마우스 모델에서 하대 정맥 끼어 이식의 주입

선천성 심장 결함이 미국에서 출산의 약 8 %에 영향을 미치는 심각한 상황이다. 선천성 심장 결함 또는 2.4 1,000 명당 출생과 그 유아의 약 25 %가 자신의 ^수명의 첫 해에 침략적인 치료를 필요로합니다. 선천성 심장 질환에 대한 가장 효과적인 치료법은 재건 수술이다. 불행하게도, 현재 혈관 도관의 사용에서 발생하는 합병증은 수술 후 사망률과 사망의 가장 중요한 원인입니다.

이 문제를 해결하기 위해, 우리는 임상 ^2에 대한 첫 번째 조직 공학 혈관 이식 (TEVGs)를 개발했다. TEVGs은자가 골수 파생 된 단핵 세포 (BM-다국적 기업)의 시드 및 선천성 심장 수술을위한 정맥 도관으로 이식 된 생분해 성 폴리 에스테르 튜브로 구성되었다. 결과는 후속 1-3 세에 우수한 개통 률을 보였으 나 협착의 중요한 발생률 5,6를 생성 하였다. 이 모델에서, TEVGs 성공적으로 생활 용기로 변환 및 형태와 기본 정맥의 기능 모두에서 유사했다. 큰 동물 모델의 사용은 TEVGs의 임상 사용을 주었 중요한 사전 임상 정보를 제공하는 좋은 첫 번째 단계였다. 그러나, 대형 동물 모델을 사용하여 TEVGs 혈관 neotissue 형성의 세포 및 분자 메커니즘의 완전한 이해로 인해 종의 특정 분자 도구의 부족으로 인해 혈관 세포의 표현형의 분자 특성의 한계로 제한됩니다. 이러한 단점을 극복하기 위해, TEVGs의 쥐 모델은 마우스 유전학의 급속한 발전과 자신의 광범위한 molecula의 이유에 의해 개발되었다단축 시간 규모의 추가 장점과 연구의 특성화.

쥐 IVC의 개재 모델을 충실하게 큰 동물과 인간에서 발생 neovessel 형성 과정을 효과적으로 요약,하지만 훨씬 짧은 시간 코스 ^6-9 이상. 여기에, 생분해 성 지지체를 사용하여 작은 규모의 이식 제조를위한 상세한 프로토콜, BM-MNC 수확 및 격리, 발판에 BM-MNC 파종 및 쥐 모델 이식 주입을 설​​명했다.

참고 : 모든 동물의 절차는 전국 어린이 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 이식 제조

1. 흄 후드 아래에 2 ㎖ 디 옥산에 100 ㎎의 P (LA / CL)을 추가하여 ε-카프로 락톤 및 L-락 타이드 공중 합체 P (LA / CL) 솔루션을합니다. 소용돌이에 솔루션을 배치하고 완전히 용해 1.5 시간 동안 지속적으로 혼합한다.
2. 한편, (PGA)가 냉장고에서 느껴지는 폴리 글리콜 산의 시트를 제거하고 몇 가지 5 × 8mm 섹션을 잘라. 또한 단지 필터 위의 0.1 μL 피펫의 끝을 잘라.
3. 피펫 팁의 선단에 19 G 바늘 (1.5 길이)를 삽입하고 PGA 마이크로 집게를 사용하여 바늘 주위 느꼈다 포장.
4. 19 G 바늘이 그것으로 삽입하면서 조심스럽게, 루멘 무딘 18 G 바늘을 사용하여, 근위부보다는 똑바로입니다 피펫 팁의 선단에 펠트를 밀어 넣습니다.
5. 피펫40 μL의 P (CL / LA)의 상단에서 피펫 팁에 솔루션을 제공합니다. PGA 솔루션 펠트 포화. 그런 다음 피펫 분배기를 사용하여 공기 방울을 밀어. 필요한 경우이 과정을 반복합니다.
6. 장소 50 ML 튜브에 이식하고 20 분 동안 -80 ° C 냉동고에 넣습니다. 바늘의 머리가 아래로 얼굴을 확인합니다.
7. 동결 건조기에 튜브를 전송하고 24 시간 동안 진공 청소기로 청소. 공기 흐름을 가지고 튜브의 뚜껑을 열 수 있는지 확인합니다.
8. 이식을 가지고 바늘에서 제거합니다. ~ 5mm 섹션을 떠나는 이식의 양쪽 끝을 잘라 자신의 모양을 유지하기 위해 바늘에 다시 넣어. 데시 케이 터에 이식을 유지합니다.
9. 바이오 안전성 후드 O / N 전에 세포 파종에 UV 빛의 밑에 발판을 놓으십시오.

