Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Published: August 24, 2014 doi: 10.3791/51045
Automatic Translation
1, 1
1Neuroscience Center, University of Helsinki

ERRATUM NOTICE

Summary

Dinamik boyuna görüntüleme ve muhabiri transgenik farelerin sinir uçlarının selektif lazer lezyon için protokol sunulmuştur.

Abstract

Deride sinir uçları, nöropatik ağrı 2 gibi 1 algılamak olarak hem de patolojik süreçlerde fizyolojik süreçlerde görev alır. Onların yakın-yüzey konumlandırma sağlam hayvan canlı cilt sinir uçlarının mikroskopik görüntüleme kolaylaştırır. Multiphoton mikroskopisi ile cilt dokusunun güçlü ışık saçılma sorunun üstesinden gelmek iyi görüntü elde etmek mümkündür. (Çevre duyu nöronları dahil olmak üzere) nöronlarda Thy-1 promotörünün kontrolü altında eksprese EYFP Raportör transgenik fareler ile birkaç aya kadar ya da yaşam boyu uzun bir süre boyunca tek tek sinir uçlarının uzunlamasına çalışmalar için uygundur. Ayrıca, görüntüleme için aynı femto saniye lazer kullanarak, bu sinir lifi yeniden çalışmalar için sinir lifleri yüksek ölçüde seçici lezyonlar üretmek mümkündür. Burada, in vivo görüntüleme uzunlamasına multiphoton için basit ve güvenilir bir protokolü vefare deri sinir uçları lazer tabanlı mikro.

Introduction

Kutanöz sinir uçlarının farklı patofızyolojik altında dinamik değişikliklere uğrarlar. Sinir lifleri periferik nöropati 2 veya Morton nöroma 3 gibi hastalıkların seyrinde dejenerasyon ve rejenerasyon veya yeniden yapılanma sürecinde gidebilirsiniz. Travmatik yaralanma sonra, deri sinir uçlarının dinamiklerinin önemli bir parçası hasarlı alanın reinnervasyon olduğunu. Ancak, sinir uçlarının soruşturma ortak bir yaklaşım devam eden süreçler 4 gerçek-zamanlı bilgi eksikliği, ex vivo histolojik kesit olduğunu. Genetik olarak kodlanmış floresan markör kullanılarak, bu nedenle yapısal değişikliklerle ilgili zengin ve önemli ölçüde daha fazla ayrıntılı bilgi elde edilmesi, canlı hayvanların derisinde sinir uçlarını izlemek mümkündür. Deri altı sinir uçlarının araştırılması geleneksel fluoresan mikroskobu, ancak, cilt dokusunun güçlü ışık saçılım güçlü kalite zayıflatmaktadır kullanarak mümkündürVerilerin 5 satın almıştır. Multiphoton mikroskopi nedeniyle sadece objektif odak noktasından floresan emisyonu uyarma ışık fotonlarının enerjisi olmayan doğrusal toplamına kuvvetle saçılma dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edilmesine izin verir. Bu etki, deri dokuları 6 ölçüm için sağlam bir penetrasyon derinliği artışı ve sinyal-gürültü oranının bir gelişmeye yol açar. Görüntüleme için kullanılan aynı lazer kullanarak, bu sinir liflerinin 7 seçici diseksiyon üretilmesi mümkündür. Aşağıdaki protokolde seçici lazer lezyonu ticari olarak temin multiphoton mikroskop sistemi kullanılarak raportör ile birlikte transjenik farelerde in vivo olarak deri altı sinir uçlarının uzunlamasına görüntüleme yöntemini göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan denekleri prosedürleri Ulusal Hayvan Deney Kurulu, Finlandiya tarafından onaylanmıştır.

Görüntüleme için 1. Hayvan hazırlanması

  1. Intraperitional ketamin (IP) enjeksiyon ile (vücut ağırlığı başına 0.08 mg) ve ksilazin (vücut ağırlığı başına 0.01 mg), bir fare anestezisi. Arka ayak tutam refleks ile anestezi edin.
  2. Göz dehidratasyon gözleri korumak için (Viscotears) damlası halinde hayvanın gözleri daldırın.
  3. Hipotermiyi önlemek için 37 ° C 'de bir ısıtma pedi (Supertech) üzerine fare koyun.
  4. % 70 etanol ile görüntüleme için belirlenmiş ayak pedi temizleyin.
  5. Deri ve kapak cam arasındaki bağlantı için daldırma ayak tabanından deri üzerinde bir damla su ekleyin.
  6. Kapak sınıfı ile metal bir halka altında konumlandırılmış arka pençe altında plastik ambalaj malzemesi koyun.
  7. Cilt düzleştirmek için plastik ambalaj malzemesinin kalınlığını ayarlayın.
  8. Kapak glas bir damla su koyunkapak cam ve hedefi arasında daldırma için s.

