Abstract
Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula e soggiorno di controllo omeostasi dell'organismo. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni proteina da peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentire la messa a fuoco su siti specifici di interazione. Array peptidici permettono l'identificazione dei siti di interazione tra due proteine così come screening per peptidi che si legano alla proteina bersaglio per scopi terapeutici. Essi consentono inoltre ad alto rendimento studi SAR. Per l'identificazione di siti di legame, un Typimatrice peptide cal solito contiene parzialmente sovrapposte 10-20 residui peptidi derivati dalle sequenze complete di una o più proteine partner della proteina bersaglio desiderato. Screening matrice per legare la proteina bersaglio rivela i peptidi leganti, corrispondenti ai siti di legame delle proteine partner, in un modo semplice e veloce utilizzando solo piccole quantità di proteine.
In questo articolo si descrive un protocollo per lo screening array di peptidi per la mappatura dei siti di interazione tra una proteina bersaglio e dei suoi partner. L'array peptide è stato progettato sulla base delle sequenze delle proteine partner, tenendo conto delle loro strutture secondarie. Gli array utilizzati in questo protocollo sono stati Celluspots array preparati da INTAVIS bioanalitici Instruments. L'array è bloccato per impedire il legame aspecifico e quindi incubate con la proteina studiata. Rilevamento utilizzando un anticorpo rivela i peptidi di legame corrispondenti ai siti specifici di interazione tra le proteine.
Introduction
Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula vivente. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni delle proteine. Questo perché i peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentono la messa a fuoco su un sito di interazione specifica su un lato e più bersagli proteici in maniera elevata produttività dall'altro 1,2 mano. Proiezione matrice Peptide è un veloce, facile da eseguire metodo per ottenere una grande quantità di dati sulle interazioni di una proteina bersaglio con numerosi partner in breve tempo 3. A differenza di altri metodi biochimici o biofisici per la rilevazione e l'analisi di interazioni proteina-proteina, lo screening matrice peptide richiede una concentrazione molto bassa di proteine e può rilevare molto debole legame. Array di peptidi possono essere utilizzati per molte applicazioni nelle interazioni peptide-proteina come la mappatura della proteina-proteina o recettore-ligando siti di interazione 4, interfacce omo- o etero-oligomerizzazione, anticorpi che caratterizzano epitopi 5, studiando attività enzimatiche 6 e throughput elevato struttura- rapporto di attività (SAR) studia 7. Per un esame approfondito circa lo screening gamma peptide vedere Katz et al. 4
Attualmente esistono diversi tipi di matrici di peptidi. Ci sono due principali strategie sintetiche per la preparazione di matrici peptide: sintesi dei peptidi prima di essere esposti al supporto solido, o per la sintesi di peptidi direttamente sul supporto solido, principalmente con la tecnica SPOT 4,8. Lapeptidi sono sintetizzati sul supporto solido solito da 9-fluorenilmetilossicarbonil (Fmoc) chimica 8. Tra gli schemi sintetici comuni sono allegati peptide attraverso il terminale N (ad esempio, JPT array pepstar 9) e l'attaccamento peptide attraverso il terminale C (ad esempio, PEPSCAN array pepchip 10, JPT array pepspot 9 e INTAVIS array celluspot 11) 4. Il supporto solido può variare e così fa la chimica dell'accoppiamento peptide ad esso. Peptidi Cys-terminati possono essere allegati ai vetrini tramite il gruppo tiolo 12. Il terminale N di un peptide può essere legato covalentemente ad un gruppo ossidrile sulla membrana di cellulosa attraverso esterificazione degli aminoacidi allegato 8.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening array di peptidi come metodo per lo studio delle interazioni proteina-proteina. L'array che abbiamo usato è l'array Celluspots, che è un micro-array che contiene grandi amount di macchie (duplicati fino a 384 punti) su una piccola membrana di cellulosa supportati da un vetrino. In questo modo si lavora con bassi volumi di proteine e anticorpi e di ottenere significative quantità di dati per ogni singolo esperimento. Questa matrice contiene anche ad alta densità peptide che permette la rilevazione di bassa affinità di legame. L'array è stato utilizzato per mappare l'interazione STIL-CHFR, che è molto importante per il controllo della proliferazione delle cellule normali 13. Interazione incontrollata tra le due proteine può portare allo sviluppo del cancro. Con la mappatura questa interazione abbiamo trovato il sito di legame specifico e residui 14 vincolanti. Questo spiana la strada per la progettazione di inibitori razionali che inibiscono questa interazione proteina-proteina.
