ट्यूब में बर्फ पर रखने.
- कोशिकाओं की गणना, Trypan नीले अपवर्जन द्वारा सेल व्यवहार्यता का आकलन और प्रवाह cytometry से विश्लेषण. सामान्य में, जांचकर्ताओं के लिए लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं / पशु के अधिग्रहण की उम्मीद कर सकते हैं.
3. प्रवाह cytometric immunophenotyping
- अलग और गिनती leukocytes के बाद, 3 मिनट के लिए एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में 1500 rpm (600 दिया) कोशिकाओं स्पिन .
- निम्नलिखित युक्त बफर अवरुद्ध में गोली Resuspend: FACS बफर, 2.4G2 (एफसी ब्लॉक; anti-CD16/32) हाइब्रिडोमा से सतह पर तैरनेवाला 10:05:01 के अनुपात में भ्रूण गोजातीय सीरम और 4 में 30 मिनट के लिए सेते ° सी .
- तैयार है और 30 मिनट के लिए अवरुद्ध 1:200 और सेते की एकाग्रता पर 4 ° कोशिकाओं सी के अंधेरे में कोशिकी प्रतिजनों के खिलाफ संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ने. दाग और एक 96 अच्छी तरह वी के नीचे की थाली में 200 μl में कोशिकाओं को सेते हैं. उपयुक्त नियंत्रण बेदाग कोशिकाओं और fluorochrome मुआवजा नमूने, के रूप में आवश्यक शामिल हैं.
- एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में 1500 (600 दिया) rpm 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए एक रोटर उपयुक्त का उपयोग कर पर 3 मिनट के लिए आरटी पर दाग कोशिकाओं स्पिन .
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 3 बार 200 μl FACS बफर के साथ कोशिकाओं धो लो.
- ऊपर धोने तकनीक में दो बार दोहराएँ.
- धोने के बाद, 2% paraformaldehyde और FACS ट्यूबों के लिए हस्तांतरण में कोशिकाओं resuspend. फिक्सेशन जैवसुरक्षा स्तर 2 अभिकर्मकों के संक्रमित कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए आवश्यक है.
- एक संशोधित प्रवाह cytometry 8 विधि के बाद एक बी.डी. FACS Calibur पर तय कोशिकाओं चलाएँ और ऑफ़लाइन FlowJo, WinMDI या अन्य उपलब्ध प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फ़ाइलों का विश्लेषण.
- नमूना प्रति 50-100,000 घटनाओं के विश्लेषण आम तौर पर पर्याप्त immunophenotyping के लिए आवश्यक है.
सीधे संयुग्मित इस प्रयोग में प्रयुक्त एंटीबॉडी:
CD45 क्लोन 30-F11 के साथ पाया गया. / Ly6C जी क्लोन GR1, RB6 8C5 के साथ पाया गया. CD11b M1/70 क्लोन के साथ पाया गया. F4/80 BM8 क्लोन के साथ पाया गया.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
हम 24 घंटे के पोस्ट संक्रमण (चित्रा 3) पर माउस BILs के लिए सेल phenotyping परिणाम बताते हैं. Leukocytes PerCP संयुग्मित विरोधी CD45 माउस के साथ दाग थे प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने, पीई संयुग्मित विरोधी माउस / Ly6C जी भड़काऊ monocytes, APC संयुग्मित विरोधी माउस CD11b और APC संयुग्मित विरोधी F4/80 माउस का पता लगाने के लिए करने के लिए कोशिकाओं का पता लगाने monocyte वंश की. विश्लेषण एक बी.डी. FACS Calibur साधन के साथ प्रदर्शन किया था.
चित्रा 1. इंजेक्शन साइट के संरचनात्मक स्थानीयकरण इंजेक्शन साइट 1 bregma के लिए पूर्वकाल मिमी और 1 मिमी सही पक्ष पर बाण के समान सीवन करने के लिए पार्श्व में स्थित है.
चित्रा 2. Leukocytes और BILs की ढाल जुदाई का चित्रण. Leukocytes शुरू माइलिन मलबे परत के नीचे सीधे और Percoll ढाल में आरबीसी गोली ऊपर एकत्र कर रहे हैं. सफेद, इंटरफेस में शराबी परत (BILs) Ficoll ढाल से एकत्र की है.
