Summary
Un método rápido para obtener la infiltración de leucocitos en el cerebro murino se describe. Este método utiliza un gradiente de Percoll continua y discontinua gradiente de Ficoll para seleccionar y purificar la capa de leucocitos enriquecido. Leucocitos aislados se puede caracterizar por las mediciones de citometría de flujo.
Abstract
Se describe un método para la preparación de los leucocitos cerebro infiltrante (BILS) de los ratones. Demostramos cómo infectar a los ratones con el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) a través de una técnica de inyección rápida intracraneal y la manera de purificar a la población de leucocitos enriquecido de infiltración de las células de todo el cerebro. En pocas palabras, los ratones son anestesiados con isoflurano en una cámara cerrada y son a mano alzada inyecta con una jeringa Hamilton en la corteza frontal. Los ratones son sometidas a muerte en varias ocasiones después de la infección por sobredosis de isoflurano y el cerebro entero se extraen y se homogeneizaron en RPMI con un triturador de tejidos Tenbroeck. Cerebro homogeneizado se centrifuga a través de un gradiente de Percoll continua del 30% para eliminar los restos celulares de mielina y otros. La suspensión celular Luego, se cuela a 40 micras, lavado y centrifugado en forma discontinua Ficoll-Paque Plus gradiente para seleccionar y purificar los leucocitos. Los leucocitos se lavan y se volvieron a suspender en los tampones apropiados para determinar el inmunofenotipo por citometría de flujo. La citometría de flujo revela una población de células del sistema inmune innato en las primeras etapas de la infección en ratones C57BL / 6. A las 24 horas post-infección, varios subconjuntos de células inmunes están presentes en el BILS, con una población enriquecida de Gr1 +, CD11b + y F4/80 + células. Por lo tanto, este método es útil en la caracterización de la respuesta inmunitaria a una infección aguda en el cerebro.
Protocol
1. Inyección de virus intracraneal:
La siguiente técnica ha sido modificada y utilizada ampliamente por nuestro laboratorio y sus colegas. En pocas palabras, la inyección intracraneana de la cepa de virus de Daniel murina de Theiler encefalomielitis (TMEV) o simulada-infección (1, 10) se lleva a cabo en ratones jóvenes (preferiblemente 5-6 semanas de edad) para obtener los leucocitos cerebro infiltrante (BILS). Tenga en cuenta que los resultados difieren entre la cepa de Daniel, la cepa Bean, y la cepa GDVII. Con el fin de la cosecha BILS, ratones reciben 2x10 5 PFU de TMEV y se infectan durante 24 horas.
- Coloque la aguja de inyección (calibre 27, ¼ en, Kendall), a una máquina de jeringa de 1 ml y se puso a Hamilton entregar 10 l de virus.
- Elaborar TMEV en 10 l DMEM en la jeringa con especial atención a las burbujas de aire. Cuando sea apropiado, los ratones infectados farsa reciben 10 l de DMEM libre de virus.
- Justo antes de la inyección, vierta aproximadamente 1 mL de isoflurano en una campana de cristal que contiene una malla de alambre con sustrato de algodón por debajo.
- Ratones lugar direclty en la malla de alambre en la campana hasta que se convierten a la ligera anestesia, insensible a los pies-pinch e inmovilizado por el anestésico por inhalación, a unos 10-15 segundos. Los ratones no debe entrar en contacto directo con el isoflurano, la sustancia puede ser irritante y cáustico.
- Mientras está bajo anestesia, para preparar a los ratones por inyección rápida localización de las coordenadas adecuadas en la región de la corteza frontal en el cráneo afeitado y con tinta. La ubicación general de inyección es de 1 mm anterior al bregma y 1 mm lateral a la sutura sagital en el lado derecho (Figura 1). Mientras que la inyección estereotáxica puede ser apropiada en algunas situaciones experimentales, hemos encontrado que a mano de inyección sin afeitar o tinta es adecuada para la mayoría de los experimentos. De separar el pelo con la punta de la aguja a lo largo de ambos ejes es apropiada para la inyección.
