Summary
murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.
Abstract
우리는 생쥐의 두뇌 침투 leukocytes (BILs)를 준비하는 방법을 설명합니다. 우리는 어떻게 뇌 전체에서 침투 세포 백혈구 - 풍부한 인구를 정화하기 위해 신속한 intracranial 분사 기술과를 통해 Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV)와 마우스를 감염하는 방법을 보여줍니다. 간단히 마우스는 닫힌 챔버에서 isoflurane과 anesthetized되며 전두엽 피질에 해밀턴 주사기로 주입 자유 손으로입니다. 생쥐는 다음 Tenbroeck 조직 분쇄기로 RPMI에서 추출하여 균질 아르 isoflurane 과다 복용과 전체 뇌 감염 후 여러 시대에서 살해되었습니다. 두뇌 homogenates은 myelin 및 기타 세포 파편을 제거하는 연속 30 % Percoll 기울기를 통해 centrifuged 수 있습니다. 세포 현탁액은 다음 40 μm의에서 긴장 세탁 및 leukocytes을 선택하고 정화하는 불연속 Ficoll - Paque 플러스 기울기에 centrifuged 있습니다. leukocytes 그런 다음 세탁 및 유동세포계측법에 의해 immunophenotyping에 적합한 버퍼에 resuspended 있습니다. 유동세포계측법가 C57BL / 6 생쥐에 감염의 초기 단계에 타고난 면역 세포의 인구를 보여줍니다. 24 시간 이후 감염에서 면역 세포의 여러 하위 집합은 Gr1 +, CD11b +와 F4/80 + 세포의 풍부한 인구와 BILs에 존재한다. 따라서,이 방법은 두뇌의 급성 감염에 대한 면역 반응을 특성화에 유용합니다.
Protocol
1. Intracranial 바이러스 주입 :
다음 기술은 수정 및 실험실 및 동료에 의해 광범위하게 활용되었습니다. 간단히, Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV) 또는 사기 - 감염의 다니엘의 변형의 intracranial 주입 (1, 10) 뇌 침투 leukocytes (BILs)를 이끌어내는 젊은 생쥐 (세 선호 5-6주)에 수행됩니다. 결과는 다니엘의 변형, 콩 변형 및 GDVII 스트레인 다를됩니다. BILs을 수확하기위한 목적으로, 생쥐는 TMEV의 2x10 5 PFU을 받고 24 시간 동안 감염됩니다.
- 자동 1 ML 해밀턴 주사기로 (27 게이지, ¼ 켄달에) 주입 바늘을 첨부 및 바이러스 10 μl를 제공하기 위해 설정할 수 있습니다.
- 공기 방울에 세심한주의와 주사기에 10 μL DMEM에 TMEV을 그립니다. 경우 적절한, 가짜 감염된 생쥐는 바이러스가없는 DMEM 10 μl를 받게됩니다.
- 직전 주사로, 아래 면화 기판과 전선 격자를 포함하는 벨 항아리에 isoflurane의 약 1 ML 잔.
- 발가락 - 핀치에 무심하고 흡입 마취에 의해 고정화 벨 병 속에 와이어 그리드에 자리 마우스 direclty들이 가볍게 anesthetized 될 때까지, 약 10~15초. 마우스는 물질이 자극 및 부식성 수 있듯이, isoflurane 직접 접촉해서는 안됩니다.
- 마취 동안 빠르게 면도 및 inking을 사용하여 두개골에있는 전두엽 피질 영역에 해당하는 좌표의 위치를하여 사출에 대한 생쥐를 준비합니다. 주사에 대한 일반적인 위치는 bregma에 앞쪽에 1mm과 오른쪽에있는 화살 봉합 (그림 1) 가로 1mm입니다. stereotactic 사출 일부 실험 상황에 맞게 수 있지만, 우리는 면도 또는 inking없이 무료로 직접 분사이 실험의 대부분에 적합한 것으로 나타났습니다. 두 축의 따라 바늘 지점과 모피 파팅 것은 사출에 적합합니다.
- 주사를 만들기 위해선, 동양 약 3mm 깊이로 뼈를 통해 두개골과 언론에 바늘 직각.
