Summary
Nous avons développé un modèle de tranche de cerveau qui peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée. Cette technique génère tissu cerveau mature viable et réduit le nombre d'animaux nécessaires à l'expérimentation, tout en gardant la circuiterie neuronale, interactions cellulaires, et des compartiments post-synaptiques en partie intact.
Abstract
Examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans les conditions neuropathologiques, tels que l'AVC ischémique, il peut être difficile lors de l'utilisation des systèmes animaux entiers. Comme les systèmes de culture cellulaire »neuronale comme 'tel, primaire ou sont couramment utilisés. Bien que ces systèmes sont relativement faciles à travailler avec, et des systèmes de modèles utiles dans lequel divers résultats fonctionnels (tels que la mort cellulaire) peuvent être facilement quantifiés, les résultats examinés et les voies dans les neurones immatures cultivés (tels que voies de mort cellulaire excitotoxicité médiée) ne sont pas nécessairement les mêmes que ceux observés dans le cerveau mature, ou dans un tissu intact. Par conséquent, il est nécessaire de développer des modèles dans lesquels les mécanismes cellulaires dans les tissus nerveux matures peuvent être examinés. Nous avons mis au point une technique in vitro qui peut être utilisé pour étudier une variété de voies moléculaires dans le tissu nerveux intact. La technique décrite ici utilise le tissu cortical de rat, mais cette technique peut être adapté pour utiliser un tissuà partir d'une variété d'espèces (par exemple, la souris, le lapin, le cochon Guinée, et le poulet) ou des régions du cerveau (par exemple, l'hippocampe, le striatum, etc.) En outre, une variété de stimulations / traitements peut être utilisée (par exemple, excitotoxique, l'administration d'inhibiteurs, etc.) En conclusion, le modèle de tranche de cerveau décrit ici peut être utilisé pour examiner une variété de mécanismes moléculaires impliqués dans les lésions cérébrales excitotoxicité médiée.
Introduction
La forme la plus courante d'AVC est un accident ischémique cérébral, qui se produit quand un vaisseau sanguin cérébral devient occlus. L'ischémie tissulaire qui résulte de l'arrêt de la circulation sanguine provoque une dépolarisation des membranes généralisée, la libération des neurotransmetteurs excitateurs, et une élévation soutenue de calcium intracellulaire, qui conduit à l'activation de la mort cellulaire cheminements de 1. Ce processus a été appelé «excitotoxicité», et est une voie commune impliqué dans la mort neuronale produite par une variété de pathologies, y compris la course 2. L'inhibition des voies de signalisation impliquées dans l'excitotoxicité et autres cascades de mort des cellules neuronales est une approche intéressante pour limiter les dégâts neuronale après un AVC.
Identifier les mécanismes moléculaires précis impliqués dans l'excitotoxicité et accident vasculaire cérébral ischémique peut être difficile lors de l'utilisation des systèmes animaux entiers. En tant que tel, embryonnaire primaire et «neuronale comme '(par exemple neuroblastoma et adénocarcinome lignées immortalisées) des systèmes de culture de cellules sont souvent utilisés. Les principaux avantages de ces modèles est qu'ils sont faciles à manipuler, relativement rentable, et la mort cellulaire peuvent être facilement mesurés et quantifiés. Cependant, les voies de signalisation peuvent être modifiées par les conditions de culture utilisées, 3,4 et les neurones immatures et immortalisés lignes peuvent exprimer différents récepteurs et des molécules de signalisation par rapport à mûrir cerveau 5-8. En outre, des cultures de neurones permettent seulement l'examen d'un type de cellule (ou deux, si un système de co-culture est utilisée), tandis que le tissu cérébral intact est hétérogène, contenant une variété de types de cellules qui interagissent les uns avec les autres. Les systèmes de culture de tranches organotypiques minces (explants de tissu cérébral) sont également utilisés, et ces modèles permettent l'étude de populations hétérogènes de cellules tels qu'ils sont trouvés in vivo. Cependant, seule une quantité limitée de tissu peut être obtenue à partir de chaque animal pour l'utilisation de cette technique, des tranches peutpas être cultivées pendant aussi longtemps que des lignées cellulaires immortalisées, et au milieu de culture à long terme peut conduire à des altérations dans les voies de signalisation des récepteurs et dans les tranches. Alors que le cerveau adulte peut être utilisé pour générer des tranches organotypiques, tranches de cerveau immature se prêtent mieux à la culture, et sont le plus souvent utilisés. Il est donc nécessaire de développer des modèles qui imitent ou représentent cerveau mature intacte, qui sont faciles à utiliser, dans laquelle les voies de signalisation neuronales peuvent être examinées.