- Para hacer una inyección, orientar la aguja perpendicular a la calavera y la prensa a través del hueso a una profundidad de aproximadamente 3 mm.
- Expresar el virus en el cerebro al presionar el botón jeringa Hamilton abajo y esperar 2 segundos para que el virus para entrar en el cerebro antes de retirarse.
- Retire con cuidado la aguja y coloque el ratón en una jaula limpia y seca. Los ratones despierta de la anestesia rápidamente y comiencen a funcionar normalmente en cuestión de minutos. Prestar la debida atención a los ratones que presentan síntomas anormales, tales como el sangrado excesivo en el sitio de inyección, como la eutanasia del animal puede ser apropiado. Animales adecuados de manejo 6 y el cumplimiento de los Institutos Nacionales de Salud y Cuidado de Animales institucional y las directrices del Comité de Uso deben ser seguidas.
2. Cerebro que infiltran la preparación de leucocitos:
- Prepare de fondo redondo de roble tubos de centrífuga de Ridge, que puede tener una capacidad de 30 ml con 10 ml de RPMI 1640, 9 de Percoll ml y 1 ml de PBS 10X y los tubos deben sentarse a temperatura ambiente en el banco durante el proceso de extracción del cerebro.
- Traiga Ficoll-Paque Plus a temperatura ambiente (RT).
- La eutanasia de animales modificados por sobredosis de isoflurano 5 y eliminar rápidamente el cerebro con una espátula de acero inoxidable y el tejido en un tubo cónico de 15 ml que contienen 5 ml de RPMI en el hielo. En algunas circunstancias, PBS-perfusión puede ser apropiado para eliminar las células circulantes en sangre periférica de la preparación BILS. Los ratones deben estar completa y correctamente anestesiado antes de la PBS-perfusión.
- Transferencia de cerebros y la solución de RPMI a un molino de 7 ml de vidrio Pyrex tejido Tenbroeck marca y homogeneizar suavemente con 10-15 golpes.
- Pipeta de un adicional de 5 ml de RPMI en el homogeneizador y pipeta de arriba y abajo dos veces. Transferencia de cerebros homogeneizado (aprox. 10 ml) para preparar con anterioridad de fondo redondo de tubo y suavemente invierta 2-3 veces para mezclar.
- Giro homogenato de cerebro a 7800g ave durante 30 minutos a temperatura ambiente en un F0360 rotor de ángulo fijo en un Beckman Allegra X-22R centrífuga clínica.
- Después de la centrifugación, eliminar los restos de mielina que ha flotado a la parte superior de la pendiente. Recoger la capa de leucocitos que flota por encima de los glóbulos rojos de pellets (Figura 2).
- Cepa capa de leucocitos a través de un filtro de 40 micras de células en un Erlenmeyer de 50 ml. Llevar la solución a 50 ml con RMPI.
- Tubos de centrifugado que contiene la suspensión celular diluida en una centrífuga clínica a 1500 rpm (600 g promedio) durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y recoger el sedimento celular. Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón FACS (1% de suero bovino azida de albúmina, 0,02% de sodio en el calcio y el magnesio libre de PBS) y la transferencia de la suspensión celular a 5 ml ronda final FACS tubos.
- Con cuidado, subyace la suspensión con 1 ml de Ficoll-Paque Plus.
- Girar el tubo a 2500 rpm (1400 dio) en centrífuga clínica durante 25 minutos a temperatura ambiente sin ningún freno.
- Eliminar la capa blanca y esponjosa en la interfase (Figura 2) con una pipeta ml y traslado al nuevo tubo de 5 ml de FACS. Lávese las canas con 4 ml de tampón FACS.
- Girar el tubo a 1500 rpm (600 g promedio) durante 5 min a temperatura ambiente en centrífuga clínica para precipitar las células.
