Abstract
Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula y el control vivir homeostasis del organismo. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones de proteína ya que los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permitir que el centrarse en los sitios específicos de interacción. Arrays de péptidos permiten la identificación de los sitios de interacción entre dos proteínas, así como la detección de los péptidos que se unen a la proteína diana con fines terapéuticos. También permiten alto rendimiento estudios SAR. Para la identificación de sitios de unión, un tipificaCal matriz péptido por lo general contiene en parte superpuestos 10-20 residuos de péptidos derivados de las secuencias completas de una o más proteínas asociadas de la proteína diana deseada. La detección de la matriz para la unión de la proteína diana revela los péptidos de unión, que corresponden a los sitios de unión en las proteínas asociadas, en un método fácil y rápido usando sólo una pequeña cantidad de proteína.
En este artículo se describe un protocolo para la detección de arrays de péptidos para el mapeo de los sitios de interacción entre una proteína diana y sus socios. La matriz de péptido está diseñado sobre la base de las secuencias de las proteínas asociadas, teniendo en cuenta sus estructuras secundarias. Las matrices utilizadas en este protocolo fueron Celluspots matrices preparadas por Intavis Bioanalíticos Instruments. La matriz está bloqueado para evitar la unión no específica y después se incubaron con la proteína estudiada. Detección usando un anticuerpo revela los péptidos de unión correspondientes a los sitios específicos de interacción entre las proteínas.
Introduction
Interacciones proteína-proteína median la mayoría de los procesos en la célula viva. Interacciones de proteínas con deficiencias pueden dar lugar a la enfermedad, por lo que las interacciones proteína objetivos importantes de drogas. Es por lo tanto muy importante entender estas interacciones a nivel molecular. Interacciones de proteínas se estudiaron usando una variedad de técnicas que van desde ensayos celulares y bioquímicos a ensayos biofísicos cuantitativos, y estos se pueden realizar ya sea con proteínas de longitud completa, con dominios de proteínas o con péptidos. Los péptidos sirven como excelentes herramientas para estudiar las interacciones proteína. Esto es porque los péptidos pueden ser sintetizados fácilmente y permiten que el centrarse en un sitio de interacción específica por un lado y en múltiples dianas proteicas en un alto rendimiento en el otro lado 1,2. Screening matriz péptido es un rápido, fácil de realizar método para obtener una gran cantidad de datos acerca de las interacciones de una proteína diana con numerosos asociados en un corto período de tiempo 3. A diferencia de otros métodos bioquímicos o biofísicos para detectar y analizar interacciones proteína-proteína, péptido matriz de cribado requiere una concentración muy baja de proteína y puede detectar una unión muy débil. Arrays de péptidos pueden utilizarse para muchas aplicaciones en las interacciones proteína-péptido como el mapeo de la proteína-proteína o sitios de interacción receptor-ligando 4, interfaces de homo o hetero-oligomerización, los anticuerpos que caracterizan epítopos 5, el estudio de las actividades enzimáticas 6 y de alto rendimiento estructura- relación actividad (SAR) estudia 7. Para una revisión en profundidad acerca de la detección matriz péptido ver Katz et al. 4
Actualmente, existen diversos tipos de matrices de péptidos. Hay dos principales estrategias sintéticas para la fabricación de matrices de péptidos: síntesis de los péptidos antes de adjuntarlos al soporte sólido, o síntesis de péptidos directamente sobre el soporte sólido, principalmente utilizando la técnica de 4,8 SPOT. Lalos péptidos se sintetizan en el soporte sólido por lo general por 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) química 8. Entre los esquemas sintéticos comunes son el apego péptido a través del extremo N-terminal (por ejemplo, JPT matrices Pepstar 9) y el apego péptido a través de la terminal C (por ejemplo, PEPSCAN matrices pepchip 10, JPT matrices pepspot 9 y Intavis matrices celluspot 11) 4. El soporte sólido puede variar y también lo hace la química del acoplamiento de péptidos a la misma. Péptidos terminados en Cys pueden estar unidos a portaobjetos de vidrio a través del grupo tiol 12. El terminal N de un péptido puede estar unido covalentemente a un grupo hidroxilo en la membrana de celulosa a través de esterificación del ácido amino unido 8.