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Protocol
1. Progettazione di un array di peptidi
- Dividere la sequenza della proteina bersaglio in parte si sovrappongono 10-20 residui peptidi. Variare la quantità di sovrapposizione sulla esperimento specifico e le risorse del laboratorio esecuzione, ma in linea di principio più lunga è la sovrapposizione meglio. Nel progettare i peptidi tengono conto noto elementi della struttura secondaria della proteina che può essere responsabile per l'interazione.
- Ordinare l'array peptide progettato presso i rivenditori commerciali. Qui, uso peptidi legati covalentemente alla matrice attraverso il C-terminale.
2. Blocco legame non specifico
- Effettuare una soluzione tampone Tris 50 mM o fosfato contenente 0,05% di Tween 20 (TBST / PBST) e regolare il pH desiderato con una quantità misurata di HCl o NaOH (per conoscere la forza ionica precisi) e la forza ionica desiderato con NaCl . Qui, utilizzare un pH di 7,5 ed una forza ionica di 150 mM.
- Fare una soluzione di saturazione di2,5% (w / v) di latte scremato in polvere in TBST / PBST.
- Per prevenire il legame non specifico, immergere la matrice in 5 ml di soluzione bloccante. Incubare la matrice per 2-4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C su un agitatore.
3. Incubare con la proteina
- Lavare la matrice prima con 5 ml di soluzione di blocco per 30 sec e poi due volte con 5 ml di TBST / PBST per 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente.
- Incubare la matrice lavato con 5 ml di His-tag soluzione proteica contenente 2,5% (w / v) di latte scremato in polvere per impedire legame non specifico. Qui, utilizzare 4,5 mM di soluzione proteica (STIL 500-650) disciolto nella soluzione di blocco descritto.
NOTA: Generalmente 5-10 mM proteine sono utilizzati per lo screening, ma la concentrazione di proteina può essere ancora a partire da 2-3 micron, a seconda della affinità di legame e le concentrazioni locali di peptidi che delimitano sulla matrice (efficienza del sintesi). Il buffer in cui la proteinaviene disciolto può variare ma è comune per diluire la proteina utilizzando la stessa soluzione di saturazione sopra descritto. - Incubare la matrice nella soluzione proteica per 3-8 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
4. Incubare con l'anticorpo
- Lavare l'array tre volte con 5 ml di TBST / PBST. Il primo lavaggio è di 30 secondi seguito da due lavaggi 5 min su agitatore a temperatura ambiente.
- Incubare la matrice lavato con 5 ml di anticorpo HRP-coniugato diluito (1: 1.500) in un tampone di incubazione che contiene gli stessi ingredienti alle stesse concentrazioni come la soluzione di saturazione, per 1 ora su un agitatore a temperatura ambiente. L'anticorpo può legarsi sia alla proteina bersaglio o il tag.
- Eseguire esperimenti di controllo testare l'interazione dell'anticorpo con peptidi sull'array, specialmente se l'array contiene peptidi dalla proteina bersaglio (ad esempio, per oligomerizzazione studi) ripetendo lo stesso protocollo senza step 3, incubando con la proteina.
- Lavare l'array tre volte con 5 ml di TBST / PBST. Il primo lavaggio è di 30 secondi seguito da due lavaggi 5 min su agitatore a temperatura ambiente.
5. Lettura del Array
- Effettuare sviluppo chemiluminescenza con un kit di substrato western blotting ECL.
- Eseguire il rilevamento con un analizzatore di immagini luminescenti.
- Analizzare i risultati. Assicurarsi che entrambi i duplicati su matrice mostrano gli stessi segnali, quindi i risultati sono affidabili. Se la struttura del partner proteina è noto, la ricerca sulla struttura dei peptidi leganti e cercare i siti di legame. Anche i peptidi che sono molto nella sequenza possono essere vicini nella struttura terziaria e creare un sito di legame.