2. Metal Fiksator Yüzük Hazırlık

  1. Cilt stabilizasyonu için metal fiksatörün kullanmaktadır. Biz bir metal halka (Neurotar Ltd, Finlandiya nezaket) Topluluk Tasarım-korumalı iki kanat fiksatör kullanın. Superglue şırınga doldurun halkası üzerindeki iğne boyunca superglue küçük bir damla koymak ve yavaşça Halka yüzeyi boyunca yeknesak bir şekilde kaplanmasını tutkalı yaymak. Tutkal aşırı miktarda görüş alanını azaltmak ve daha sonra görüntüleme engelleyebilecek, çünkü sadece homojen kaplama için gerekli olan tutkal az miktarda koymak için çok önemlidir.
    NOT: (altından) ve bir metal çubuk (bir kapak olarak) standart bir mikroskop cam slayt Alternatif kombinasyonu cildi ve düzleştirmek için tertibat 14 uygun optik bağlantısının sağlanması için kullanılabilir. İki ataç cam ve metal çubuk, yüzeyi arasındaki pençe düzeltmek için kullanılabilir (Şekil 4
  2. Mikroskop lamı kapak (5 mm çapında, Elektron Mikroskobu Science) ile halka örtün.
  3. Motorlu mikroskop sahnede montajlanmış olduğu sert metal bir çubuğa halka fiksatör vidalayın.

3. Görüntüleme Prosedürü

  1. Thy1-YFP lH farelerin kullanılması durumunda, sinir liflerini görselleştirmek için floresan lamba spektrumları mavi kısmını seçmek. Epifloresans modunda ilgi sinir bulun ve ona odaklanın.
  2. Boyuna görüntüleme için bir nokta koordinatlarını yazın. Bir referans noktası olarak karpal pedi kullanın. Aşağıdaki görüntüleme oturumları sırasında, ilk karpal pedi algılar ve daha sonra aynı memba büyük sinir liflerini bulmak ve kaydedilen koordinatlarını kullanarak geri dönün. Bu referans, aynı sistemi korumak için metal çubuğun dik aynı yönde ayak pedi yerleştirmek için gereklidir.
  3. Iki foton modunda açın. Thy1-YFP lH fareleri için, bir lazer ışınının dalga boyu 950 nm kullanım için uygundursinir liflerini görselleştirmek için.
  4. (450 520'den YFP etiketli sinirlerin görüntüleme için 550 nm ve 580 YFP floresans ve saç otofloresanm saptanması için 630 nm, ikinci harmonik oluşumu saptanması için 480 nm e) seçeneğini lazer dalga boyu kanalları ve emisyon ile başlar fotohasar ve ağartma önlemek için düşük lazer gücü (% 3-5). Photomultiplier tüpleri üzerinde tipik voltaj görüntüleme bu tür için 600-700 V.
  5. (1-10 istediğiniz çözünürlüğü (512 x 512 veya hızlı olaylar ölçümleri için 640 x 640 x 800 veya morfolojik görüntüleme için 1.024 x 1.024 800), eksenel adımı (1-3 mikron), numune kalınlığı ve zaman aralıklarını ayarlayın dak). Pozlama süresi, bir piksel için 1 milisaniye düzenindedir.
  6. İlk yazılım görüntüleme hacminin üst ve alt sınırları işaretleyin.
  7. Lezyonun önce başvuru için referans görüntü yığınını edinin. Gerektiğinde, birkaç dakika boyunca taban çizgisini kaydetmek mümkündür.
  8. Bir doku ped ile temiz görüntülenmesi ve tamamen uyanık kadar 36 ° C 'de bir yeniden kazanma kutusuna fare yerleştirilir.
    Not: Genellikle, lazer tarafından kışkırtılan lezyonu ile birleşmiş bir görüntüleme oturumunun süresi (aşağıya bakınız) 1 saat aşmaz. Biz hayvan derinden her 10-15 dakikada anestezi doğrulayarak öneririz; Bu kendini görüntüleme engel olmamalıdır ama deneysel prosedür planlanmaktadır ise düşünülmelidir. Tek bir ketamin / xylazyne doz etkisinin süresi bu 25-30 dakika sonra, bir doz ½ ¼ ek uygulamak için tavsiye, 40 dakika yaklaşık 30 ° C'dir.
    NOT: deneyler tek bir hayvan için görüntüleme oturumları frekans yeniden olumsuz etkilerini önlemek için 1 dönem 2 başına gün aşmaması planlıyor zaman yanı düşünülmelidirpetitive anestezi.