Ici, une technique in vitro portant sur des tissus nerveux intact qui peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans la mort cellulaire suite à une insulte excitotoxique ou ischémique est décrite. Cette technique permet de réduire le nombre d'animaux requis pour effectuer une expérience, est reproductible, et génère des tissus viables qui se comporte d'une manière similaire à métaboliquement plus grandes tranches organotypiques. En outre, le circuit neuronal, les interactions cellulaires, et co postsynaptiquempartment reste partiellement intact. Le tampon physiologique utilisé permet les membranes cellulaires pour «refermeture», et permet aux cellules de retrouver leur résistance de la membrane d'origine 9. Ce modèle de tranche de cerveau est capable d'imiter fidèlement réponses observées suivant excitotoxicité médiée par des lésions cérébrales 10, et peut être utilisé pour examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans la course.
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Protocol
Toutes les procédures sont exécutées avec l'approbation de l'Université de Newcastle protection des animaux et de l'éthique, ainsi que conformément aux directives et règlements pertinents, y compris la Loi NSW recherche sur les animaux, le règlement Animal Research NSW, et le Code australien de pratique pour la Entretien et utilisation des animaux à des fins scientifiques.
Une. Dissection du tissu cérébral
- Sacrifiez vieux douze semaines chez les rats mâles par décapitation. Les rats peuvent soit être sacrifiés par décapitation et magnifique, ou peuvent être d'abord anesthésiés avec de l'isoflurane (5% induction, entretien 1,5-2%) dans 70% de N 2 et 30% O 2, puis décapités.
- Retirez le cerveau du crâne aussi rapidement que possible (idéalement, ce devrait être réalisée en moins de 2 minutes).
- Retirez le cortex par dissection main-libre. La dissection doit être effectuée dans le minimum de temps possible, avec le moins de dommages au cerveau que possible afin de Maintain l'intégrité des tranches.
- Pour enlever toute la peau résiduelle, la fourrure, le sang, etc, plonger le cerveau dans une petite quantité (3-5 ml) de 37 ° tampon C Krebs (chlorure 118 mM de sodium, 4,7 mM de chlorure de potassium, 1,3 mM de chlorure de calcium, 1,2 mM de dihydrogénophosphate de potassium, sulfate de magnésium 1,2 mM, du bicarbonate de sodium 25 mM, 11,7 mM de glucose, l'acide éthylènediaminetétraacétique disodique mM 0,03 (EDTA), équilibrée avec 95% d'oxygène / 5% de dioxyde de carbone (carbogène), pH 7,4).
2. Préparation de Microslices
- Placez le cerveau sur la scène d'un hacheur McIlwain sur lequel deux tranches de papier filtre ont été placés et humidifié avec un tampon Krebs chaud. Gardez le cerveau et le papier filtre imbibé de tampon Krebs chaud, mais pas si humide qu'il ya du liquide libre sur la surface du papier qui peut causer le cerveau à glisser autour.
- Trancher le cerveau en 250 um coupes coronales. Comme les nutriments, l'oxygène et les déchets eà normalement échangées avec l'alimentation en sang sont échangés avec un fluide qui entoure le tissu dans le tissu neural d'isolement, la taille des tranches ne doit pas être supérieure à 400 pm d'épaisseur pour permettre l'oxygénation et l'échange des nutriments suffisants pour se produire.
- Tourner la scène McIlwain 90 °.
- Trancher cerveaux dans 250 um coupes sagittales. Ici, ces coupes de cerveau (250 um x 250 um tranches de longueur variable en fonction de l'épaisseur du tissu) sont appelés microslices.
