Summary
Aquí empleamos la metodología FISH para realizar un seguimiento de retrotransposition LINE-1 a nivel individual en el cromosoma núcleos diferenciales de líneas de células HepG2 que expresan de forma estable LINE-1 sintético.
Introduction
Humana largos períodos de actividad nuclear Elemento-1 (Line-1 o L1) es un elemento móvil autónomo que se propaga dentro del genoma a través de un "copiar y pegar" mecanismo de retrotransposition. A L1 humana típica es ~ 6 kb de largo y consiste en una 5'UTR (región no traducida) que sirve como un promotor, dos marcos de lectura abierta (ORFs): L1 y L1 -ORF1 -ORF2, y una 3'UTR con un polyA . cola de la proteína L1 -ORF1 tiene tres dominios distintos: un dominio de bobina de la bobina, el reconocimiento de ARN motivo y dominio C-terminal, mientras que la proteína L1 -ORF2 tiene endonucleasa, la transcriptasa inversa y la cisteína dominios ricos en 1.2.3.4.5. L1 -ORF1 exhibe actividad chaperona de ácidos nucleicos, mientras que L1 -ORF2 ofrece actividades enzimáticas, con las dos proteínas necesarias para retrotransposition 1,2,6.
Un ciclo de L1 retrotransposition comienza con la transcripción de la 5'UTR de L1 L1 -ORF1 exposiciones cualquiera de unión a cis donde los paquetes de su propio ARN o unión a trans donde los paquetes de otros ARN (es decir, de seno / EASV / pseudogenes) para formar una partícula de ribonucleoproteína (RNP) con L1 -ORF2p 7, 8. RNPs translocan en el núcleo donde la actividad de endonucleasa de nicks L1 -ORF2p DNA genómico (gDNA) para exponer un OH - grupo 9, que es a su vez usada por la transcriptasa inversa para cebar y revertir RNA sintetizar al ADN a partir del extremo 3 '. Durante la síntesis inversa, la segunda cadena de ADN se mella 7-20 pb desde el sitio original nick para crear pausas escalonadas que están llenos para formar las secuencias de inserción L1 de firma (por ejemplo, TTTTAA) llamados objetivo sitio duplicaciones (TSD) 9,10. Este proceso se conoce como la transcripción inversa objetivo prioritario (TPRT) y conduce a insertien de copias completas o truncadas de L1 / otros ADN con DTE en ambos extremos de la secuencia insertada. L1 retrotransposition También se ha demostrado que es mediado a través de TPRT-como unión de extremos en algunos tipos de células 11 no homóloga.
El vector de L1 retrotransposition empleado en nuestros estudios es no episomales y consta de etiquetado L1 -ORF1 y 2p impulsada por los promotores de CMV-L1-5'UTR combinados (Figura 1) 12. Las versiones anteriores de esta construcción se han descrito en los estudios que utilizan levadura y cultivos de células humanas 13,14,15. Dos promotores CMV distintos situados en el 5 'y 3' del vector, con el extremo 3 'colocado en orientación inversa para conducir la expresión de la neomicina después de empalme y la integración. El casete indicador de retrotransposición en el extremo 3 'se compone de un gen insertado antisentido neomicina a L1 -ORFs y vuelve inactivo por separación en dos mitades por una globen el intrón con donante empalmado (SD) y sitios aceptores de corte y empalme (SA) (Figura 1). Tras la integración en un cromosoma, L1 es transcrito a partir del promotor común para producir un mRNA que consiste en un mRNA bicistrónico y mRNA neomicina inactivo. Durante el procesamiento del ARN, el intrón de globina se empalma fuera del gen de la neomicina para restaurar un gen de la neomicina totalmente funcional. El ARNm híbrido se empaqueta en un RNP en cis y transloca en el núcleo cuando se integre en el genoma, ya sea como de longitud completa o truncadas inserciones utilizando TPRT.
Aquí se describe una metodología que utiliza hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas dirigidas específicamente al gen de la neomicina empalmado (SNEO) para rastrear los patrones -retrotransposiition L1 y las tasas de inserción a nivel de núcleo único. La eficiencia y la especificidad de la detección se confirmó usando retrotransposition competente y construcciones incompetentes y sondas para detect SNEO o la neomicina y globina intrón 16. Esto explica la metodología para algunas de las deficiencias de los ensayos de retrotransposición base de cultivo de células, tales como inserciones múltiples, resistencia a la colonia y la expansión clon favorable.
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Protocol
NOTA: Todas las etapas debe llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Por favor refiérase a la sección Reactivos para obtener más información sobre cómo preparar reactivos individuales.
1. Etiquetado L1 Sondas
NOTA: Las sondas pueden marcarse mediante marcaje químico o PCR.
- etiquetado químico
- Hacer 0,7-1% en gel de agarosa en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE), el calor en el microondas hasta que se derrita, permita que el gel se enfríe, y luego añadir bromuro de etidio (0,5 mg / ml). Vierta la mezcla en la bandeja de gel, añadir peines y permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente.
- Marcar la sonda SNEO (1-2 mg) con Cy3 o FITC a 37 ° C durante 1 hora, según el protocolo del fabricante.
NOTA: SNEO denota el gen S pliced micina Neo expresado después de un ciclo completo de retrotransposition. La sonda es de ~ 1000 pb de tamaño. SNEO puede PCR amplificado a partir de cualquier vector o genoma deADN ic. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre estreptavidina con Cy3 / FITC reactivos de marcaje. - Mezclar la solución de la sonda marcada con SNEO tampón de carga de ADN 1x, la carga en cada pocillo y se ejecutan a 75-100 voltios durante 15-20 min.
