Summary
Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.
Abstract
Bütün hayvan sistemlerini kullanırken, iskemik inme gibi nöropatolojik koşullarında yer moleküler mekanizmaları, incelenmesi, zor olabilir. Örneğin, birincil ya da "nöronal benzeri 'hücre kültür sistemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sistemler, çalışma için nispeten kolay olan ve (örneğin, hücre ölümü gibi) çeşitli işlevsel sonuçlar kolayca belirlenebilir hangi faydalı model sistemleri (örneğin, eksitotoksisite aracılı hücre ölümü yollar gibi) kültürlenmiş olgunlaşmamış nöronlarda muayene sonuçları ve yollar iken zorunlu olgun beyinde gözlenen aynı veya sağlam doku değildir. Bu nedenle, olgun sinir dokuda hücresel mekanizmalar incelenebilir hangi modeller geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Bu sağlam sinir dokusunda moleküler yollarının çeşitli araştırmak için kullanılan bir in vitro teknik geliştirdik. Bu tarifnamede tarif edilen teknik, sıçan kortikal doku kullanır, ancak bu teknik doku kullanmak için adapte edilebilirya da beyin bölgelerinde (örneğin, hipokampus, striatum, vb) (örneğin, fare, tavşan, kobay ve tavuk gibi) türlerin çeşitli. Buna ek olarak, uyarılar / çeşitli tedaviler (örneğin, eksitotoksik, inhibitörlerinin uygulanması, vs) kullanılabilir. Sonuç olarak, burada tarif edilen beyin kesit modeli eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler çeşitli mekanizmalar incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Inme en sık görülen serebral kan damarı tıkalı olduğunda oluşur iskemik inme, olduğunu. Kan akımının kesilmesinden kaynaklanan doku iskemisi membran depolarizasyonunu yaygın uyancı nörotransmitter salınımına neden olur ve hücre ölümünün aktivasyonuna yol açan hücre içi kalsiyum, sürekli yükseklik 1 yollar yer alır. Bu işlem, "eksitotoksisite" olarak geçecek olan ve inme 2 de dahil olmak üzere, çeşitli patolojilerin tarafından üretilen nöronal ölümle ilgili yaygın bir yoludur edilmiştir. Eksitotoksisite ve diğer nöronal hücre ölümü kaskadı dahil olan sinyal yollarının önlenmesi, inme sonrası nöronal hasarı sınırlandırmak için cazip bir yaklaşımdır.
Bütün hayvan sistemlerini kullanırken eksitotoksisite ve iskemik inme dahil kesin moleküler mekanizmaları belirlenmesi zor olabilir. Gibi, primer embriyonik ve 'nöronal-benzeri' (örn. neuroblasto olarakma ve adenokarsinom ölümsüzleştirdi hatları) hücre kültürü sistemleri sıklıkla kullanılır. Bu modellerin temel avantajları, nispeten düşük maliyetli manipüle edilmesi kolaydır ve hücre ölümü kolayca ölçülerek kantifiye edilebilir bulunmaktadır. Ancak, sinyal yolları kültürleme 3,4 kullanılan koşullar ve olgunlaşmamış nöronlar tarafından değiştirilmiş ve çizgileri farklı reseptörleri ifade ve beyni 5-8 olgun kıyasla sinyal molekülleri olabilir ölümsüzleştirdi edilebilir. (A kokültürü sistem kullanılırsa, ya da iki) olduğu gibi beyin dokusu birbirleri ile etkileşim hücre tipleri çeşitli içeren, heterojen ise Ayrıca, kültürlü nöronlar, sadece bir hücre tipinin bir inceleme sağlar. Organotipik kesit kültürü sistemleri (beyin dokusu ince dokusu) da kullanılabilir ve bunlar, in vivo olarak bulunanlar gibi bu modeller, heterojen hücre popülasyonlarının çalışma sağlar. Bu tekniği kullanarak, ancak, bir doku sadece sınırlı bir miktarda dilimleri, her hayvandan şekilde elde edilebilirSürece ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri olarak için kültürlenebilir, ve uzun süreli kültürde orta dilim yollarının ve reseptörler ve sinyal değişikliklere neden olabilir değildir. Olgun beyin Organotipik dilimleri üretmek için kullanılabilir iken, olgunlaşmamış