Identifikation af protein-protein-interaktion websteder anvendelse af peptid Arrays
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Protein-protein interaktioner medierer de fleste processer i levende celler og kontrol homeostase af organismen. Forringede protein-interaktioner kan resultere i sygdom, hvilket protein interaktioner vigtige lægemiddelmål. Det er derfor meget vigtigt at forstå disse interaktioner ved det molekylære niveau. Protein-interaktioner studeres ved hjælp af en række teknikker, der spænder fra cellulære og biokemiske analyser til kvantitative biofysiske assays, og disse kan udføres enten med proteiner i fuld længde, med proteindomæner eller peptider. Peptider tjener som fremragende værktøjer til at studere protein-interaktioner, da peptider kan let syntetiseres og tillade at fokusere på specifikke interaktion sites. Peptid arrays muliggøre identifikation af de vekselvirkningssteder mellem to proteiner samt screening for peptider, som binder målproteinet til terapeutiske formål. De tillader også højt gennemløb SAR studier. Til identifikation af bindingssteder, et typical peptid matrix indeholder sædvanligvis delvis overlappende 10-20 rester peptider afledt fra de fuldstændige sekvenser af en eller flere partnere proteiner af det ønskede målprotein. Screening array for binding af målproteinet afslører bindende peptider, der svarer til de bindingssteder i partnerlandene proteiner, på en nem og hurtig metode anvender kun lille mængde af protein.
I denne artikel beskriver vi en protokol til screening peptid arrays til kortlægning af interaktion sites mellem et target protein og dets partnere. Peptidet array er designet baseret på sekvenserne i partnerlandene proteiner under hensyntagen til deres sekundære strukturer. De arrays benyttes i denne protokol var Celluspots arrays udarbejdet af INTAVIS Bioanalytiske Instruments. Arrayet er blokeret for at forhindre uspecifik binding og derefter inkuberet med det undersøgte protein. Påvisning under anvendelse af et antistof afslører bindende peptider svarende til den specifikke interaktion sites mellem proteinerne.
Introduction
Protein-protein interaktioner medierer de fleste af de processer i den levende celle. Forringede protein-interaktioner kan resultere i sygdom, hvilket protein interaktioner vigtige lægemiddelmål. Det er derfor meget vigtigt at forstå disse interaktioner ved det molekylære niveau. Protein-interaktioner studeres ved hjælp af en række teknikker, der spænder fra cellulære og biokemiske analyser til kvantitative biofysiske assays, og disse kan udføres enten med proteiner i fuld længde, med proteindomæner eller peptider. Peptider tjener som fremragende værktøjer til at studere protein-interaktioner. Dette er fordi peptider kan let syntetiseres og tillade fokusere på en bestemt interaktion sted på den ene side og på flere protein-targets i en high throughput måde på den anden side 1,2. Peptid-array screening er en hurtig, let at udføre fremgangsmåde til opnåelse af en stor mængde data om samspillet mellem et målprotein med mange partnere i en kort tid 3. I modsætning til andre biokemiske eller biofysiske metoder til påvisning og analyse af protein-protein interaktioner, peptid-array screening kræver en meget lav koncentration af protein og kan detektere meget svag binding. Peptid-arrays kan anvendes til mange anvendelser på peptid-protein-interaktioner, såsom kortlægning af protein-protein eller receptor-ligand-interaktion sites 4, homo- eller hetero-oligomerisering grænseflader, der kendetegner antistoffer epitoper 5, studerer enzymaktiviteter 6 og high throughput struktur- aktivitet relationer (SAR) Undersøgelser 7. For en grundig gennemgang om peptid-array screening se Katz et al. 4
Flere typer af peptid-arrays i øjeblikket eksisterer. Der er to store syntetiske strategier til fremstilling af peptid-arrays: syntese af peptiderne før knytter dem til den faste bærer, eller syntese af peptider direkte på den faste støtte, især via SPOT teknik 4,8. Densyntetiseres peptider på den faste bærer sædvanligvis med 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) kemi 8. Blandt de almindelige syntetiske ordninger er peptid-binding gennem N-terminalen (f.eks JPT pepstar arrays 9) og peptid binding gennem C-terminalen (f.eks PEPSCAN pepchip arrays 10, JPT pepspot arrays 9 og INTAVIS celluspot arrays 11) 4. Den faste bærer kan variere, og det gør kemi peptidkobling til det. Cys-terminerede peptider kan bindes til objektglas via thiolgruppen 12. N-terminalen af et peptid kan være kovalent bundet til en hydroxylgruppe på cellulosemembran gennem esterificering af aminosyren bundet 8.
Her præsenteres en detaljeret protokol til screening peptid arrays som en fremgangsmåde til at studere protein-protein-interaktioner. Array vi brugte er Celluspots array, som er en mikro-array indeholdende store amoUNT af pletter (dubletter på op til 384 pletter) på en lille cellulose membran, der understøttes af en glasplade. Dette gør det muligt at arbejde med små mængder af protein og antistoffer og opnåelse betydelig mængde data pr enkelt eksperiment. Denne matrix indeholder også høj tæthed peptid, der tillader detektering af lav affinitetsbinding. Grupperingen blev anvendt til kortlægning af STIL-CHFR interaktion, der er meget vigtig for at styre normal celleproliferation 13. Ukontrolleret interaktion mellem de to proteiner kan føre til udvikling af cancer. Ved at kortlægge denne interaktion fandt vi specifikt bindingssted og bindende resterne 14. Dette baner vejen for at designe rationelle, som hæmmer denne protein-protein interaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peptid-array screening er et fremragende redskab til at identificere de bindende steder af et target protein i dets partnere. Denne analyse er hurtig og let at udføre, og resultaterne kan opnås i en eller to arbejdsdage. Peptid matrix screening er alsidig og kan bruges til mange formål. Det kan bruges til karakterisering af post-translationelle modifikationer såsom phosphorylering og identificere substrater af kinaser. For eksempel: FLT3 kinase, der er relateret til akut myeloid leukæmi, phosphorylerer Tyr-indehold…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF blev understøttet af en begyndende bevilling fra Det Europæiske Forskningsråd under Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) / ERC Grant agreement n ° 203413 og af Minerva Center for Bio-hybrid kompleks systems.HA og AI er understøttet af Dalia og Dan Maydan Fellowship for avancerede degree studerende på Det Hebraiske Universitet i Jerusalem.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