- 해밀턴 주사기 버튼을 눌러 철수하기 전에 두뇌를 입력 바이러스 2 초 대기하여 두뇌로 특급 바이러스.
- 조심스럽게 바늘을 제거하고 깨끗한, 마른 새장에 마우스를 놓으십시오. 마우스 신속하게 마취에서 각성과 분 이내에 정상 기능을 재개하십시오. 동물의 안락사로, 같은 주사 사이트에서 과도한 출혈로 이상 증상을 전시 마우스에 적절한 관심을주고하는 것은 적절한 수 있습니다. 건강과 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 지침 국립 연구소에 6 준수를 취급 적절한 동물을 따라야합니다.
2. 브레인 - 침투 백혈구 세포 준비 :
- 10 ML RPMI 1640, 9 ML Percoll 1 ML 10X PBS 및 튜브 두뇌 제거 프로세스 동안 벤치에서 RT에 앉아 있어야 30 ML의 용량을 저장할 수있는 왕복 하단의 오크 리지 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
- 실온 (RT)에 Ficoll - Paque 플러스 가져와.
- 수정 isoflurane 과다 5 동물을 안락사 빠르게 얼음 5 ML RPMI를 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 스테인레스 스틸 조직 주걱과 장소를 사용하여 두뇌를 제거합니다. 어떤 상황에서, PBS - 재관류는 BILs 준비에서 말초 혈액 세포를 순환 삭제하기위한 적절한 수 있습니다. 마우스 완전히 정상적으로 anesthetized 사전 PBS - 재관류하는 것입니다.
- 두뇌와 7 ML 유리 Pyrex 브랜드 Tenbroeck 조직 분쇄기로 RPMI 솔루션을 전송하고 부드럽게 10-15 스트로크와 균질.
- 균 질기와 두 pipet 위아래로 Pipet 추가 5 ML RPMI합니다. 전송 뇌 homogenate (약 10 ML) 이전에 준비 왕복 아래 튜브와 부드럽게 반전을 2-3 배 혼합합니다.
- 베크맨 알레 그라 X - 22R 임상 원심 분리기에서 F0360 고정 각도 로터의 RT 30 분 7,800그램 아베의 뇌 homogenate를 스핀.
- 원심 분리 후, 그라디언트의 꼭대기에 떠오르있다 myelin의 잔해를 제거합니다. 붉은 혈액 세포 펠릿 (그림 2) 위의 수레 백혈구 레이어를 수집합니다.
- 50 ML 원뿔로 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 백혈구 레이어를 스트레인. RMPI과 함께 50 ML 볼륨에 솔루션을 가져 오십시오.
- 스핀 튜브는 RT에서 5 분 1,500 RPM (600g 아베)에서 임상 원심 분리기에 희석 세포 현탁액을 포함.
- 뜨는을 기음과 세포 펠릿를 수집합니다. 1 ML 외과 버퍼의 펠릿 (1 % 소 혈청 알부민, 0.02 % 나트륨 칼슘 마그네슘 azide와 무료 PBS)를 Resuspend 5 ML 라운드 바텀 외과 튜브에 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다.
- 1 ML Ficoll - Paque 플러스와 함께 조심스럽게 밑받침 서스펜션.
- 없이 브레이크와 RT 25 분 임상 원심 분리기에서 2,500 RPM (1400 준)에서 튜브를 스핀.
- 1 ML의 피펫과 새로운 5 ML 외과 튜브로 전달 인터페이스 (그림 2)에서 하얀 솜털 레이어를 제거합니다. 와시 C4 ML 외과 버퍼와 엘스.
- 펠렛 세포로 임상 원심 분리기에서 RT에서 5 분 1,500 RPM (600g 아베)에서 튜브를 스핀.
- 뜨는을 기음과 세포 펠릿를 수집합니다. 적절한 버퍼에 백혈구 펠렛을 Resuspend하고 새로운 외과 튜브에 얼음 계속.
- Trypan 파랑 배제함으로써 세포 생존을 평가하고 유동세포계측법에 의해 분석, 세포를 계산합니다. 일반적으로, 조사는 약 5 × 10 5 세포 / 동물를 얻기 기대할 수 있습니다.