beyninden dilim kültüre daha uygun olan ve daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Nöronal sinyal yolları incelenebilir hangi kullanımı kolay olan sağlam olgun beyin, temsil eder ya da taklit eden modeller geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Burada, bir eksitotoksik veya iskemik zedelenmeden sonra, hücre ölümü ile ilgili moleküler mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir sağlam sinir dokusu dahil, bir in vitro bir teknik tarif edilmektedir. Bu teknik, bir deney gerçekleştirmek için gerekli hayvan sayısını azaltır, tekrarlanabilir olduğunu, ve daha büyük Organotipik dilimleri için metabolik olarak benzer şekilde davranır canlı doku üretir. Buna ek olarak, nöronal devre, hücre etkileşimleri ve postsinaptik compartment kısmen bozulmadan kalır. Kullanılan fizyolojik tampon hücre 'tekrar kapatılması' için membranların ve sağlayan hücreler kendi özgün membran direncini 9 kurtarmak için olanak sağlar. Bu beyin dilim modeli sadakatle eksitotoksikliği bağlı beyin yaralanmaları 10 aşağıdaki gözlenen tepkiler taklit edebilir, ve inme dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler NSW Hayvancılık Araştırma Yasası, NSW Hayvancılık Araştırma Yönetmeliği ve Uygulama için Avustralya Kanunu dahil ilgili kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yanı sıra Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi onayı ile yapılır Bakım ve Bilimsel Amaçlı Hayvan kullanımı.
1.. Beyin Doku diseksiyonu
- Başları kesilerek on iki haftalık erkek fareleri kurban. Sıçanlar ya da çarpıcı ve başları kesilerek feda edilebilir ya da ilk izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5-2 bakım)% 70 N2 ve% 30 O2 ile anestezi edilmesi ve daha sonra başları kesildi.
- Mümkün olduğunca hızlı kafatası beyin kaldırmak (ideal, bu az 2 dakika içinde yapılmalıdır).
- Serbest el diseksiyon ile korteks kaldırmak. Mai şekilde diseksiyon mümkün beyne az hasar ile, mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdırdilim bütünlüğünü ntain.
- Herhangi bir artık deri kaldırmak için, vs kürk, kan, 37 ° C'de Krebs tamponu (118 mM sodyum klorid, 4.7 mM potasyum klorür, 1.3 mM kalsiyum klorür, az miktarda (3-5 mi) içinde beyin batırmak 1.2 mM potasyum dihidrojen fosfat, 1.2 mM magnezyum sülfat, 25 mM sodyum hidrojen karbonat, 11.7 mM glikoz, 0.03 mM disodyum etilendiamin tetraasetik asit (EDTA),% 95 oksijen /% 5 karbon dioksit (karbojen), pH 7.4) ile dengelenmiştir.
2. Microslices hazırlanması
- Filtre kağıdı iki dilim yerleştirilir ve sıcak Krebs tamponu ile nemlendirilmiş hangi bir McIlwain helikopter sahnede beyin yerleştirin. Beyin ve sıcak Krebs tamponu ile ıslatılmış filtre kağıdı Ol, ama çok ıslak olmayan beyin etrafında kaymasına neden olabilir kağıdın yüzeyinde serbest sıvı olduğu.
- 250 mikron koronal bölüme beyin dilimleyin. Besin, oksijen ve atık maddeler inci gibinormal olarak kan dolaşımı izole edilmiş sinir dokuda dokuyu saran bir sıvı ile değiştirilir ile değiştirilir de, dilimlerin büyüklüğü yeterli oksijen ve besin alışverişi yapılmasına izin vermek kalınlığı 400 um 'den fazla olmamalıdır.
- McIlwain evre 90 ° çevirin.
- 250 mikron sagital dilimlere beynini dilimleyin. Burada, bu beyin kesitleri (değişken uzunlukta, 250 um x 250 um dilimleri dokusunun kalınlığına bağlı olarak) microslices olarak adlandırılır.
- (El Krebs tampon miktarı doku miktarına bağlıdır) 10-15 ml 37 ° C Krebs tamponu ile bir yuvarlak tabanlı tüp içine microslices yerleştirin.
3. Microslices ekilibre
- Yavaşça bireysel microslices askıya kadar ajitasyon, ve sonra onları yerçekimi altında yerleşmek için izin verir.