चित्रा 3. 24 घंटे बाद संक्रमण माउस. Leukocytes में मस्तिष्क infilatrating leukocytes के Immunophenotype मस्तिष्क से ऊतक जानवरों से intracranial संक्रमण के बाद 24 घंटे में तैयार homogenates अंतर घनत्व centrifugation द्वारा अलग किया गया . कक्ष CD45 माउस के खिलाफ fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग थे, Ly6C / जी, CD11b, और F4/80. प्रारंभिक gating CD45, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, आगे तितर बितर (FSC), सेल आकार (सी) का एक संकेतक के खिलाफ साजिश रचने के द्वारा प्रदर्शन किया गया था. CD45 हाय, (ए, डी) CD45 लो (बी, ई), और CD45 neg (एफ, जी) आबादी तो monocyte और बृहतभक्षककोशिका Ly6C / जी, F4/80 (ए, बी मार्करों के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर के लिए विश्लेषण किया गया एफ), और CD11b (डी, ई, जी). / Ly6C जी + F4/80 CD11b + + लगभग विशेष रूप से भड़काऊ monocytes हाय CD45 (ए, डी) जनसंख्या, परिधि से इन कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ संगत में पाया गया . इसके विपरीत, Ly6C/G-F4/80 लो CD11b + मैक्रोफेज लगभग विशेष रूप से CD45 (बी, ई) लो और CD45 (G) neg आबादी, एक निवासी phenotype के साथ संगत में पाए गए. कई प्रयोगों में, हम CD45 हाय कोशिकाओं या / Ly6C जी + F4/80 CD11b + + भड़काऊ monocytes असंक्रमित या नकली - infec के दिमाग में कभी नहीं देखा हैटेड चूहों (नहीं दिखाया डेटा है).
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Discussion
हम नियमित रूप से प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क सेल घुसपैठ की तैयारी के दोनों गुणवत्ता निर्धारित, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं 2, 9 के विभिन्न आबादी भेद. तीव्र - समय अंक में, हमारे BILs विधि CD45hi के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जनसंख्या CD45lo जनसंख्या में मैक्रोफेज के उच्च प्रतिशत के भीतर भड़काऊ monocytes के उच्च प्रतिशत पैदावार. यह इंगित करता है कि मस्तिष्क के भीतर एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया robustly हमारे विधि द्वारा विशेषता जा सकता है.
इस तकनीक प्रयोगों है कि माउस मस्तिष्क से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से विशेषता आबादी की आवश्यकता के लिए विशेष महत्व का है. हम पहले हमारे मस्तिष्क इंजेक्शन पूंछ नस 7 इंजेक्शन के माध्यम से मेजबान चूहों में leukocytes घुसपैठ द्वारा दत्तक हस्तांतरण प्रयोगों का प्रदर्शन किया, और हम माध्यम से इन विट्रो 9 प्रयोगों में विभिन्न BILs विशेषता है. हमारे BILs तैयारी प्रयोगों है कि मस्तिष्क के निवासी निवासी मैक्रोफेज और microglia सहित कोशिकाओं से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न आबादी अंतर करना चाहिए में विशेष रूप से लाभप्रद है. ब्याज की एक अन्य आवेदन वास्तविक समय RT-पीसीआर कुल 7 दिनों के बाद संक्रमण पर BILs से अलग effector कार्यों 3 पहचान शाही सेना पर प्रदर्शन विश्लेषण शामिल हैं . उदाहरण के लिए, हम perforin - सक्षम और कमी TMEV साथ संक्रमित पशुओं से 7 दिनों के बाद संक्रमण पर एकत्र BILs में GAPDH, granzyme बी और perforin आरएनए मापा. हम भी हमारे BILs विधि का उपयोग किया है यह निर्धारित करने के लिए कैसे NKG2D तीव्रता से संक्रमित 4 चूहों के मस्तिष्क से समाशोधन TMEV के लिए योगदान देता है .
विधि के कई महत्वपूर्ण पहलू हैं. यह आवश्यक है कमरे के तापमान पर सभी समाधान तैयारी से पहले लाने के लिए leukocytes के लिए अनुचित तनाव से बचने के लिए और उचित densitometric जुदाई सुनिश्चित है. Leukocytes पर तनाव कोशिका मृत्यु है, जो उन्हें विशेष रूप से जहां कक्षों की एक जीवित आबादी adoptively एक मेजबान जानवर में स्थानांतरित किया है vivo प्रयोगों के लिए अविश्वसनीय बनाता करने के लिए योगदान देता है. हम यह भी निर्धारित किया है कि ठंड Percoll का उपयोग न केवल असंतत ढाल के घनत्व में परिवर्तन, लेकिन यह भी leukocytes की गुणवत्ता को प्रभावित करता है. एक अन्य महत्वपूर्ण तत्व मस्तिष्क के ऊतकों की पर्याप्त और कोमल homogenization है. हमने पाया है कि सेल माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry द्वारा देखा मलबे के प्रचुर मात्रा में में मस्तिष्क के ऊतकों के परिणामों के अपर्याप्त और किसी न किसी homogenization. सेल मलबे भी उचित आकार सेल झरनी के साथ मस्तिष्क homogenate नहीं तनाव से परिणाम हो सकता है. विस्तार करने के लिए उचित ध्यान और अधिक प्रयोग और विश्लेषण के लिए पर्याप्त और पर्याप्त BILs की तैयारी में महत्वपूर्ण है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NINDS (CLH) से NS64571 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, मेयो क्लीनिक (CLH) से एक प्रारंभिक कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा, और डोनाल्ड और फ्रांसिस Herdrich (CLH) से एक उदार उपहार के द्वारा. हम सहायता के लिए मेयो क्लीनिक फ्लो Cytometry कोर धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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