4. Lazer Lezyon

  1. Referans görüntü yığınını aldıktan sonra, mikro lezyonu yapmak için ağartma protokolünü kullanır.
  2. % 100 lazer gücünü artırın.
  3. Çevrede (100-1,000x standart görüntüleme durumunda daha fazla) bölgesinden başına 100-1.000 msn pozlama süresini artırın.
  4. Lezyon için alan Anahat.
  5. Ağartma açarak lezyon olun.
  6. Geri normal görüntüleme moduna geçmek ve zaman atlamalı kayıtları devam.

5. Veri İşleme ve Analizi

  1. ImageJ 8 spektral Karışmama eklentisi kullanarak unmixing ile (Joachim Walter, Devam http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
  2. Görüntü yığını açın ve kanal bölünmüş.
  3. Arka plan ölçümleri için sinirlere veya saç serbest alanını bulun. Bir bölge o koyuno bölgede f ilgi.
  4. Dikkatlice sinirler açıkça ayırt edilebilir saç parçası özetlemektedir.
  5. Bu saçtan ayrı görüntü kısmında sinir özetlemektedir.
  6. Matrisi Karışmama kaydedin.
  7. Kül yığını için ölçülen karışmama matrisi uygulayın.
  8. * .tif Formatında yeni işlenmiş görüntü yığınlarını kaydedin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mümkündür Tarif edilen teknik kullanılarak, lezyon sonrası aynı elyaf izlemek ve hasarlı sinir uçları (Şekil 1) bozunmasını incelemek. 120-150 um'lik bir kalınlığa sahip yığın elde edilmesi görüş alanı içinde bütün lif tutmak için birkaç gün boyunca tekrar görüntüleme için genellikle uygundur.

Plastik ambalaj malzemesi cilt düzleştirmek için ayarlandığı zaman, genellikle lezyon öz üretilebilir, böylece kolajen tabakalar görüntüde aynı kalan şiddette (Şekil 2) ile görüntülenir. Kollajen tabakası üzerinde sinir uçları hassas lezyonu üretmek için en uygun olanlardır.

Cilt basık değil durumda, görüntü bulanık olması (Şekil 3) oluşabilir. Bu durumda yoğunluğu, hala morfolojik sinir liflerinin araştırmalarda ancak lazer lezyonu prosedür olur için uygun olabilir engellenmemelidir.

Şekil 1
Ve doğrudan doğruya lezyon sonrası, alt panel 30 dakika ve 10 gün (sol ve sonra, aynı elyaf gösterilmeden önce maksimum projeksiyon görüntü olarak sunulan sinir lifi lazer lezyonu etkisi Şekil 1. Zaman Takip. Üst görüntüleri gösterir fiber sağ paneller, buna). 10 gün lezyon sonra görünür olmayan nöronal doğanın bazı YFP ifade yapıları vardır. Bu yapılar, travmatik koşullarında geçici Thy1 geni ifade bilinmektedir keratinositler olması muhtemeldir. Sinir liflerinin YFP floresan, sarı olarak gösterilmiştir. Bir ok lezyonun bölgesini işaretler. Ölçek çubuğu 30 mikron.

/ftp_upload/51045/51045fig2highres.jpg "src =" / files / ftp_upload / 51045 / 51045fig2.jpg "/>
Düzleştirilmiş derisi alanı sinir uçlarının Şekil 2'de maksimum projeksiyon görüntüsü. Sinir liflerinin YFP floresan, sarı olarak gösterilmiştir, kollajen, ikinci harmonik oluşumu mavi renkte gösterilir. Ölçek çubuğu 50 mikron.

Şekil 3,
Şekil 3. bir çok optik bölümler için bir maksimum z projeksiyon olarak elde edilen, deriye kavisli alanda sinir uçları. Sinir lifleri ve saç otofloresanm YFP floresan, sarı olarak gösterilmiştir, kollajen, ikinci harmonik oluşumu gösterilmektedir mavi. Ölçek çubuğu 50 mikron.

ftp_upload / 51045 / 51045fig4highres.jpg "src =" / files / ftp_upload / 51045 / 51045fig4.jpg "/>
Bir kapak olarak mikroskop cam slayt kullanarak pençe fiksasyon prosedürü 4. Şekil. Slayt standart ataç kullanarak metal çubuk takılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu video protokolü biz tek bir sinir uçlarının non-invaziv uzunlamasına iki foton görüntüleme yöntemini göstermektedir.