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Representative Results
STIL è una proteina molto importante centrosomica. Controlla normale divisione cellulare e la proliferazione delle cellule 13,15 - 19. STIL interagisce con numerose proteine 18,20,21, e la maggior parte delle interazioni si verificano attraverso la sua parte centrale, che è una regione intrinsecamente disordinati (IDR) 14. Abbiamo progettato un array costituito da peptidi derivati dalla proteina legante STIL CHFR. CHFR è un soppressore del tumore che è indotta in risposta a sollecitazioni mitotici 22. Dal momento che la struttura del dominio di legame STIL di CHFR era sconosciuto al momento, abbiamo diviso il dominio della proteina di 15 residui lunghi peptidi con sovrapposizione di 7 residui, come descritto al punto 1.1 del protocollo. Abbiamo eseguito una serie di peptidi di screening per l'identificazione dei siti CHFR-STIL vincolanti, come specificato nel protocollo di cui sopra e illustrato nella figura 1. Abbiamo utilizzato un array INTAVIS Celluspot composto da 384 peptidi in duplicati, in grado di fornire un enorme quantità di informazioni come dimostrato nella Figura 2. Utilizzando questa matrice peptide abbiamo trovato i siti di legame per STIL nella sua proteina legante CHFR (Figura 3). Ogni macchia nera nella matrice rappresenta un peptide derivato CHFR che legava STIL. Si noti che ciascun peptide visualizza doppio poiché esiste in duplicato, che verifica l'affidabilità dei risultati. L'interazione tra STIL e CHFR è stato precedentemente dimostrato a livello proteico 13,14. La proiezione matrice peptide ha rivelato 7 peptidi CHFR-derivati che legavano STIL IDR, residui 500-650 (Figura 3, Amartely et al. 14). Questi risultati ci hanno permesso di mappare il sito di legame di STIL su CHFR. Nonostante la distanza di questi 7 peptidi su CHFR sequenza primaria creano un sito di legame ben definito per STIL a CHFR (Figura 4) 14.
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Figura 1: Uno schema di proiezione gamma peptide A-progettazione di un array di peptide che consiste di peptidi in parte sovrapposti derivati da una o più proteine partner, tenendo conto delle loro strutture secondarie;. B- Incubazione con la proteina bersaglio; C- incubazione con un anticorpo di rilevazione; Rilevamento D- (può essere fatto da chemiluminescenza, fluorescenza, ecc); E- Analizzando i risultati per rivelare il siti di legame con le proteine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Un esempio di matrice peptide esami di diagnosi ottenuta utilizzando chemiluminescenza La diapositiva contiene due array identici come duplicati..es / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Selezione di un array di peptidi per il legame di STIL IDR alle proteine CHFR: 4,5 mM His-tagged STIL 500-650 è stato proiettato per legare la matrice. Ogni punto nero indica vincolante tra il frammento STIL e il peptide CHFR-derivato 14. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: il sito di legame STIL in CHFR mostrato sulla struttura dei ricchi dominio CHFR Cys (residui 424-661, PDB ID: 2XPO) Il sette.peptidi che delimitano STIL nello screening matrice peptide possono essere divisi per tre regioni di colore rosa, arancio e rosso, che sono distanti nella sequenza primaria, ma vicini nella struttura 3D la creazione di un sito di legame. Questa regione piena forma una tasca di legame per STIL nel CHFR dimero 14. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo screening matrice Peptide è un ottimo strumento per identificare i siti di legame di una proteina bersaglio nei suoi partner. Questo test è veloce e facile da eseguire e il risultato può essere ottenuto in uno o due giorni lavorativi. Proiezione matrice Peptide è versatile e può essere utilizzato per vari scopi. Può essere usato per caratterizzare modifiche Traduzione successive come fosforilazione e identificare substrati di chinasi. Ad esempio: la chinasi FLT3, che è legato alla leucemia mieloide acuta, fosforila Tyr-contenenti peptidi substrato trovate da un array di peptide di screening 6. Le proprietà inibitorie del pazopanib inibitori della tirosin-chinasi e lapatinib è stato testato con un array di peptidi di screening 23. Array di peptidi può essere utilizzato per identificare i siti che mediano le interazioni proteina-proteina. Esempi di tali proteine studiate nel nostro laboratorio con questo metodo sono: l'interazione tra la proteina HIV-1 Vif e proteina cellulare A3G noi è stato caratterizzatozione di una serie di peptidi 24; lo screening gamma peptide è stato utilizzato per studiare le interazioni del anti-apoptotica Bcl-2 famiglia con il pro-apoptotico ASPP2 proteine 25 e di studiare il legame di tBID, un membro di BCL-2 famiglia, con la proteina mitocondriale MTCH2 26; l'interazione intra-molecolare tra domini miosina IIC è stato analizzato utilizzando array di peptidi di screening 27. Qui vi presentiamo un esempio di come abbiamo usato gamma peptide di screening per l'individuazione dei siti che mediano l'interazione STIL-CHFR, una interazione proteina-proteina importante nella proliferazione e il cancro 14. Rivelando il sito di legame esatto può servire come base per la progettazione razionale di inibitori dell'interazione studiata.