Aquí presentamos un protocolo detallado para el cribado de arrays de péptidos como un método para el estudio de interacciones proteína-proteína. La matriz que utilizamos es la matriz Celluspots, que es un micro-array que contiene gran amount de manchas (duplicados de hasta 384 puntos) sobre una membrana de celulosa pequeña apoyados por un portaobjetos de vidrio. Esto permite trabajar con bajos volúmenes de proteína y anticuerpos y la obtención de cantidad significativa de datos por solo experimento. Esta matriz también contiene péptidos de alta densidad que permite la detección de baja afinidad de unión. La matriz se utilizó para el mapeo de la interacción STIL-CHFR, que es altamente importante para el control de la proliferación celular normal 13. Interacción incontrolada entre las dos proteínas puede conducir al desarrollo de cáncer. Mediante la cartografía de esta interacción se encontró el sitio de unión específico y residuos 14 de unión. Esto allana el camino para el diseño de inhibidores racionales que inhiben esta interacción proteína-proteína.
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Protocol
1. Diseño de una matriz de péptidos
- Divida la secuencia de la proteína diana en parte, la superposición de 10-20 residuos de péptidos. Variar la cantidad de solapamiento en el experimento específico y los recursos del laboratorio que realiza, pero, en principio, cuanto mayor sea el solapamiento mejor. En el diseño de los péptidos tienen en cuenta los conocidos elementos de estructura secundaria de la proteína que pueden ser responsables de la interacción.
- Ordene la matriz péptido diseñado a través de proveedores comerciales. Aquí, el uso de péptidos unidos covalentemente a la matriz a través de la C-terminal.
2. El bloqueo de la unión no específica
- Hacer una solución tampón de Tris 50 mM o fosfato que contiene 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) y ajustar al pH deseado con una cantidad medida de HCl o NaOH (con el fin de conocer la fuerza iónica precisa) y la fuerza iónica deseada con NaCl . Aquí, utilizar un pH de 7,5 y una fuerza iónica de 150 mM.
- Haga una solución de bloqueo de2.5% (w / v) de leche desnatada en polvo en TBST / PBST.
- Para evitar la unión no específica, sumerja la matriz en 5 ml de solución de bloqueo. Incubar la matriz durante 2-4 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ºC en un agitador.
3. La incubación con la proteína
- Lavar la matriz primero con 5 ml de solución de bloqueo durante 30 seg y luego dos veces con 5 ml de TBST / PBST durante 5 min en un agitador a temperatura ambiente.
- Incubar la matriz se lavó con 5 ml de marcado con his solución de proteína que contiene 2,5% (w / v) leche desnatada en polvo para evitar la unión no específica. Aquí, utilizar 4,5 M de solución de proteína (STIL 500-650) disuelto en la solución de bloqueo descrito.
NOTA: Generalmente 5-10 proteína M se utilizan para la proyección, pero la concentración de proteínas puede ser incluso tan bajo como 2-3 M, dependiendo de la afinidad de unión y las concentraciones locales de los péptidos que se unían en la matriz (la eficiencia de la síntesis). El tampón en el que la proteínase disuelve puede variar, pero es común para diluir la proteína usando la misma solución de bloqueo descrito anteriormente. - Incubar la matriz en la solución de proteína durante 3-8 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ºC.
4. La incubación con el anticuerpo
- Lavar la matriz tres veces con 5 ml de TBST / PBST. El primero de lavado es de 30 seg seguido por dos lavados de 5 min en un agitador a temperatura ambiente.
- Incubar la matriz se lavó con 5 ml de anticuerpo conjugado con HRP diluido (1: 1500) en un tampón de incubación que contiene los mismos ingredientes en las mismas concentraciones que la solución de bloqueo, durante 1 hora en un agitador a temperatura ambiente. El anticuerpo se puede unir la proteína diana o en la etiqueta.
- Realizar experimentos de control de comprobación de la interacción del anticuerpo con péptidos en la matriz, especialmente si la matriz contiene péptidos de la proteína diana (por ejemplo, para la oligomerización estudios) repitiendo el mismo protocolo sin step 3, la incubación con la proteína.
- Lavar la matriz tres veces con 5 ml de TBST / PBST. El primero de lavado es de 30 seg seguido por dos lavados de 5 min en un agitador a temperatura ambiente.
5. Lectura de la matriz
- Llevar a cabo el desarrollo de quimioluminiscencia con un kit de sustrato ECL Western Blot.
- Realizar la detección con un analizador de imágenes luminiscente.
- Analizar los resultados. Asegúrese de que los dos duplicados de la matriz muestran las mismas señales, por lo que los resultados son fiables. Si se conoce la estructura de la proteína de pareja, buscar en la estructura de los péptidos de unión y buscar los sitios de unión. Incluso los péptidos que son mucho en la secuencia pueden ser muy juntos en la estructura terciaria y crear un sitio de unión.