2. 골수 단핵 세포 수확 및 절연

1. 케타민 / 자일 라진 과다 복용 (케타민, 200 ㎎ / ㎏과 자일 라진, 20 ㎎ / ㎏)와 쥐를 안락사.
2. 제거 뼈 (대퇴골의10 CC의 RPMI와 페트리 접시에 10 이식 착상과 장소에 3 마우스의 개발 경골). 3 CC의 RPMI로 새로운 배양 접시에 25 G 바늘과 주사기를 사용하여 뼈와 플러시 골수의 양쪽 끝을 잘라. 15 CC 튜브에 골수 및 RPMI 솔루션을 수집하고 BM의 나머지를 수집하기 위해 추가로 2 CC의 RPMI와 페트리 접시를 씻으십시오.
3. 샘플 (5 ~ 10 μL)를 가지고 자동 셀 카운터 또는 혈구를 사용하여 셀을 계산합니다. 그 결과를 기록한다.
4. 15 CC 원심 분리기 튜브에 5 CC의 피콜을 넣고 골수 RPMI 솔루션을 추가합니다. 피콜 믹싱 않도록 매우 조심스럽게 용액을 추가.
5. 24 ° C에서 "NO 브레이크"30 분 동안 528 XG에 원심 분리기
6. 상위 핑크 레이어를 제거합니다. MNC 층 인 중간 클리어 층의 그림 1, 수집하고, PBS 1:1와 희석.
7. 24 ℃에서 10 분 동안 528 XG에서 희석 MNC 솔루션을 원심 분리기
8. 뜨는 디를 제거류트 5 ㎖의 PBS와 펠렛.
9. 24 ℃에서 10 분 동안 528 XG에서 펠렛 솔루션을 원심 분리기
10. 뜨는을 제거합니다. RPMI (~ 200 μL)의 적절한 볼륨으로 펠렛을 희석.
11. 5 ~ 10 ㎕의 샘플을 가지고 자동 셀 카운터 또는 혈구를 사용하여 셀을 계산합니다. 그 결과를 기록한다. 한 번 더 세고 셀을 반복하고 평균 기포 수를 계산한다.
12. RPMI를 사용 μL 1,000,000 cells/10에 세포 농도를 희석.

3. 셀 시드

1. 5 분 luminally 5 μL RPMI를 추가하여 Prewet 발판은 다음 RPMI를 제거합니다.
2. 비계 루멘 단계 2.12에서 RPMI에 10 ㎕의 골수 유래 모노 핵 세포를 추가하고 10 분은 세포가 발판에 첨부 할 수 있도록 기다립니다.
3. 1cm 길이로 19 G 바늘을 잘라 발판의 모양을 유지하기 위해 발판의 루멘에 바늘을 넣어. 24 웰 플레이트에 샘플을 놓습니다. </ 리>
4. 물론 각 1,000 μL RPMI를 추가하고 인큐베이터에서 O / N을 품어.

4. 이식 주입

1. 수술 전에 수술 도구를 압력솥 : 미세 가위, 배 마이크로 집게, 배 미세 혈관 클램프, 1X 클램프 적용 집게, 1X 마이크로 니들 홀더, 1X 봄 가위, 1X 트랙터를 1x는.
2. 여성 6~8주 된 C57BL / 6은 조직 공학 혈관 이식받는 사람으로 사용됩니다. 케이지에서 마우스를 제거하고 무게를 달고, 다음 케타민 / 자일 라진 칵테일 (케타민, 100 ㎎ / ㎏과 자일 라진, 10 ㎎ / ㎏)와 복부의 오른쪽 아래 사분면에 복강 내 주사를 통해 마취. 케토 프로 펜 (5 ㎎ / kg, IP)은 미리 마취 진통제로서 사용된다.
3. 이야기 핀치에 의해 진정 작용의 수준을 확인한 후 복부 머리를 클립. 멸균 안과 연고와 함께 눈에 기름칠을하고, 패드에 지느러미 드러 누움 위치에 마우스를 놓습니다. 베타 딘, 알코올 패드로 복부를 소독. 공동멸균 드레이프와 마우스를 버전 만 절개 영역을 노출합니다.
4. 치골 지역에 xyphoid 아래에서 중간 선 개복술의 절개를하고, 자체 유지 견인기를 삽입합니다. 식염수를 적신 거즈에 내장을 감싸십시오. 퉁명스럽게 신동맥 대동맥과 대정맥을 정의합니다.
5. 근위 및 대동맥과 대정맥의 말단 양쪽에 두 개의 미세 혈관 클램프를 놓고 다음 퉁명스럽게 대정맥 선조 사법 대정맥에서 대동맥을 구분합니다. 필요한 경우, 테이퍼 바늘에 10-0 모노 필라멘트 봉합사로 복부 대동맥 가지를 결찰.
6. 멸균 10-0 봉합사를 이용하여 문합을 종료하는 근위 및 원위 끝 하대 정맥 삽입술 이식을 이식. 마우스의 해부학에 따라 이식, 보통 1~2밀리미터을 낸다. 근위 및 원위 끝 모두에서 하나의 스티치 이식을 안전하고 이식의 다른 측면에서 4 ~ 5 stiches와 함께 지속적으로 봉합하기 시작합니다. 앞면을 마친 후, 클램프 및 이식을 플립다른 측면 및 그래프트의이면을 봉합. 주입하는 동안, 급성 혈전증을 방지 자주 헤파린 용액으로 그래프트 플러시.
7. 근위 클램프를 제거하고 국소 흡수 멸균 지혈 에이전트를 적용하여 출혈을 제어 할 수 있습니다. 출혈이 완전히 정지 할 때, 말초 클램프를 제거하고 출혈 같은 방법으로 제어 할 수 있습니다. 이식을 통해 확인 혈액 흐름을합니다.
8. 포함 된 스레드 바늘로 6-0 블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 두 층으로 복부 근육과 피부를 닫습니다.
9. 0.5 ㎖의 생리 식염수를 피하 주사와 마우스가 완전히 이동할 때까지 온난화 패드 복구 새장에 마우스를 놓습니다. 복구시, 종이 침구 새 케이지에 마우스를 반환합니다. 48 시간 동안 진통제 (이부프로펜, 30 ㎎ / ㎏, 식수를) 제공합니다.

