Summary
Мы разработали модель ломтик мозга, который может использоваться для изучения молекулярных механизмов, участвующих в эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга. Этот метод генерирует жизнеспособной зрелой ткани мозга и уменьшает количество животных, необходимых для экспериментов, в то время как сохранение нейронной цепи, клеточных взаимодействий и постсинаптические отсеков частично нетронутыми.
Abstract
Изучение молекулярных механизмов, участвующих в нейропатологических условиях, таких как ишемического инсульта, может быть трудно при использовании целые системы животных. Таким образом, первичный или "нейронов-подобные 'системах клеточных культур, как правило, используется. В то время как эти системы могут быть сравнительно легко работать, и являются полезными модельные системы, при которой различные функциональные результаты (например, гибели клеток) могут быть легко количественно, исследованные результаты и пути в культуре нейронов незрелых (например, эксайтотоксичность-опосредованной клеточной гибели путей) не обязательно те же, что наблюдается в зрелом мозге или в интактной ткани. Таким образом, существует необходимость в разработке модели, в которых клеточные механизмы в зрелом нервной ткани может быть рассмотрен. Мы разработали методику в пробирке, которую можно использовать, чтобы исследовать различные молекулярные пути в интактной нервной ткани. Методика использует описанные здесь ткани коры головного мозга крыс, но этот метод может быть адаптирован для использования тканииз различных видов (например, мыши, кролика, морской свинки, и курицы) или областях мозга (например, гиппокамп, стриатума и т.д.). Кроме того, разнообразие стимуляции / лечения можно использовать (например, эксайтотоксический, введение ингибиторов и т.д.). В заключение, модель мозг ломтик описано здесь, может быть использован для изучения различных молекулярных механизмов, участвующих в эксайтотоксичности-опосредованного повреждения головного мозга.
Introduction
Наиболее распространенной формой инсульта ишемического инсульта, который происходит, когда мозговой кровеносных сосудов становится окклюзии. Ткань ишемии, который возникает в результате прекращения кровотока приводит к широкому деполяризацию мембраны, высвобождение возбуждающих нейромедиаторов, и устойчивое повышение внутриклеточного кальция, что приводит к активации пути клеточной гибели 1. Этот процесс был назван "эксайтотоксичность ', и является общим путь вовлечен в гибели нейронов производится с помощью различных патологий, в том числе инсульта 2. Ингибирование сигнальных путей, участвующих в эксайтотоксичности и других нервных каскадов клеточной гибели является привлекательным подход ограничить повреждения нейронов после инсульта.
Выявление точные молекулярные механизмы, участвующие в эксайтотоксичности и ишемического инсульта может быть трудно при использовании целые системы животных. По существу, первичной эмбриональных и "нейронов, как '(например neuroblastoма и аденокарциномы иммортализованные линии) системы клеточных культур часто используются. Основные преимущества этих моделей в том, что они легко манипулировать, относительно экономически эффективным, и гибель клеток может быть легко измерены и количественно. Тем не менее, сигнальные пути могут быть изменены условий культивирования, используемых 3,4 и незрелых нейронов и увековечен линии могут экспрессировать различные рецепторы и сигнальные молекулы по сравнению с зрелые мозг 5-8. Кроме того, культивируемые нейроны только позволит рассмотрение одного типа клеток (или два, если используется система совместного культивирования), тогда как неповрежденной ткани мозга неоднородна, содержащие различные типы клеток, которые взаимодействуют друг с другом. Органотипической системы культуры ломтик (тонкие эксплантатах мозговой ткани) также используются, и эти модели позволяют изучение гетерогенных популяций клеток, поскольку они находятся в естественных условиях. Тем не менее, лишь ограниченное количество ткани можно получить от каждого животного при использовании этого метода, ломтики можетне быть культивированы так долго, как иммортализованных клеточных линий, и от среднего до долгосрочного культуры могут привести к изменениям в сигнальных путей и рецепторов в срезах. В то время как пожилые мозг может быть использован для создания органотипической ломтики, кусочки от незрелого мозга более склонны к культуре, и более широко используется. Существует, следовательно, необходимость в разработке моделей, которые имитируют или представляют нетронутыми зрелый мозг, что просты в использовании, в котором нейронные сигнальные пути могут быть рассмотрены.