- Aspirar el sobrenadante y recoger el sedimento celular. Resuspender el pellet de leucocitos en un tampón adecuado y mantener en hielo en el nuevo tubo de FACS.
- Recuento de células, evaluar la viabilidad celular por exclusión azul tripán y analizar por citometría de flujo. En general, los investigadores pueden esperar para adquirir aproximadamente 5 x 10 5 células / animal.
3. Inmunofenotipo por citometría de flujo
- Después de aislar y contar los leucocitos, las células del giro durante 3 minutos a 1500 rpm (600 dio) en una centrífuga clínica.
- Resuspender el precipitado en tampón de bloqueo que contenga lo siguiente: tampón FACS, el sobrenadante del hibridoma 2.4G2 (Fc bloque; anti-CD16/32) y suero fetal bovino en una proporción de 10:05:01 y se incuba durante 30 minutos a 4 ° C .
- Preparar y añadir anticuerpos conjugados contra los antígenos extracelular a las células bloqueadas en una concentración de 1:200 y se incuba durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad. Mancha y se incuban las células en 200 l en un 96 y V-fondo de la placa. Controles apropiados incluyen células no teñidas y muestras de fluorocromo de compensación, según sea necesario.
- Girar las células teñidas a temperatura ambiente durante 3 minutos a 1500 rpm (600 dio) en una centrífuga clínica utilizando un rotor adecuado para placas de 96 pozos.
- Aspirar el sobrenadante y lavar las células con 200 l de tampón FACS pipeteando suavemente hacia arriba y abajo 3 veces.
- Repita la técnica de lavado por encima de dos veces.
- Después del lavado, resuspender las células en paraformaldehído al 2% y la transferencia a los tubos de FACS. La fijación es necesario para el análisis de citometría de flujo de las células infectadas de Bioseguridad Nivel 2 reactivos.
- Ejecutar las células fijadas en un Calibur BD FACS siguiendo un método de citometría de flujo modificado 8 y analizar los archivos sin conexión utilizando FlowJo, WinMDI u otros programas disponibles y el análisis de citometría de flujo.
- El análisis de 50-100,000 eventos por muestra se requiere generalmente para inmunofenotipo adecuada.
Anticuerpos directamente conjugado utilizado en este experimento:
CD45 se detectó con el clon 30-F11. Ly6C / G se detectó con el clon Gr1, RB6-8C5. CD11b fue detectado con el clon M1/70. F4/80 se detectó con el clon BM8.
4. Los resultados representativos:
Mostramos los resultados de células de fenotipo BILS ratón a las 24 horas post-infección (Figura 3). Los leucocitos se tiñeron con PerCP-conjugadas anti-CD45 de ratón para detectar las células inmunes, PE-conjugado anti-ratón Ly6C / G para detectar monocitos inflamatorios, APC-conjugado anti-ratón CD11b y APC conjugado anti-ratón F4/80 para detectar células del linaje de los monocitos. El análisis se realizó con un instrumento BD FACS Calibur.
Figura 1. Localización anatómica de la zona de inyección. El sitio se encuentra a 1 mm anterior al bregma y 1 mm lateral a la sutura sagital en el lado derecho.
Figura 2. Los leucocitos ejemplo de separación de gradiente de leucocitos y BILS. Son inicialmente recogidos directamente por debajo de la capa de residuos de mielina y por encima de la pastilla de glóbulos rojos en el gradiente de Percoll. La capa blanca y esponjosa (BILS) en la interfaz se obtiene de la gradiente de Ficoll.