- Placez les microslices dans un tube à fond rond avec 10-15 ml 37 ° C tampon Krebs (la quantité de tampon Krebs utilisée dépendra de la quantité de tissu).
3. L'équilibrage de Microslices
- Agiter doucement jusqu'à ce que microslices individuelles sont suspendues, et alors leur permettre de régler par gravité.
- Retirez délicatement le surnageant, qui sera trouble en raison de débris de cellules en suspension, et ajouter 10 ml frais 37 ° CTampon de Krebs au tube.
- Répéter cette opération de lavage quatre fois, ce qui se traduira par la suppression de la majorité des débris.
- Suite à cela, équilibrer les microslices à 37 ° C avec agitation douce / inversion, et changer le tampon Krebs toutes les 15 min pendant 1 heure au total.
- A ce moment, ajouter 2 ml de tampon 37 ° C Krebs frais, et transférer 15-20 microslices (150 pi de MicroSlice suspension) au polystyrène fond plat tubes de 5 ml en utilisant un large pourboire supplémentaire de la pipette d'alésage avec angles arrondis (qui peuvent être créées par coupe ~ 2 mm de l'extrémité d'une pointe de P1000). Etaler les microslices uniforme sur le fond du tube en une seule couche, de sorte que chaque MicroSlice n'est pas à plus de quelques millimètres de l'atmosphère oxygénée.
4. Stimulation excitotoxiques
- Incuber les microslices à 37 ° C, et de passer sans cesse CARBOGEN sur la surface de la suspension de 150 pi de MicroSlice, en utilisant une conduite de gaz qui est la positioned juste au-dessus de la surface de la suspension de MicroSlice (pour éviter une rupture mécanique).
- Traiter microslices soit avec mM glutamate 150 pi 5 + 100 uM de glycine dans du tampon Krebs (stimulus excitotoxic: concentration finale de 2,5 mM glutamate + 50 uM glycine) ou 150 pi de tampon Krebs seul (contrôle non stimulé). Une variété de stimuli peut être utilisé à cette étape (y compris, mais sans s'y limiter, l'AMPA, NMDA + glycine, KCl dépolarisation, et de l'oxygène / privation de glucose).
- Retirer la solution d'incubation à différents moments post-stimulation (0, 30, 60, 90, 120 et 300 sec), et la remplacer par 300 ul d'homogénéisation du tampon refroidi à la glace (Tris 30 mM, pH 7,4, 1 mM d'éthylène glycol l'acide tétra-acétique, 4 mM d'EDTA, 100 pM de molybdate d'ammonium, le pyrophosphate de sodium 5 mM, fluorure de sodium 25 mM, orthovanadate de sodium à 1 mM, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, cocktail complet d'inhibiteur de protease).
- Homogénéiser microslices sur la glace, en utilisant un verre Téflon Dounce Homogenizer(20 coups; 700 rpm).
- homogénats de conserver à -80 ° C, et diverses molécules de signalisation, des molécules de la mort, etc peuvent être mesurés par western blot.
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Representative Results
Microslices générés en utilisant cette procédure sont viables, et une variété d'espèces (par exemple, le rat, la souris et le poulet) peuvent être utilisés pour produire microslices. Trois mesures indépendantes de viabilité ont été utilisés: le taux de respiration (Figure 1), les ratios de nucléotides adénine (figure 2), et la teneur en potassium des tissus (Figure 3). Grâce à ces mesures, il a été démontré que microslices restent viables pendant au moins 2 heures après la génération.
microslices cérébrales peuvent être utilisés pour examiner diverses molécules de signalisation, la suite d'une variété de stimuli (par exemple, KCl dépolarisation [Figure 4], AMPA, NMDA, la stimulation par le glutamate 10), et peut également être utilisé pour comparer les réponses des molécules de signalisation de la cellule entre plusieurs régions du cerveau (Figure 4). En outre, l'effet de divers traitements inhibiteurs / des médicaments sur ces molécules peut également être consulté (comme la kinase Les inhibiteurs 10, les agonistes des récepteurs du glutamate, de l'acide 11 quisqualique 12).