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Representative Results
STIL es una proteína centrosomal altamente importante. Controla la división celular normal y la proliferación celular 13,15 - 19. STIL interactúa con varias proteínas 18,20,21, y la mayoría de las interacciones ocurren a través de su parte central, que es una región intrínsecamente desordenados (IDR) 14. Hemos diseñado una matriz compuesta de péptidos derivados de la proteína de unión STIL CHFR. CHFR es un supresor de tumor que se induce en respuesta a estrés mitótico 22. Dado que la estructura del dominio de unión STIL de CHFR era desconocido en el momento, hemos dividido el dominio de la proteína de 15 residuos de péptidos largos con superposición de 7 residuos, tal como se describe en el paso 1.1 en el protocolo. Se realizó una matriz de péptido de cribado para identificar los sitios de unión CHFR-STIL, como se detalla en el protocolo anterior y se ilustra en la Figura 1. Se utilizó una matriz Intavis Celluspot compuesta de 384 péptidos en los duplicados, que puede proporcionar una enorme cantidad de información como se demuestra en la Figura 2. El uso de esta matriz péptido encontramos los sitios de unión para STIL en su proteína de unión CHFR (Figura 3). Cada punto negro en la matriz representa un péptido derivado CHFR que unía STIL. Tenga en cuenta que cada péptido aparece dos veces, ya que existe en duplicado, que verifica la fiabilidad de los resultados. La interacción entre STIL y CHFR se demostró previamente a nivel de proteínas 13,14. La proyección matriz péptido reveló 7 péptidos derivados de CHFR que unían STIL IDR, los residuos 500-650 (Figura 3, Amartely et al. 14). Estos resultados nos permitieron mapear el sitio de unión de STIL en CHFR. A pesar de la distancia de estos 7 péptidos de secuencia primaria CHFR crean un sitio de unión bien definido para STIL en CHFR (Figura 4) 14.
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Figura 1: Un esquema de la detección matriz péptido A- El diseño de una matriz de péptido que consiste de péptidos parcialmente solapantes derivados de una o más proteínas asociadas, teniendo en cuenta sus estructuras secundarias;. B- incubación con la proteína diana; C- incubación con un anticuerpo para la detección; Detección D- (se puede hacer por quimioluminiscencia, fluorescencia, etc.); E- Analizando los resultados para revelar la proteína sitios de unión. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2:. Un ejemplo de matriz péptido detección Detección logra utilizando quimioluminiscencia La diapositiva contiene dos conjuntos idénticos como duplicados..en / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3: La detección de una serie de péptidos de unión de STIL IDR de proteínas CHFR: 4,5 M Su-etiquetados STIL 500-650 se proyectó para la unión de la matriz. Cada punto negro indica la unión entre el fragmento STIL y el péptido derivado de CHFR 14. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4: El sitio de unión STIL en CHFR se muestra en la estructura del dominio rico CHFR Cys (residuos 424-661, AP ID: 2XPO) El siete.péptidos que ataban STIL en la proyección variedad de péptidos se pueden dividir a tres regiones de color rosa, naranja y rojo, que son distantes en la secuencia principal, pero cerca juntos en la estructura 3D de la creación de un sitio de unión. Esta región llena forma un bolsillo de unión para STIL en el CHFR dímero 14. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
Detección matriz péptido es una excelente herramienta para la identificación de los puntos de unión de una proteína diana en sus socios. Este ensayo es rápido y fácil de realizar y los resultados se pueden obtener en uno o dos días hábiles. Screening matriz péptido es versátil y se puede utilizar para muchos propósitos. Se puede utilizar para la caracterización de modificaciones posterior a la traducción tales como la fosforilación y la identificación de sustratos de quinasas. Por ejemplo: la quinasa FLT3, que está relacionado con la leucemia mieloide aguda, Tyr fosforila péptidos que contienen sustratos encontrados por selección de una matriz de péptido 6. Las propiedades inhibidoras de la pazopanib inhibidores de la tirosina quinasa y lapatinib se ensayó usando péptido matriz de detección 23. Matriz de péptidos se puede utilizar para identificar los sitios que median las interacciones proteína-proteína. Ejemplos de tales proteínas estudiadas en nuestro laboratorio utilizando este método son: la interacción entre la proteína del VIH-1 Vif y celular proteína A3G nosotros se caracterizóing una matriz de péptido 24; detección matriz péptido se utilizó para estudiar las interacciones de la anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 con la proteína pro-apoptótica ASPP2 25 y para estudiar la unión de tBID, un miembro de la familia BCL-2, con la proteína mitocondrial MTCH2 26; la interacción intra-molecular entre dominios miosina CII se analizó utilizando variedad de péptidos de cribado 27. Aquí presentamos un ejemplo de cómo se utilizó péptido matriz de cribado para la identificación de los sitios que median la interacción STIL-CHFR, una interacción proteína-proteína importante en la proliferación y el cáncer 14. Revelando el sitio exacto de unión puede servir como base para el diseño racional de inhibidores de la interacción estudiado.