3. 흐름 cytometric immunophenotyping
- leukocytes을 분리하고 계산 후, 임상 원심 분리기에서 1,500 RPM (600 준)에서 3 분 동안 세포를 스핀.
- 다음 사항을 포함하는 버퍼를 차단에서 펠렛을 Resuspend : 2.4G2 하이 브리 도마 (FC 차단, anti-CD16/32)에서 뜨는 외과 버퍼, 그리고 10시 5분 1초의 비율로 태아 소 혈청과 4 30 분 품어 ° C .
- 준비하고 4 30 분 1:200과 부화의 농도에서 차단된 세포 ° 어둠 속에 C로 세포 항원에 대한 항체 복합을 추가합니다. 스테인과 96 잘 V - 하단 플레이트에 200 μl의 세포를 품어. 적절한 컨트롤이 필요한 흠없는 셀 및 fluorochrome 보상 샘플을 포함합니다.
- 96 - 웰 플레이트에 대한 적절한 로터를 사용하여 임상 원심 분리기에서 1,500 RPM (600 준) 3 분 RT에서 스테인드 세포를 스핀.
- 뜨는을 대기음 부드럽게 3 번 아래 pipetting과로 200 μl 외과 버퍼로 세포를 씻어.
- 두 번 이상 세척 기법을 반복합니다.
- 세척 후, 2 % paraformaldehyde와 외과 튜브로 전송에서 세포를 resuspend. 고정은 Biosafety 레벨 2 시약에 감염된 세포의 흐름 cytometric 분석을 위해 필요합니다.
- 수정된 유동세포계측법 방법 8 다음 BD 외과 Calibur에 고정 셀을 실행하고 오프라인 FlowJo, WinMDI 또는 기타 가능한 유동세포계측법 분석 소프트웨어를 사용하여 파일을 분석할 수 있습니다.
- 샘플 당 50-100,000 이벤트의 분석은 일반적으로 적절한 immunophenotyping 필요합니다.
본 실험에 사용되는 직접 복합 항체 :
CD45는 클론 30 F11과 함께 발견되었다. Ly6C / G는 복제 Gr1, RB6 - 8C5과 함께 발견되었다. CD11b는 클론 M1/70과 함께 발견되었다. F4/80는 클론 BM8과 함께 발견되었다.
4. 대표 결과 :
우리는 24 시간 이후 감염 (그림 3)에서 마우스 BILs에 대한 세포 phenotyping 결과를 보여줍니다. Leukocytes이 면역 세포를 감지하는 PerCP - 복합 방지 마우스 CD45 물들일 있었 PE - 복합 백신 마우스 Ly6C / G 세포를 감지하는 염증성 monocytes, APC - 복합 백신 마우스 CD11b와 APC - 복합 백신 마우스 F4/80를 검색하는 단핵구 혈통니다. 분석 BD 외과 Calibur 악기와 함께 연주했다.
그림 1. 사출 사이트의 해부 지방화. 사출 사이트 bregma에 앞쪽에 1mm과 오른쪽에있는 화살 치료 측면 1mm에 위치해 있습니다.
그림 2. leukocytes 및 BILs의 기울기 분리 일러스트. Leukocytes 처음에는 직접 myelin의 파편 층 아래와 Percoll 기울기에 RBC 펠렛 위의 수집하고 있습니다. 인터페이스에 하얀 솜털 층 (BILs)은 Ficoll 기울기로부터 수집됩니다.