TEVG 주입의 개략도가도 1에 도시된다. 골수 공여 마우스로부터 수확하고, 모노 핵 세포 밀도 원심 분리를 이용하여 분리 한 후 생분해 성 지지체 상에 시드. 시드 발판은 O / N을 배양하고 하대 정맥 삽입술 이식으로받는 마우스에 이식했다.

도 2는 P-PGA (CL / LA) 지지체의 주사 전자 현미경을 도시한다. 내부 직경은 약 1mm이고 벽 두께는 약 0.17 mm이었다. 공률은 78.5 % 였고, 기공 크기는 45.4 ± 17.6 μm의되었습니다 의미합니다.

C57BL / 6 마우스의 IVC에 개재 TEVG의 총 이미지가 주입 (A) 및 주입 (B) 후에 2 주 후에 그림 3. 오른쪽에 표시됩니다. (C)는 비교 네이티브 IVC의 총 이미지를 보여줍니다. 이는 분명하다이식이 neotissue로 가득했습니다, 그러나, 그것은 여전히​​ 원래 이식의 형태를 유지했다. 우리의 이전 결과 총 이식 저하 12 주 (10)이 소요됩니다 것을 보여 주었다.

TEVG 이식 2 주 초음파 B-모드와 컬러 도플러 이미지는 이식 이식의 개방성을 보여 4A-B 피규어. 네이티브 IVC의 이미지는 비교 (그림 4, C)에 추가되었습니다. 세포 파종이 크게 이식의 개통을 개선, 시드되고와 시드 이식 2 주에 patencies은 각각 65 % 및 91 % (P <0.05, 피셔의 정확한 테스트)입니다.

그림 5는 이식 2 주 후 세포 침투 및 TEVG에서 세포 외 기질 침착을 보여줍니다. H & E 염색으로 염색 이식편은 골격 물질 (A)의 이식하고 나머지를 통해 neotissue 형성을 보여 주었다. 수사슴과 메이슨의 트리 크롬 얼룩에있는 엘라스틴의 침착을 보였다timal 층 (B) 및 중간 층 (C)에서 콜라겐. 내피 세포의 안감 내막 층 (D)을 통해 관찰하고 각각 CD31 및 αSMA 염색에 의해 도시로 합류 평활근 세포, 특히 안감 EC (E) 이하, TEVG에 걸쳐 존재했다. F4/80 염색 (F)에 나타낸 바와 같이 주입 후 두 번째 주까지, 대식 세포의 침윤은 분명했다.

그림 1. TEVG 주입의 개략도. 골수 모노 핵 세포는 기증자의 마우스에서 수확 한 생분해 성 지지체에 접종 한 후받는 사람 마우스에 IVC의 개재 이식으로 이식되었다.

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발판의 그림 2. 주사 전자 현미경 이미지. 평균 외경은 내강 직경이 1.1 ㎜, 1.45 ㎜이고, 길이 3 mm였다.

그림 3. 이식 TEVG 이주 및 기본 IVC 후. A) 즉시 주입 후, 비교를 위해 B) 이주 주입 후, 및 C) 기본 IVC.

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그림 4. 초음파 이미지 이주 및 기본 IVC. 비교를 위해 이주. C) 기본 IVC 후 TEVG의 A) B-모드 및 B) 색 도플러 이미지.

2 주 그림 5. 대표 이미지는 수술 TEVG을 게시 할 수 있습니다. A) H & E (내부 루멘), B) 수사슴 (핑크 = 엘라스틴), C) Massion의 트리 크롬 (파란색 = 콜라겐), D) CD31 (갈색 = 내피 세포), E) αSMA (갈색 = 평활근 세포), 그리고 F ) F4/80 (갈색 = 대식 세포).

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