Figure 1. Les taux de respiration de microslices du cerveau antérieur de poulet Les taux de tissu cérébral de respiration ont été calculés comme suit:. la quantité d'oxygène consommée (différence entre les lectures de l'électrode à oxygène au début et à la fin de l'expérience), multiplié par le nombre de moles d'oxygène en solution, répartis par le temps d'incubation (heures) et la quantité de protéine (mg). Taux de respiration typiques de isolé cortex cérébral des mammifères sont entre 55-80 pmol O 2 / g en poids frais / h dans des conditions normales 9. n = 9.
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.. Figure 2 Présence de nucléotides d'adénine dans microslices du cerveau antérieur de poulet Représentant HPLC trace mesurer ATP: ADP rapports, réalisés comme décrit précédemment 13. Haute ATP et ADP niveaux faibles sont habituellement trouvés dans les cellules viables, alors que la diminution des taux d'ATP et l'augmentation des niveaux d'ADP sont caractéristiques des cellules apoptotiques et nécrotiques 14. Typique ATP: ADP ratios de microslices varier 3:01-6:01, et ont été maintenus à ces niveaux pendant plus de 2 heures.
Figure 3. Tissue K + contenu de microslices cérébrales de cerveau antérieur de poulet immature. La détermination de potassium tissulaire est un nousmesure eful de viabilité, comme bon nombre des activités chimiques et physiologiques d'un tissu dépendent de potentiel de membrane, ce qui nécessite une teneur en potassium intracellulaire normale 9. Lorsque microslices ont été lavées dans du tampon + sans K immédiatement après hacher, tissu K + a été épuisée à des niveaux qui étaient juste au-dessus de fond (temps 0). Cependant, lors de l'incubation ultérieure avec un tampon Krebs, les microslices rapidement accumulés K + du milieu environnant, et à moins de 5 min, ils avaient atteint un niveau de l'état d'équilibre semblable à celle de microslices non traités (c.-à-microslices lavées et incubées dans un tampon normal). L'addition de ouabaïne (0,2 mM) et de l'EGTA (2 mM) après 20 minutes d'incubation du tissu provoqué K + contenu de refuser de 0 à moins de 8 min. Ceci démontre que les microslices normalement pompent activement K +, et que les niveaux tissulaires K + ne sont pas dues à K + piégé dans les tissus morts ou des espaces interstitiels. n = 4.
Figure 4. Cours Temps de GluN2B et GluA1 phosphorylation suivante dépolarisation au KCl. Microslices été générée à partir du striatum et du cortex sensoriel de rats mâles (n = 8), en utilisant une grande dépolarisation K + Krebs tampon, homogénéisé, et examiné pour (A) GluN2B phosphorylation (à Ser1303) et (B) la phosphorylation de GluA1 (à Ser845) par western blot à différents moments post-stimulation (0-300 sec). niveaux de phosphorylation sont normalisées à GluN2B totale et l'expression de GluA1 (c.-à-phosphorylation / expression totale). * Indique la signification statistique entre les régions du cerveau (p <0,05). Dépolarisation au KCl a donné lieu à la phosphorylation de GluN2B et GluA1 récepteurs à S1303 etS845, respectivement. Le taux de phosphorylation à GluN2B S1303 variait entre cortex et le striatum, alors que le taux de phosphorylation GluA1 au S845 était le même dans le cortex et le striatum. Dans les expériences suivantes, nous avons montré que cela est dû à une différence de régulation de la kinase multifonctionnelle, calcium / calmoduline stimulée par la protéine kinase II (CaMKII), qui phosphoryle GluN2B au S1303, mais pas GluA1 au S845 10. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Ici, une technique in vitro pour la génération de microslices qui peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l'excitotoxicité et de mort cellulaire médiée par l'ischémie dans un tissu de cerveau mature intact est décrite. Cette technique produit un tissu viable (figures 1-3), qui est métaboliquement semblable à de plus grandes tranches organotypiques 15. En outre, ce modèle de MicroSlice correspond étroitement à la réponse observée après excitotoxicité médiée par des lésions cérébrales in vivo 10. A 90 secondes de stimulation in vitro de microslices cérébraux avec AMPA, NMDA, ou le glutamate induit les mêmes réponses dans une variété de molécules (par exemple, CaMKII, GluN2B, et GluA1) comme une seconde période d'occlusion in vivo 90 10. Ceci permet d'obtenir une validation supplémentaire que le modèle de MicroSlice décrit ici est une méthode valable qui peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l'ischémie et excitotoxiclité à médiation par la mort cellulaire.