La proyección matriz péptido no es un ensayo cuantitativo. Es semi-cuantitativa ya que la cantidad de péptido en cada punto en la matriz varía debido a la diferencia en el rendimiento de síntesis de péptidos y la pureza. Esto a su vez depende de la Peptsecuencia ide, longitud, etc. La variación en el rendimiento y la pureza también puede conducir a veces a resultados positivos falsos negativos o falsos. Comparación entre las intensidades dentro de la misma matriz se puede hacer, lo que resulta en la clasificación semi-cuantitativa. Sin embargo, tales comparaciones entre diferentes matrices o diferentes experimentos con la misma matriz no es fiable. Para cuantificar la unión, los péptidos se encuentran en la matriz de cribado péptido deben ser sintetizados y probados para la unión de la proteína diana utilizando métodos biofísicos tales como anisotropía de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), resonancia de plasmón superficial (SPR), etc. Tales ensayos son no siempre sensible a la unión débil ya que requieren una alta concentración de la proteína para detectar dicha unión. La proyección matriz péptido, por otro lado, es muy sensible a la débil unión. Así, algunas de las interacciones observadas en el cribado array no se pudo observar o cuantificar utilizando métodos tales como anisot fluorescencia ropy 14. El hecho de que el cribado matriz péptido requiere concentraciones muy bajas de proteína combinada con la alta sensibilidad del ensayo hacen la matriz péptido un método útil para el cribado de las interacciones proteína-péptido en una amplia gama de afinidades.
Los resultados falsos negativos también pueden ser debido al hecho de que los péptidos lineales pueden no representar adecuadamente la estructura 3D del sitio de unión en la proteína. Sin embargo, esto no es un problema con las proteínas intrínsecamente desordenadas, que están bien representados por los péptidos. Los resultados falsos positivos también pueden ser causados por la unión del anticuerpo a la matriz. Estos pueden ser detectados mediante la realización de un experimento de control como se describe en la sección de protocolo 4.3. Los resultados falsos negativos también pueden ser obtenidos si el epítopo de proteína que es reconocida por el anticuerpo se convierten en no expuestos tras la unión a la matriz de péptido. Este problema no es común, pero se puede resolver mediante el uso de un anticuerpo policlonal contra la proteína.
jove_content "> La proyección matriz de péptido también se puede utilizar para la mejora de péptidos de plomo, incluyendo alanina escanear y SAR estudia 7. Una vez que el sitio de unión de la diana es conocido, una matriz sobre la base de su secuencia se puede diseñar con múltiples modificaciones incluyendo el reemplazo de cada residuo a alanina (Ala de exploración) para identificar los residuos importantes para la interacción. De manera similar, los estudios de SAR se pueden realizar cambiando diferentes propiedades de los péptidos de unión. Estos incluyen la variación de la longitud del péptido, en sustitución de los residuos por el correspondiente D -aminoácidos y otras modificaciones, tales como metilación, glicosilación y la sustitución por aminoácidos no naturales. Dichos péptidos modificados, todo ello basado en una secuencia diana, pueden ser sintetizados en una matriz y se tamiza para la unión de la proteína diana en un experimento rápido y fácil , proporcionando una gran cantidad de información para la mejora de un inhibidor potencial y la comprensión del mecanismo molecular de la interacción.electro-4. La matriz péptido descrito en este documento es para un solo uso y no se puede reutilizar.
El protocolo presentado aquí demuestra la amplia utilidad de los arrays de péptidos. El uso de una matriz diseñada correctamente, sitios de unión entre dos proteínas se pueden identificar en detalle. Una vez que el sitio de unión está bien caracterizado que puede ser utilizado como un sitio diana del fármaco para inhibir la interacción proteína-proteína relevante. Sobre la base de los péptidos de unión que se encuentran en la proyección matriz, pequeñas moléculas inhibidoras pueden ser diseñados y seleccionados como cables de drogas.
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Acknowledgments
Son compatibles AF fue apoyado por una subvención a partir del Consejo Europeo de Investigación en virtud del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) / acuerdo de subvención del CEI n ° 203 413 y por el Centro Minerva de Bio-híbrido systems.HA complejo y AI por la Dalia y Dan Maydan de Becas para estudiantes de grado avanzados en la Universidad Hebrea de Jerusalén.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
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