- Dikkatle nedeniyle askıya hücre enkaz bulutlu olacak, süpernatant kaldırmak ve taze 37 ° C 10 ml ekleyinKrebs tampon tüpüne.
- Enkaz çoğunluğunun çıkarılması ile sonuçlanacaktır ki, bu yıkama işlemi dört kez tekrarlayın.
- Bunu takiben, nazik sallama / ters ile, 37 ° C'de dengeye microslices, ve Krebs, toplam 1 saat boyunca her 15 dakikada bir tampon değiştirin.
- Bu anda, 2 ml taze 37 ° C Krebs tampon ekleyin ve düz dipli polistiren 15-20 microslices (microslice süspansiyonu 150 ul) aktarmak tarafından oluşturulabilir yumuşatılmış kenarları (ile ekstra geniş çaplı bir pipet kullanarak 5 ml tüpler P1000 ucunun ucundan ~ 2 mm kesme). Her microslice oksijenli atmosfere bir kaç milimetre daha fazla değildir, böylece, tek kat olarak borunun tabanı üzerinde eşit microslices yayın.
4. Excitotoxic Stimülasyon
- 37 ° C'de inkübe microslices ve sürekli pozisyonu olan bir gaz hattı kullanarak, 150 ul microslice süspansiyon yüzeyi üzerine geçmek karbojensadece microslice süspansiyonuna (mekanik aksamasını önlemek için) yüzeyinin üstünde ed.
- (: Nihai konsantrasyon 2.5 mM glutamat + 50 uM glisin eksitotoksik uyarıcı) ya da tek başına 150 ul Krebs tamponu (Stimülasyon kontrol) 150 ul 5 mM glutamat + 100 Krebs tamponu içerisinde uM glisin ile ya microslices tedavi. Çeşitli uyaranlara bu aşamada kullanılabilir (de dahil olmak üzere, ancak bunlarla sınırlı değildir, AMPA, NMDA + glisin, KCl depolarizasyon ve oksijen / glikoz yoksunluğu).
- Çeşitli zamanlarda post-stimülasyonu (0, 30, 60, 90, 120 ve 300 saniye) de inkübasyon çözüm çıkarın ve buz soğukluğunda homojenizasyon tampon maddesi (30 mM Tris, pH 7.4, 1 mM etilen glikol içinde 300 ul ile değiştirin tetraasetik asit, 4 mM EDTA, 100 uM amonyum molibdat, 5 mM sodyum pirofosfat, 25 mM sodyum fluorür, 1 mM sodyum ortovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, adet tam proteaz inhibitör kokteyli).
- Bir cam-Teflon Dounce Homojenizatörü kullanılarak, buz üzerinde homojenize microslices(20 vuruş, 700 rpm).
- Gibi -80 ° C arasında ve çeşitli sinyal verici moleküllere, ölüm moleküller saklayın homojen western blot ile ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedür kullanılarak üretilen Microslices uygun olan ve çeşitli türlerin (örneğin, sıçan, fare ve tavuk) microslices üretmek için kullanılabilir. Canlılığı üç bağımsız tedbirler faydalanılmıştır: solunum oranı (Şekil 1), adenin nükleotid oranları (Şekil 2), ve doku potasyum içeriği (Şekil 3). Bu önlemleri kullanarak, microslices en az 2 saat sonrası kuşak için geçerli kalır ortaya konmuştur.
Brain microslices uyaranların çeşitli sonra, çeşitli sinyal verici moleküllere incelemek için kullanılabilir (örneğin, KCl depolarizasyon [Şekil 4], AMPA, NMDA glutamat uyarım 10), ve aynı zamanda birden fazla beyin bölgeleri arasında hücre sinyal molekülleri cevapları karşılaştırmak için kullanılabilir (Şekil 4). Buna ek olarak, bu moleküller ile ilgili çeşitli önleyicileri / ilaç tedavilerinin etkisi de örneğin kinaz olarak (incelenebilir 10 inhibitörleri, glutamat reseptörü agonistleri 11, kiskalik asit 12).