Cilt innervasyon dinamikleri, sedef hastalığı ve periferik nöropati 2, gibi hastalıkların, ve travmatik yaralanmalar 9 etkilenir. İki foton görüntüleme kollajen matris içinde sinir lifleri yapıların detaylı analiz sağlar. Transgenik raportör farelerin kullanılması sinir liflerinin boyama ile ilgili problemleri önler. Thy1-mitoCFP farenin sinir lifleri 11 mitokondriyal dinamikleri işlevsel çalışmaların bir fırsat sağlayabilir oysa thy1 YFP-H gerilme morfolojik veri analizi için 10 yeterince sağlam gibi görünüyor. YFP 16 / ICR hattı Meissner organları 12'nin gözlemi için kullanılabilir. Alternatif bir yaklaşım, belirli bir nöron popülasyonlarının seçici takibi için dorsal kök ganglion içine viral enjeksiyonla13.

Bu, kolajen matris içinde seçici lezyon üretim güçlü cildin üst tabakalarına kıyasla engellenmektedir olduğu dikkate değerdir. Görüntüleme için floresan yoğunluğu% 10-20 dizi farklılık ise sinir liflerinin diseksiyon için zaman zaman maruz bırakma süreleri olduğu kadar on kat farklılık olmasıdır. Sabit daldırma birleştirme tutulması gereken görüntü kalitesini muhafaza etmek için iyi bir.

Görüntünün çözünürlüğü genellikle edinme arzu hızına bağlıdır. Biri hızlı değişiklikleri algılamak veya ince morfolojik özellikleri çalışmaları için çözünürlüğünü artırmak için çözünürlüğünü veya görüntülü alanın kalınlığı azaltmak böylece çözünürlüğü 800 x 800 piksel ile 30 KAFES yığını üretimi için tipik zaman, 1 dk.

Ayak yastığı fiksasyon görüntünün sürüklenme izin vermek için yeterince sıkı olması gerekmektedir, ancak, aynı zamanda, t kan dolaşımını etkilemezo bir cilt. Prosedürün optimizasyonu için, kan damarları izleyicilerin enjeksiyonları kan akışının izlenmesi yoluyla plastik ambalaj malzeme basıncını ayarlamak için izin, mümkündür (örneğin, TexasRed 70 kDa dekstran etiketli). Kalp atışı ve solunum hareketi doğrudan pençe iletilir değildir çünkü hayvan derinden anestezi çünkü bu protokolü açıklanan hazırlanmasında Hareket eserler olası değildir, pençe kendisi sıkıca tespit düzeneğine takılı edilir ve. Bununla birlikte, hafif hareketler yüksek büyütme görüntüleme gerçekleştirilir, özellikle mümkündür. Bu durumda biz hareket eserler telafi etmek için tasarlanmış ImageJ eklentileri kullanarak tavsiye ederim.

Aynı alanın tekrar görüntüleme karpal pedi 14 olarak ya da enjeksiyon nokta bir dönüm noktası olarak hizmet verebilir 6 ayak tabanı bulunan bazı maddelerin enjeksiyonu durumunda bu referans noktası ile elde edilebilir. Diğer bir olasılık cilt dövme olduğunu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar mali destek için teknik yardım, CIMO Vakfı ve FGSN için Neurotar Ltd teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Round cover glass  Electron Microscopy Science 72296-05 5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears Novartis 2 mg/g
Superglue Loctite 401 Henkel 135429
Ketaminol Intervet Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun Bayer Healthcare Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml BD 300013
30 G 1/2" needles BD 304000
Plastic packaging material Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope Olympus FV-1000MPE Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective Olympus XLPLN 25XWMP Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W) SpectraPhysics
Heating pad Supertech TMP-5b Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator Neurotar Ltd.
ImageJ NIH Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strain JaxLab 003782

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  2. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  3. Wu, K. K. Morton's interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
  4. Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
  5. Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
  6. Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
  7. Sacconi, L., O'Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
  8. Rasband, W.S., ImageJ. , US National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  9. Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
  10. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  11. Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
  12. Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
  13. Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
  14. Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).

Tags

Nörobilim Sayı 90 multiphoton mikroskopi sinir uçları lezyon thy-1 promotör,

Erratum

Formal Correction: Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin.

Leonard Khiroug was removed as an author.

Cilt Tek Sinir Endings <em>Vivo</em> İki-Foton <em>Mikrokopisi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuryev, M., Molotkov, D. In… More

Yuryev, M., Molotkov, D. In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin. J. Vis. Exp. (90), e51045, doi:10.3791/51045 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter