우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
전체 동물 체제를 사용하는 경우 허혈성 뇌졸중과 같은 신경 병리학 적 조건에 관련된 분자 메커니즘을, 검사, 어려울 수 있습니다. 예컨대, 기본 또는 '신경 조의'세포 배양 시스템은 일반적으로 이용된다. 이러한 시스템은 작동 비교적 용이하며, (예컨대 세포사와 같은) 다양한 기능적 결과를 쉽게 정량화 될 수있는 유용한 모델 시스템 (예 흥분 독성 - 매개 세포 사멸 경로 등) 배양 된 미숙 뉴런의 조사 결과와 경로이지만 반드시 성숙한 뇌에서 관찰 된 것과 같은, 또는 손상 조직에 없습니다. 따라서, 성숙한 신경 조직의 세포 메커니즘을 조사 할 수있는 모델을 개발할 필요가있다. 우리는 신경 조직 손상의 분자 경로의 다양성을 조사하기 위해 사용될 수있는 시험 관내 기술을 개발했다. 설명 된 기술은 본 명세서 쥐 대뇌 피질 조직을 활용하지만,이 기술은 조직을 사용하도록 구성 될 수있다또는 뇌 영역 (예를 들어, 해마, 선조체, 등) (예 : 마우스, 토끼, 기니 돼지, 닭 등) 종의 다양 한에서. 또한, 자극 / 치료의 다양한 (예를 들어, 흥분 독성, 억제제의 투여 등)을 사용할 수있다. 결론적으로, 본원에 기재된 뇌 슬라이스 모델 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘의 다양성을 조사 할 수있다.
서론
뇌졸중의 가장 일반적인 형태는 대뇌 혈관 폐색 될 때 발생하는 허혈성 뇌졸중이다. 혈액의 흐름 중단 한 결과 조직의 국소 빈혈은 세포막의 탈분극 확산, 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 일으키고, 세포 죽음의 활성화에 이르게 세포 내 칼슘의 지속적인 상승은 1 경로. 이 과정은 '흥분 독성 (excitotoxicity)'라고하고, 스트로크 2 등의 병리의 다양한 의해 생성 된 신경 세포의 죽음에 관련된 일반적인 경로입니다되었습니다. 흥분 독성 및 다른 신경 세포 죽음의 계곡에 관련된 신호 전달 경로의 억제는 뇌졸중 다음 신경 세포의 손상을 제한 할 수있는 매력적인 방법입니다.
동물 전체 시스템을 사용할 때 흥분 독성 (excitotoxicity)과 허혈성 뇌졸중에 관련된 정확한 분자 메커니즘을 확인하는 것은 어려울 수 있습니다. 같은 차 배아와 '신경과 같은'(예를 들어 neuroblasto로엄마와 선암 불후의 선)는 세포 배양 시스템은 자주 사용된다. 이러한 모델의 주요 이점들은, 상대적으로 비용 효과적인 쉽게 조작 할 수 있으며 세포 사멸이 용이하고 정량 측정 할 수 있다는있다. 그러나, 신호 전달 경로는 배양 3,4를 사용 조건 및 ....
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프로토콜
모든 절차는 NSW 동물 연구 법, NSW 동물 연구 규정 및 대한 연습의 호주 코드를 포함하여 관련 지침 및 규정에 따라뿐만 아니라 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에서 승인을 수행 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용.
1. 뇌 조직의 해부
- 잘린 십이주 된 수컷 쥐를 희생. 쥐도 근사하고 잘린 희생 할 수있다, 또는 최초의 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 % 유지) 70 % N 2 30 %의 O 2 마취 할 수 있고, 그 목을 베.
- 가능한 빨리 두개골에서 뇌를 제거 (이상적으로,이보다 2 분에 수행해야합니다).
- 프리 핸드의 해부에 의해 피질을 제거합니다. 마이하도록 절개 가능한 뇌 적게 손상, 가능한 최단 시간 내에 수행되어야슬라이스의 무결성을 ntain.
- 잔류 피부를 제거하기 위해, 기타 퍼, 혈액,,, 37 ° C 크렙스 완충액 (118 mM 염화나트륨, 4.7 mM의 염화칼륨, 1.3 mM의 염화칼슘의 소량 (3-5 ml)에 뇌를 담가 1.2 ㎜의 인산이 수소 칼륨, 1.2 mM의 황산 마그네슘, 25 mM의 나트륨, 탄산 수소, 11.7 mM의 글루코오스, 0.03 mM의 디 나트륨 ....
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결과
이 절차를 사용하여 생성 Microslices가 실용적이며, 종의 다양성 (예를 들어, 래트, 마우스, 닭) microslices을 생성하기 위하여 사용될 수있다. 생존의 세 가지 독립적 인 조치를 활용 한 : 호흡 속도 (그림 1), 아데닌 뉴클레오티드 비율 (그림 2), 및 조직의 칼륨 함량 (그림 3). 이러한 방법을 사용하면, microslices 적어도 2 시간 후 생성을 위해 실행 가능한 남아 있다고 입증되었다.
뇌 microslices는 다양한 자극에 따라 다양한 신호 전달 분자를 조사하는데 사용될 수있다 (예 KCl을 탈분극 [도 4], AMPA는 NMDA 글루타메이트 자극 (10)), 또한 여러 뇌 영역 간의 세포 신호 전달 분자의 반응을 비교하기 위하여 사용될 수있다 (그림 4).
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토론
여기서, 본래 성숙한 뇌 조직에서 흥분 독성 및 허혈 - 매개 세포 사멸에 관여하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수 microslices의 생성을위한 시험 관내 기술이 설명된다. 이 기술은 실행 가능한 조직 (1-3 피규어), 즉 큰의 Organotypic 조각 15 대사와 유사하다을 생산하고 있습니다. 또한,이 microslice 모델은 밀접하게 생체 내 10 흥분 독성 매개 뇌 손상 다음과 같은 관찰 된 응답에 해당합니다. AMPA, NMDA 또는 글루타민산 염과 뇌 microslices의 생체 자극에 90 번째는 생체 내 10에있는 폐쇄 90초 기간으로 분자의 다양한 동일한 응답 (예를 들어, CaMKII을, GluN2B 및 GluA1)를 유도한다. 이는 본원에 기재된 microslice 모델 허혈 및 흥분 독성에 관여하는 분자 메커니즘을 조사.......
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공개 사항
저자는이 논문에서 수행 된 작업의에 대한 관심의 충돌이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 헌터 의학 연구소, 뉴캐슬 대학에서 연구 기금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
등
장비 집게, 가위, 핀셋, 가되는
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 동물의 목을 베는 데 사용되는 | 단두대 | ||
| 뇌 | 제거 및 해부를 위한 수술 | ||
| McIlwain 헬리콥터 | McIlwain 헬기는 Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments 및 Ted Pella를 포함한 다양한 회사에서 제조/유통합니다. | 100-400 µ을 생성하는 데 사용됩니다. M 뇌 절편. | |
| 라운드 바닥 플라스틱 튜브 | Greiner | ||
| 물 목욕 | 조직을 37 °로 유지하기 위해; C | ||
| 가습기/공기에 쐬는 기구 | 습한, 산소가 함유된 환경에 있는 microslices를 지키기 위하여 이용 | ||
| 편평한 바닥 폴리스티렌 관 | Nunc | ||
| Dounce 균질화기 |
참고문헌
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weis....
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재인쇄 및 허가