Şekil 1. Tavuk ön beyinlerinden microslices arasında Solunum oranları aşağıdaki gibi beyin dokusunun solunum oranları hesaplanmıştır:. Solüsyonu içinde oksijenin mol ile çarpılır (deneyin başlangıcında ve sonunda oksijen elektrod okumalar arasındaki fark) tüketilen oksijen miktarı, bölünmüş kuluçka zaman (saat) ve protein miktarı (mg). Izole memeli serebral korteks tipik solunum oranları olağan koşullar altında 9 55-80 ľmol O 2 / g taze ağırlık / saat arasındadır. n = 9.
p_upload/51291/51291fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51291/51291fig2.jpg "/>
.. Şekil 2, tavuk ön beyinlerinden microslices içinde adenin nükleotid varlığı ATP ölçme Örnek HPLC iz: gibi gerçekleştirilmiştir ADP oranları, daha önce tarif edilen 13,. ATP düzeyleri ve ADP artmış seviyeleri, apoptotik ve nekrotik hücre 14 için karakteristik olan azalma ise yüksek ve düşük ADP ATP seviyeleri, genellikle, uygun bir hücrede bulunurlar. Tipik ATP: microslices of ADP oranları 3:01-06:01 değişmiştir, ve daha büyük 2 saat boyunca bu seviyede muhafaza edilmiştir.
Şekil 3,. Doku K + olgunlaşmamış tavuk ön beyin beyin microslices içeriği. Doku potasyum belirlenmesi bir bizizcanlılığı eful ölçü, bir doku kimyasal ve fizyolojik faaliyetlerin çok normal hücre içinde potasyum içeriği 9 gerekir zar potansiyeli, bağlıdır. Microslices hemen sonra kesme K + içermeyen tampon maddesi içinde yıkandı olduğunda, doku K +, sadece arka planı (zaman 0) üzerinde olan seviyelere azalmıştı. Bununla birlikte, Krebs tamponu ile inkübasyon üzerine, daha sonra, hızlı bir şekilde microslices çevreleyen ortamdan K + birikmiş ve 5 dakika içinde ıslah edilmemiş microslices için olana benzer bir sabit durum seviyesi (yani microslices yıkandı ve normal tamponu) ulaşmıştır. 20 dakika inkübasyondan sonra ouabain (0.2 mM) ve EGTA (2 mM) ilavesi doku K + içerik 8 dakika içinde 0 azalmaya neden oldu. Bu microslices normalde aktif K + pompa gösterir ve doku K + düzeyleri ölü doku veya interstisyel alanlarda sıkışıp K + nedeniyle olmadığını. n = 4.
Şekil 4,. KCI ile depolarizasyon aşağıdaki GluN2B ve GluA1 fosforilasyon zaman akışı. Microslices erkek sıçan striatum ve duyusal korteksinden elde edildi (n = 8), yüksek K + homojenize Krebs tampon kullanılarak depolarize, ve (A) GluN2B için incelendi fosforilasyon (Ser1303 at) ve çeşitli zamanlarda sonrası uyarım (0-300 g) de western blot (B) GluA1 fosforilasyon (Ser845 at). Fosforilasyon düzeyleri toplam GluN2B ve GluA1 ifadesi (yani fosforilasyon / toplam ifadesi) normalleştirilmiş. * Beyin bölgelerinde (p <0.05) arasında anlamlı bir gösterir. KCI ile depolarizasyon S1303 de GluN2B ve GluA1 reseptör fosforilasyonu ile sonuçlanmıştır veSırasıyla S845. S845 de GluA1 fosforilasyon oranı korteks ve striatum içindeki aynı iken de S1303 GluN2B fosforilasyon oranı, korteks ve striatum arasında değişmiştir. Daha sonraki deneylerde, bu çok fonksiyonlu kinaz düzenlenmesi diferansiyel nedeniyle olduğunu göstermiştir, kalsiyum / protein S1303 de GluN2B fosforilleyen kinaz II (CaMKII), fakat S845 10 değil GluA1 kalmodülin uyarılmaktadır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, sağlam olgun beyin dokusunda eksitotoksisite ve iskemiye bağlı hücre ölümü ile ilgili moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir microslices üretilmesi için bir in vitro bir teknik tarif edilmektedir. Bu teknik, uygun bir doku (Şekil 1-3), yani daha büyük bir Organotipik dilimleri 15 metabolik benzer üretir. Ayrıca, bu microslice modeli yakından vivo 10 eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı aşağıdaki gözlenen tepki karşılık gelir. AMPA, NMDA veya glutamat ile beyin microslices in vitro uyarıcı bir 90 saniye in vivo 10 oklüzyon bir 90 saniyelik bir süre olarak moleküllerin çeşitli aynı tepkileri (örneğin CaMKII, GluN2B ve GluA1) indükler. Bu burada tarif microslice modeli iskemi ve excitotoxic katılan moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek geçerli bir yöntem olduğunu ileri doğrulama sağlarhücre ölümünü Sığ-aracılı.