그림 3. 24 시간 후 감염. 마우스 leukocytes에서 두뇌 infilatrating leukocytes의 Immunophenotype은 조직 intracranial 감염 후 24 시간에서 동물에서 준비 homogenates의 차동 밀도 원심 분리에 의해 두뇌에서 고립되었다. 세포는 마우스 CD45에 대한 찬란 - 복합 항체 물들일 있었 Ly6C / G, CD11b, 그리고 F4/80. 초기 게이팅는 앞으로 분산형 (FSC), 셀 크기 (C)의 지표에 대한 CD45, 면역 세포의 마커를하려 의해 수행되었다. CD45 안녕 (A, D), CD45 이오 (B, E) 및 CD45 neg (F, G) 인구는 다음 단핵구와 대식 세포 마커 Ly6C / G, F4/80 (A, B의 상대적인 표현 수준을 분석했다 , F) 및 CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + 염증 monocytes가 주변에서 이러한 세포의 침투와 일치 CD45 안녕 인구 (A, D)에 거의 독점적으로 발견되었습니다. 대조적으로, Ly6C/G-F4/80 이오 CD11b + macrophages은 CD45 이오 (B, E)와 CD45 neg (G) 주민 표현형과 일치 집단에 거의 독점적으로 발견되었습니다. 수많은 실험에서, 우리는 감염되지 않은 또는 사기 - infec의 두뇌에서 CD45 안녕 셀 또는 Ly6C / G + F4/80 + CD11b + 염증 monocytes을 관찰 적이 없다테드 마우스 (데이터가 표시되지 않음).
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Discussion
우리는 정기적으로 뇌 세포 침투 준비의 품질 모두를 결정하는 유동세포계측법를 사용하고, 면역 세포, 2, 9의 다른 인구를 구별합니다. 급성 시간 지점에서 우리 BILs 메서드는 CD45hi 인구뿐만 아니라 CD45lo 인구의 macrophages 높은 비율 이내에 염증 monocytes의 높은 비율을 산출. 이것은 두뇌 속에 재현할 면역 반응이 견고하게 우리의 방법을 특징으로 할 수 없음을 나타냅니다.
이 기술은 마우스의 두뇌에서 면역 세포를 잘 특징 인구를 필요로 실험을 위해 특히 중요하다. 우리는 이전에 꼬리 정맥 주사 7을 통해 호스트 마우스에 leukocytes에 침투해 우리의 두뇌를 주사하여 입양 전송 실험을 수행 있고, 우리는 체외 실험 9 여러 통해 BILs를 묘사했습니다. 우리 BILs 준비는 주민 macrophages과 microglia을 포함하여 두뇌의 거주 세포에서 면역 세포의 다양한 인구를 구별해야 실험에서 특히 유용합니다. 관심의 또 다른 응용 프로그램 이펙터 기능 - 3을 확인하기 위해 7 일 게시물 감염에 BILs에서 분리된 총 RNA에서 수행 실시간 RT - PCR 분석을 포함하고 있습니다. 예를 들어, 우리는 TMEV 감염된 perforin - 능력 및 결함 동물로부터 7 일 이후 감염에서 수집된 BILs에 GAPDH, granzyme B와 perforin RNA를 측정했습니다. 우리는 또한 NKG2D가 심하게 감염된 생쥐 4의 두뇌에서 지운 TMEV에 기여 방법을 결정하기 위해 BILs 방법을 이용했습니다.
방법 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 그것은 leukocytes에 과도한 스트레스를 피하기 위해 적절한 densitometric 분리 수 있도록 사전 준비에 상온에 대한 모든 솔루션을 가지고하는 것이 필수적입니다. leukocytes에 대한 스트레스는 세포의 살아있는 인구가 adoptively 호스트 동물로 전송됩니다 생체내 실험에 대해 그들이 특히 신뢰할 만드는 세포 사망에 기여하고 있습니다. 우리는 또한 감기 Percoll의 사용뿐만 아니라 불연속 그라디언트의 밀도를 변화뿐만 아니라 leukocytes의 품질에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 또 다른 중요한 요소는 뇌 조직의 충분한 부드러운 균질입니다. 우리는 현미경과 유동세포계측법으로 본 세포 파편의 풍부한 양의 뇌 조직 결과의 부족과 거친 균질을 발견했습니다. 세포 파편 또한 적절하게 크기의 셀 스트레이너와 뇌 homogenate을하지 않아서에서 발생할 수 있습니다. 세부 사항에 적절한주의 추가 실험 및 분석을위한 충분한와 충분한 BILs 준비의 핵심이다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 메이요 클리닉 (CLH)에서 조기 경력 개발 보너스로, NINDS (CLH)에서 부여 NS64571 지원하고, 도널드와 프랜시스 Herdrich (CLH)에서 후한 선물로.했습니다 우리는 도움을 메이오 클리닉 유동세포계측법 코어를 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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