Figura 3. Inmunofenotipo de cerebro infilatrating leucocitos a las 24 horas post-infección los leucocitos de ratón. Fueron aislados desde el cerebro por centrifugación diferencial de densidad de tejido homogeneizado preparado a partir de animales a las 24 horas después de la infección intracraneal. Las células se tiñeron con anticuerpos con fluorescencia conjugada contra CD45 de ratón, Ly6C / G, CD11b y F4/80. Gating inicial se realizó mediante el trazado de CD45, un marcador de las células inmunes, en contra de dispersión frontal (FSC), un indicador del tamaño de la celda (C). El hi CD45 (A, D), CD45 lo (B, E), y neg CD45 (F, G) la población se analizaron para determinar los niveles relativos de expresión de los marcadores de monocitos y macrófagos Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), y CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + CD11b + F4/80 monocitos inflamatorios se encuentra casi exclusivamente en la población CD45 alta (A, D), de conformidad con la infiltración de estas células de la periferia. Por el contrario, he aquí Ly6C/G-F4/80 CD11b macrófagos + se encuentra casi exclusivamente en la LO CD45 (B, E) y CD45 neg (G) las poblaciones, de acuerdo con un fenotipo residente. En numerosos experimentos, no hemos observado células CD45 de alta o Ly6C / G + + CD11b + F4/80 monocitos inflamatorios en el cerebro de los infectados o simulacro infecciónTed ratones (datos no mostrados).
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Discussion
Nosotros usamos la citometría de flujo para determinar la calidad de la preparación de la infiltración de las células cerebrales, y para distinguir las diferentes poblaciones de células inmunes 2, 9. En agudo puntos de tiempo, nuestro método BILS rendimientos altos porcentajes de monocitos inflamatoria dentro de la población CD45hi, así como un alto porcentaje de los macrófagos en la población CD45lo. Esto indica que una respuesta inmune reproducibles dentro del cerebro con firmeza se puede caracterizar por nuestro método.
Esta técnica es de particular importancia para los experimentos que requieren de una población bien caracterizados de las células inmunes del cerebro de ratón. Anteriormente hemos realizado experimentos de transferencia adoptiva mediante la inyección de nuestro cerebro infiltración de leucocitos en ratones host a través de la inyección de cola vena 7, y se ha caracterizado el BILS a través de varios experimentos in vitro 9. Nuestra preparación BILS es particularmente beneficioso en los experimentos que hay que distinguir las diferentes poblaciones de células del sistema inmune de las células residentes del cerebro, incluyendo los macrófagos residentes y microglia. Otra de las aplicaciones de interés incluye en tiempo real RT-PCR análisis realizado en el ARN total aislado de BILS a 7 días después de la infección para identificar las funciones efectoras 3. Por ejemplo, medimos la GAPDH, granzima B y ARN perforina en BILS recogidos en 7 días después de la infección de la perforina, competente y con deficiencia de los animales infectados con TMEV. También hemos utilizado este método para determinar cómo BILS NKG2D contribuye a despejar TMEV del cerebro de ratones con infección aguda 4.
Hay varios aspectos críticos del método. Es esencial para que todas las soluciones a temperatura ambiente antes de la preparación para evitar estrés innecesario a los leucocitos y para asegurar la separación adecuada de densitometría. El estrés en los leucocitos contribuye a la muerte celular, que los hace especialmente poco fiable para los experimentos in vivo donde se adoptiva de una población en vivo de las células transferidas a un animal huésped. También hemos determinado que el uso de Percoll frío no sólo cambia la densidad del gradiente discontinuo, sino que también afecta la calidad de los leucocitos. Otro elemento fundamental es la homogeneización suficiente y suave del tejido cerebral. Hemos encontrado que la homogeneización inadecuada y áspero de los resultados de tejido cerebral en grandes cantidades de desechos de células visto por microscopía y citometría de flujo. Los restos celulares también puede ser consecuencia de no forzar el homogenato de cerebro con las células colador de tamaño adecuado. Una adecuada atención a los detalles es fundamental en la preparación BILS amplio y suficiente para la experimentación y el análisis.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la beca NS64571 del NINDS (CLH), por un premio de desarrollo de carrera a principios de la Clínica Mayo (CLH), y por un generoso regalo de Donald y Frances Herdrich (CLH). Nos gustaría agradecer a la Clínica Mayo de flujo básico Citometría de asistencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