Herhangi bir deney tekniği ile olduğu gibi, bu işlem çeşitli olabilir, ve bu değişiklikler ya da deneysel sonuçlarını etkilemez olabilir. Tecrübeye dayanarak, bu tarifnamede ayrıntılı olarak açıklanan protokol, en yüksek verimi ve doku canlılığını microslice üretilmesi için en uygun şartları temsil eder. Bu protokol, türler (fare, sıçan, tavuk ve microslices önceden başarılı bir şekilde elde edilmiştir), çeşitli kullanım için uyarlanabilir ve herhangi bir beyin bölgesinden (Şekiller 1-3 bütün ön beyin türetilmiş microslices tasvir, Şekil 4, türetilmiş microslices tasvir korteks ve striatum). Buna ek olarak, kalınlık microslice dilimlerin canlılığında herhangi önemli bir kayıp olmadan, 150-350 um ikinci değiştirilebilir. Bu daha büyük bir dilim için daha doku yüksek verim ve daha yeniden üretilebilir bir örnekleme üretir gibi uygun kesit kalınlığı, 250 mikron. Tarafından üretilen beyin dokusu istatistiksel örneklememicroslices alikuotları dilimler hazırlanmıştır hangi dokuda temsili olması gerekir. Bunu yapmak için, bir doku temsil örnekleme sağlamak kısım başına en küçük boyutlu dilimlerini kullanmak gerekir. Bunun için en uygun şartlar 250 um kalınlığında olduğu bulunmuştur, ve ~ 15-20 dilim / kısım gelen doku proteininin 1 mg edilmiştir. Microslices kıyılmış ve yıkandı gereken sıcaklık ile oluşturulan microslices respirasyon oranlarını karşılaştırarak ve 4 ° C'ye kadar soğutulmadan araştırılmıştır Doku, 4 ° C de yerleştirildiğinde, asidoz ve oksijen etkisi azalabilir, ancak, mikro tüp takılması doku soğutulmuş ise değiştirilmiş ve daha sonra 16 rewarmed edilebilir. Bu hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi ısıtıldıktan sonra bir süre için bir hücre fonksiyonel aktivitesini etkileyebilir. Soğutmalı dilimlerine göre Noncooled microslices yüksek canlılığı ve solunum oranına sahip. Ayrıca, üç yıkama (3,1-3,3 adımlar) yeterliyken vardırcient enkaz en kaldırın. Tampon içinde periyodik değişiklik ile dengeleme süresi (adım 3.4) microslices ikinci kesme 'kurtarmak' sağlar ve (örneğin, kalsiyum birikimi gibi) çeşitli işlevsel tahlillerde tekrarlanabilirlik artırır.
Yöntem, çeşitli uyaranlara sonra etkilerini incelemek için uygundur ve ilaç / inhibitörleri ile tedavi edildikten sonra. Zar geçirgen olan herhangi bir ilaç / inhibitörü, bu teknik ve western blot (veya benzeri) ile tespit edilebilir herhangi bir molekül araştırılabilir ile incelenecek potansiyeline sahiptir.
Özet olarak, eksitotoksiklik ve iskemiye bağlı hücre ölümüne katılan sinyal basamaklarının manipülasyon inme sonrası nöronal hücre ölümünü sınırlamak ilaçların geliştirilmesi için çekici bir yaklaşım sunmaktadır. Açıklanan microslice yöntem sağlam olgun beyinde bu sinyal iletim soruşturma sağlar kolay uygulanabilir bir modeldoku. Bu teknik, aşağıdaki inme, nöronal hücre ölümünü sınırlama yeni tedaviler tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu yazının kapsamında yürütülen çalışmaların herhangi bir ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü ve Newcastle Üniversitesi'nden araştırma fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H.
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