При этом техника в пробирке с участием нетронутыми нервной ткани, которую можно использовать для выяснения молекулярные механизмы, участвующие в клеточной смерти после эксцитотоксического или ишемического инсульта описано. Этот метод уменьшает количество животных, необходимых для выполнения эксперимент, воспроизводим и генерирует жизнеспособной ткани, которая ведет себя в метаболически аналогично больших органотипических ломтиками. Кроме того, нейронная схема, сотовые взаимодействия, и постсинаптического соmpartment остается частично нетронутыми. Физиологическая буфер, используемый позволяет клеточные мембраны "запечатать", а также позволяет клеткам восстановить свой первоначальный сопротивление мембраны 9. Эта модель мозга срез способен добросовестно имитировать ответов наблюдаемые следующие эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга 10, и может быть использован для изучения молекулярных механизмов, участвующих в ход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры проводятся с одобрения Университета Ньюкасла уход за животными и комитета по этике, а также в соответствии с соответствующими принципами и правилами, в том числе Закона о NSW исследований на животных, животное исследовательского регулированию NSW, и австралийский Кодекса практики Уход и использование животных в научных целях.
1. Рассечение ткани головного мозга
- Жертвоприношение двенадцати недельных крыс мужского пола путем обезглавливания. Крысы могут быть либо умерщвляли потрясающий и обезглавливания, или может быть первым наркозом изофлураном (5% индукции, 1,5-2% технического обслуживания) в 70% N 2 и 30% О 2, а затем обезглавили.
- Удалить мозг от черепа как можно быстрее (в идеале это должно быть выполнена менее чем за 2 мин).
- Снимите кору на свободной рукой рассечение. Рассечение должны быть выполнены в возможно кратчайший срок, с минимальным повреждением мозга, как это возможно, с тем чтобы МАИntain целостность ломтиками.
- Для того чтобы удалить остатки кожу, мех, крови и т.д., погружают в мозг в небольшом количестве (3-5 мл) 37 ° C буфера Кребса (118 мМ хлорида натрия, 4,7 мМ хлористый калий, 1,3 мМ хлорида кальция, 1,2 мМ дигидрофосфат калия, 1,2 мМ сульфат магния, 25 мМ бикарбоната натрия, 11,7 мМ глюкозы, 0,03 мМ динатриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), уравновешенную 95% кислорода / 5% диоксида углерода (карбоген), рН 7,4).
2. Подготовка Microslices
- Поместите мозг на сцене измельчитель McIlwain, на котором два ломтика фильтровальной бумаги были размещены и смоченной теплой буфера Кребса. Держите мозг и фильтровальную бумагу, смоченную теплой буфера Кребса, но не настолько влажным, что есть свободная жидкость на поверхности бумаги, которые могут вызвать мозг скользить вокруг.
- Нарежьте мозг в 250 мкм корональных секций. Как питательные вещества, кислород, и отходы йна которые обычно обменивается с кровоснабжение обмениваются с жидкостью, которая окружает ткани в изолированной нервной ткани, размеры слоев не должно быть более чем 400 мкм в толщину, чтобы обеспечить адекватное насыщение кислородом и питательными веществами обмен происходит.
- Превращает сцену McIlwain 90 °.
- Нарежьте мозги в 250 мкм сагиттальной ломтиками. В данном случае эти срезы головного мозга (250 мкм × 250 мкм срезы переменной длины в зависимости от толщины ткани), называют microslices.
- Поместите microslices в круглую нижнюю трубу с 10-15 мл 37 ° C буфера Кребса (количество буфера Кребса использовать, будет зависеть от количества ткани).
3. Сбалансированность Microslices
- Осторожно перемешивают до индивидуальных microslices не приостановлены, а затем позволить им поселиться под действием силы тяжести.
- Осторожно удалите супернатант, который будет облачно из-за взвешенных мусора клеток, и добавить 10 мл свежевыжатого 37 ° СБуфер Кребса к трубе.
- Повторите Эту процедуру промывки четыре раза, что приведет к удалению большей части мусора.
- После этого уравновешивания microslices при 37 ° С при осторожном встряхивании / инверсии, а также изменить буфера Кребса каждые 15 мин в течение 1 часа в общей сложности.
- В это время добавляют 2 мл свежего буфера 37 ° C Кребса, и передавать 15-20 microslices (150 мкл microslice суспензии) к плоским дном полистирола 5 мл трубы с помощью дополнительного широким отверстием пипетки со сглаженными краями (которые могут быть созданы путем резка ~ 2 мм от конца наконечника P1000). Распространение microslices равномерно по дну трубки в одном слое, так что каждый microslice не дальше чем на несколько миллиметров от кислородом атмосфере.
4. Экзайтотоксическим Стимуляция
- Инкубируйте microslices при 37 ° С и непрерывно проходить карбогена над поверхностью 150 мкл суспензии microslice, используя газовую линию, которая положениеред чуть выше поверхности microslice суспензии (во избежание механического разрушения).