La proiezione matrice peptide non è un dosaggio quantitativo. È semi-quantitativa poiché la quantità di peptide in ciascun punto sulla matrice varia a causa della differenza nella resa di sintesi peptidica e purezza. Questo a sua volta dipende dalla PEPTsequenza ide, lunghezza, ecc La variazione della resa e la purezza può anche portare a volte a risultati falsi positivi o falsi negativi. Confronto tra le intensità all'interno dello stesso array può essere fatta, con conseguente classifica semi-quantitativa. Tuttavia tale confronto tra le diverse matrici o diversi esperimenti con la stessa matrice non è affidabile. Per quantificare l'associazione, i peptidi presenti nella matrice di screening peptide devono essere sintetizzati e testati per legare la proteina bersaglio con metodi biofisici come la fluorescenza anisotropia, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC), risonanza plasmonica di superficie (SPR), ecc Tali dosaggi sono Non sempre sensibile alle deboli vincolante in quanto richiedono un'alta concentrazione della proteina di rilevare tale legame. La proiezione matrice peptide, d'altra parte, è molto sensibile alle deboli vincolante. Così, alcune delle interazioni osservate nello screening matrice non è stato possibile osservare e quantificate con metodi come la fluorescenza anisot ropy 14. Il fatto che lo screening matrice peptide richiede molto basse concentrazioni di proteine combinata con l'elevata sensibilità del saggio rendere la matrice peptide un metodo utile per lo screening interazioni proteina-peptide in una vasta gamma di affinità.
Risultati falsi negativi possono anche essere dovuto al fatto che i peptidi lineari possono non rappresentare adeguatamente la struttura 3D del sito di legame della proteina. Ciò non è tuttavia un problema con proteine intrinsecamente disordinate, che sono ben rappresentate dai peptidi. Risultati falsi positivi possono essere causati anche da legame dell'anticorpo alla matrice. Questi possono essere rilevati effettuando un esperimento di controllo come descritto nella sezione del protocollo 4.3. Risultati falsi negativi possono essere ottenuti anche se l'epitopo della proteina che viene riconosciuto dal anticorpo diventa non esposta dopo il legame alla matrice peptide. Questo problema non è comune ma può essere risolto utilizzando un anticorpo policlonale contro la proteina.
jove_content "> Lo screening matrice peptide può essere utilizzato anche per migliorare peptidi piombo, compresi Alanina scansione e SAR studio 7. Una volta che il sito di legame del bersaglio è noto, un array in base alla sua sequenza può essere progettata con molteplici modifiche compresa la sostituzione di ciascun residuo di alanina (Ala scansione) per identificare i residui importanti per l'interazione. In modo simile, studi SAR possono essere eseguite variando diverse proprietà dei peptidi leganti. Questi includono variando la lunghezza del peptide, sostituendo residui dal corrispondente D acidi -ammino e altre modifiche, come la metilazione, glicosilazione e la sostituzione di amminoacidi non naturali. Tali peptidi modificati, il tutto sulla base di una sequenza bersaglio, possono essere sintetizzati in un array e proiettato per legare la proteina bersaglio in un esperimento facile e veloce , che fornisce una ricchezza di informazioni per migliorare un potenziale inibitore e la comprensione del meccanismo molecolare dell'interazione.4. L'array peptide qui descritto è solo per uso singolo e non può essere riutilizzato.
Il protocollo presentato qui dimostra la grande utilità di array di peptidi. Utilizzando una matrice progettata correttamente, siti di legame tra due proteine possono essere identificati in dettaglio. Una volta che il sito di legame è ben caratterizzato può essere utilizzato come sito di destinazione farmaco per inibire la relativa interazione proteina-proteina. Sulla base dei peptidi leganti presenti nella matrice di screening, inibitori piccole molecole possono essere progettati e controllati come guida farmacologici.
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Acknowledgments
AF è stato sostenuto da una borsa di studio a partire dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7 / 2007-2013) / accordo di sovvenzione del CER n ° 203.413 e dal Centro Minerva per la Bio-ibrido systems.HA complesso e AI sono supportati dal Dalia e Dan Maydan Fellowship per gli studenti di laurea specialistica presso l'Università Ebraica di Gerusalemme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
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