Comme avec n'importe quelle technique expérimentale, cette procédure peut être modifiée, et ces variations peuvent ou non affecter les résultats expérimentaux. Sur la base de l'expérience, le protocole détaillé ici, représente les conditions optimales pour générer le rendement le plus élevé des tissus et MicroSlice viabilité. Ce protocole peut être adapté pour être utilisé dans une variété d'espèces (microslices provenant de rats, les souris et les poulets ont été précédemment généré avec succès), et à partir de n'importe quelle région du cerveau (figures 1 à 3 représentent microslices dérivés du cerveau antérieur ensemble; La figure 4 représente microslices dérivés à partir de cortex et striatum). En outre, l'épaisseur de la MicroSlice peut être modifiée de 150 à 350 um, sans aucune perte appréciable de viabilité des tranches. L'épaisseur de tranche optimale est de 250 pm, comme cela produit le meilleur rendement de tissu, et un échantillonnage plus reproductible que pour de plus grandes tranches. L'échantillonnage statistique de tissu cérébral produit pardes aliquotes de microslices doit être représentatif du tissu à partir de laquelle les tranches ont été préparés. Pour ce faire, nous devons utiliser les petites rondelles de taille par aliquote pour assurer un échantillonnage représentatif du tissu. Les conditions optimales pour ce sont révélés être de 250 um d'épaisseur, et 1 mg de protéine tissulaire, ce qui correspond à ~ 15 à 20 tranches / aliquot. La température à laquelle microslices doivent être coupés et lavés a été étudiée en comparant les taux de microslices générés par la respiration et sans refroidissement à 4 ° C. Bien que les effets de l'acidose et l'anoxie peuvent être réduits lorsque le tissu est placé à 4 ° C, microtubules remontage peut être modifié si le tissu est refroidi puis réchauffé 16. Cette réorganisation du cytosquelette peut affecter l'activité fonctionnelle des cellules pendant une certaine période après l'échauffement. Microslices Noncooled ont une viabilité supérieure et la fréquence respiratoire par rapport aux tranches refroidies. En outre, trois lavages (étapes 3.1 à 3.3) sont sufficace pour éliminer la plupart des débris. La période d'équilibrage (étape 3.4) avec des variations périodiques de la mémoire tampon permet de les microslices «récupérer» de hachage, et améliore la reproductibilité dans divers dosages fonctionnels (tels que l'accumulation de calcium).
La méthode est adaptée pour examiner les effets suivants une variété de stimuli, et après un traitement avec des médicaments inhibiteurs de /. Tout médicament / inhibiteur qui est une membrane perméable a le potentiel d'être examiné par l'intermédiaire de cette technique, et n'importe quelle molécule qui peut être détectée par l'intermédiaire de western blot (ou similaire) peut être étudiée.
En résumé, la manipulation des cascades impliquées dans l'excitotoxicité et de mort cellulaire médiée par l'ischémie signalisation offrent une approche attractive pour le développement de médicaments qui limitent la mort neuronale après un AVC. La méthode de MicroSlice décrit est un modèle facilement applicable qui permet l'étude de ces cascades de signalisation dans le cerveau intact maturitétissu. Cette technique peut être utilisée pour aider à identifier de nouveaux traitements qui limitent la mort neuronale après un AVC.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflit d'intérêt concernant un quelconque des travaux menés dans ce manuscrit.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds de recherche du Conseil national de la santé et de recherche médicale de l'Australie, le Hunter Medical Research Institute et l'Université de Newcastle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | Used to generate 100-400 µm brain sections. | |
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Humidifier/aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
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