- Лечить microslices либо 150 мкл 5 мМ глутамата + 100 мкМ глицина в буфера Кребса (эксайтотоксический стимул: конечная концентрация 2,5 мМ глутамат + 50 мкМ глицина) или 150 мкл Кребса только буфера (контроль нестимулированных). Различные раздражители могут быть использованы на этом шаге (в том числе, но не ограничиваясь этим, AMPA, NMDA + глицин, KCl деполяризация, а кислород / глюкоза лишение).
- Удалите инкубационный раствор в различные моменты времени после стимуляции (0, 30, 60, 90, 120 и 300 сек), и заменить его 300 мкл охлажденного льдом буфера гомогенизации (30 мМ Трис, рН 7,4, 1 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты, 4 мМ ЭДТА, 100 молибдат аммония мкМ, 5 мМ пирофосфата натрия, 25 мМ фторида натрия, 1 мМ ортованадат натри, 1 мМ phenylmethanesulfonylfluoride, полный коктейль ингибитора протеазы).
- Гомогенизируют microslices на льду, используя стекло-тефлон Dounce гомогенизатор(20 ударов; 700 оборотов в минуту).
- Магазин гомогенатах при -80 ° С, и различных сигнальных молекул, молекул смерти и т.д. можно измерить с помощью вестерн-блоттинга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microslices, полученные с использованием этой процедуры являются жизнеспособными, и разнообразие видов (например, крысы, мыши и курицы) могут быть использованы для получения microslices. Три независимых меры жизнеспособности были использованы: частота дыхания (рис. 1), аденин нуклеотидные отношения (рис. 2), и ткань содержание калия (рис. 3). С помощью этих мер, было продемонстрировано, что microslices остаются жизнеспособными в течение по крайней мере 2 ч после генерации.
Brain microslices может быть использован для изучения различных сигнальных молекул, после различных стимулов (например, KCl деполяризация [Рисунок 4], AMPA, NMDA глутамат стимуляция 10), а также может быть использована для сравнения реакции молекул клеточной сигнализации между несколькими областях мозга (рис. 4). Кроме того, эффект от различных обработок ингибиторы / препарата на этих молекул также могут быть рассмотрены (например, киназы ингибиторы 10, агонисты рецепторов глутамата 11, quisqualic кислота 12).
Рисунок 1. Дыхание темпы microslices из куриного переднего мозга были рассчитаны следующим образом Темпы дыхания мозговой ткани:. Количество кислорода, потребляемого (разница между показаниями кислородного электрода в начале и в конце эксперимента), умноженной на количество молей кислорода в растворе, разделенных по времени инкубации (часы) и количество белка (мг). Типичные скорости дыхания изолированного млекопитающих коры головного мозга находятся между 55-80 мкмоль O 2 / г свежей вес / ч при обычных условиях 9. N = 9.
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. Рисунок 2 Наличие адениннуклеотидов в microslices из куриного переднего мозга представитель ВЭЖХ след измерения АТФ: АДФ отношения, выполненные, как описано выше 13. Высокая АТФ и низкие ADP уровни обычно находятся в жизнеспособных клеток, в то время как снижение уровня АТФ и повышение уровня АДФ характерны для апоптоза и некроза клеток 14. Типичный ATP: ADP отношения microslices варьироваться от 3:1 до 6:1, и были поддержаны на этих уровнях в течение более чем 2 часов.
Рисунок 3. Ткань К + содержание мозга microslices из незрелых куриного переднего мозга. Определение ткани калия насeful мера жизнеспособности, так как многие из химической и физиологической активности в ткани зависят от мембранного потенциала, что требует нормальное внутриклеточное содержание калия 9. Когда microslices промывали в K +-свободного буфера сразу после измельчения, ткани К + был исчерпан до уровней, которые были чуть выше фона (время 0). Тем не менее, на последующей инкубации с буфера Кребса, в microslices быстро накапливается K + из окружающей среды, и в течение 5 мин они достигли стабильному уровню аналогичной той, что для необработанных microslices (т.е. microslices промывали и инкубировали в обычном буфере). Добавление уабаина (0,2 мМ) и EGTA (2 мМ) после 20 мин инкубации ткань обусловлено K + содержание снизится до 0 в течение 8 мин. Это показывает, что microslices обычно активно насос K +, и что ткани K + уровни не из-за K + в ловушке мертвых тканей или промежуточные пространства. N = 4.
Рисунок 4. Временной ход GluN2B и GluA1 фосфорилирования следующее деполяризации с KCl. Microslices были получены из полосатого тела и сенсорной коры самцов крыс (n = 8), деполяризованы помощью высокой K + буфер Кребса, гомогенизируют, и исследовали на (А) GluN2B Фосфорилирование (в Ser1303) и (B) GluA1 фосфорилирование (в Ser845) с помощью вестерн-блоттинга в различные моменты времени после стимуляции (0-300 сек). Уровни фосфорилирования нормированы на общей GluN2B и GluA1 выражении (то есть фосфорилирования / общее выражение). * Обозначает статистическую значимость между областях мозга (р <0,05). Деполяризация с KCl привело фосфорилирования GluN2B и GluA1 рецепторов на S1303 иS845, соответственно. Скорость GluN2B фосфорилирования в S1303 колебалась от коры и полосатого тела, в то время как скорость GluA1 фосфорилирования в S845 был тот же в коре и полосатом теле. В последующих экспериментах мы показали, что это связано с дифференциальным регулирование многофункционального киназы, кальций / кальмодулин-стимулированной протеинкиназы II (CaMKII), которая фосфорилирует GluN2B на S1303, но не GluA1 на S845 10. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При этом пробирке метод в для генерации microslices которые могут быть использованы для изучения молекулярные механизмы, вовлеченные в эксайтотоксичности и ишемии-опосредованной гибели клеток в интактной ткани головного мозга зрелого описано. Эта техника производит жизнеспособной ткани (рис. 1-3), то есть метаболически похожи на больших органотипических ломтиками 15. Кроме того, это microslice модель точно соответствует реакции наблюдается следующее эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга в естественных условиях 10. 90 секунд в пробирке стимул мозга microslices с АМФК, NMDA, или глутамат вызывает те же реакции в различных молекул (например CaMKII, GluN2B и GluA1) в качестве второго периода окклюзии в естественных условиях 10 90. Это обеспечивает дополнительную проверку, что модель microslice описано здесь является допустимым метод, который может быть использован для исследования молекулярные механизмы, вовлеченные в ишемии и экзайтотоксическимность опосредованного гибель клеток.
Как и в любой экспериментальной методики, эта процедура может быть изменена, и эти изменения могут или не могут влиять на экспериментальный результат. На основе опыта, протокол подробно описано представляет оптимальные условия для генерации высокий выход тканей и microslice жизнеспособность. Этот протокол может быть адаптирован для использования в различных видов (microslices от крыс, мышей и кур были ранее успешно создана), и из любой области мозга (рис. 1-3 изображают microslices полученные из всей переднего мозга; На рисунке 4 представлены microslices полученные от коры и полосатого тела). Кроме того, толщина microslice может быть изменена от 150-350 мкм, без заметной потери жизнеспособности ломтиками. Оптимальная толщина среза составляет 250 мкм, так как это дает наибольший выход ткани, и более воспроизводимое выборки, чем для более крупных кусочков. Статистическая выборка мозговой ткани производимогоаликвоты microslices должен быть представитель ткани, из которой срезы подготовлен. Чтобы сделать это, мы должны использовать самые маленькие по размеру кусочки на аликвоты для обеспечения репрезентативной выборки ткани. Оптимальные условия для этого Было обнаружено, что толщина 250 мкм, и 1 мг ткани белка, что соответствует ~ 15-20 ломтики / аликвоты. Температура, при которой microslices должны быть прерваны и промывают исследовали путем сравнения скорости дыхания microslices генерируемых с и без охлаждения до 4 ° С. Хотя эффекты ацидоза и гипоксии может быть уменьшен, когда ткань помещают при 4 ° С, микротрубочек сборка может быть изменена, если ткань охлаждают, а затем согревали 16. Такая реорганизация цитоскелета может повлиять на функциональную активность клеток в течение некоторого периода после прогрева. Noncooled microslices имеют более высокую жизнеспособность и частоту дыхания по сравнению с охлаждением ломтиками. Кроме того, три промывки (шаги 3.1-3.3) являются достаточно для удаления большей части мусора. Период равновесия (шаг 3.4) с периодическими изменениями в буфер позволяет microslices для "восстановления" от рубки, и улучшает воспроизводимость в различных функциональных анализов (например, накопления кальция).
Метод пригоден для изучения влияния следующие различные раздражители, и после лечения с наркотиками / ингибиторов. Любое лекарственное средство / ингибитор то есть мембрана проницаема имеет потенциал быть исследован с помощью этой техники, и любой молекулы, которые могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга (или аналогичный) могут быть исследованы.
Таким образом, манипулирование каскадов, участвующих в эксайтотоксичности и ишемии-опосредованной гибели клеток сигнализации предлагают привлекательную подход к разработке лекарственных средств, которые ограничивают гибель нейронов после инсульта. Описанный метод microslice это легко применимо модель, которая позволяет исследовать этих сигнальных каскадов в неповрежденной зрелого мозгаткани. Этот метод может быть использован, чтобы помочь идентифицировать новые обработки, которые ограничивают гибель нейронов после инсульта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конфликта интересов в отношении любого из работы, проведенной в рамках этой рукописи.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследовательских средств из Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, Хантер НИИ медицинских и Университета Ньюкасла.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