- Visualizar la banda sonda usando un Ultra Violeta-iluminador (UV). Tenga en cuenta que el tamaño de la sonda SNEO se puede ajustar y que el ácido núcleos Lock (LNA) también se puede añadir (Figura 2).
- Cut sonda marcada SNEO a partir del gel con una hoja limpia, solubilizar y purificar la sonda SNEO del gel usando un kit de PCR Clean-Up de acuerdo con el protocolo del fabricante.
PRECAUCIÓN: Cubierta de todas las partes expuestas del cuerpo con escudos de protección (es decir, batas de laboratorio y mascarilla clara UV) durante la visualización y cortando el gel. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para la información de gel de purificar los productos de PCR. - Vuelva a ejecutar 5 l de SNEO sonda marcada con una sonda marcada con SNEO ONU en un gel de agarosa al 0,7% (véase el punto 1.1.1) para conaumento de tamaño de la empresa y la pérdida de intensidad de la señal (Figura 2).
- Cuantificar la cantidad de sonda marcada SNEO midiendo la absorbancia a 260 nm y se diluye la sonda SNEO a 10 ng / ml de alícuotas en nucleasa libre de H 2 O. almacenar alícuotas a -20 ° C.
- Etiquetado PCR (método alternativo para el marcaje de la sonda)
- Combinar cebadores específicos SNEO (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 'y 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3') con reactivos de PCR en un solo tubo: 13,6 l de nucleasa libre de H 2 O; 0.1 dATP l, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 l dTTP (10 nM); 0,05 l dUTP-biotina / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 l Ir Tag 5x tampón; 0,4 l Ir Tag polimerasa; 1 l plantilla SNEO (10 ng). Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre los reactivos de PCR.
- Ajustar la cantidad de cada reactivo mediante la multiplicación por el número total de muestras.
- Utilice el siguiente parámetro ciclo de PCRs para amplificar y etiquetas SNEO sondas: 95 ° C durante 2 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; 72 ° C durante 2 min; Mantener a 4 ° C por tiempo indefinido.
NOTA: La temperatura de recocido se puede ajustar o PCR gradiente puede ser completado para determinar la temperatura óptima de recocido para otras sondas. - Hacer gel de 0,7-1% que en la sección 1.1.1, la carga y visualizar la banda de la sonda como en la sección 1.1.4.
- Cortar y purificar la sonda SNEO etiquetada como en la sección 1.1.5.
- Vuelva a ejecutar 5 l de SNEO etiquetados sonda con sonda SNEO ONU marcado aumento para confirmar el tamaño y la pérdida de intensidad de la señal (ver Figura 2).
- Cuantificar la cantidad de sonda marcada SNEO por absorbancia a 260 nm medir y diluir la sonda SNEO a 10 ng / ml de alícuotas en nucleasa libre de H 2 O.
2. Preparar las extensiones de cromosomas
- Generar clones estables que expresan cadena principal del vector (control) o retrotransposition L1 competente utilizando metodologías de selección estándar. 12,16 Aunque se utilizaron reporteros no episomales para correlacionar los resultados con los estudios de la transcripción, también se podrían utilizar vectores episomales. Se cultivan las células que expresan de forma estable el control vectorial o L1 (1 x 10 6 células por placa de 10 cm, con ajustes en el tamaño de la placa hechas según sea necesario) en medio de crecimiento completo. Para las células HepG2, utilice RPMI-1600, 10% de FBS y 200 g / ml de higromicina. Los cultivos deben mantenerse a 70% de confluencia a 37 ° C y 5% de CO2.
NOTA: La elección del medio de crecimiento depende del tipo de célula. Dado que los plásmidos usados aquí llevan casetes de selección tanto para higromicina y neomicina, la selección de clones estables también se podría hacer con neomicina después de la selección en higromicina, pero la cantidad de neomicina necesita ser optimizado para establecer los niveles de tolerancia para cada tipo de célula. - Añadir colcemida (0,4 g / ml) al medio de cultivo y se incuba durante 90 minutos para detener las células en metaphPlaza bursátil norteamericana. Si el uso de diferentes tipos de células, determinar la concentración óptima de colcemid y tiempo de exposición (60, 90, y 120 min) para la detención de la metafase óptima empíricamente.
- Lavar las células 2 veces con 10 ml de PBS de Dulbecco 1x (DPBS), trypsinize mediante la adición de 3 a 5 ml de 0,25% de solución de tripsina a las células y se incuba durante 5 min para separar las células. Inactivar tripsina con una cantidad igual de medio que contiene 10% de FBS.
- Centrifugar las células durante 2 min a 1000 xg a 4 ° C, aspirar el medio del sedimento celular y se lavan las células con DPBS. Aspirar todos DPBS, dejando 200 l de DPBS para volver a suspender las células. Asegurar células se mezclan bien y que todos los grumos se dispersan. Utilice el parpadeo o pipeteo suave para mezclar y dispersar aglomeraciones y evitar vórtex.
- Añadir 5 ml de solución hipotónica (es decir, 75 mM KCl) que se pre-calienta a 37 ° C gota a gota mientras se gira el tubo de 15 ml en horizontal y se incuba a 37 ° C durante 20 min. Véase la Tabla de Materiales y Reagenct para obtener información sobre cómo obtener y hacer una solución hipotónica.
- centrifugar las células a 120 xg durante 5 min a 4 ° C y repita los pasos 2.4 hasta 2.5 3x dejando aproximadamente 200 l de solución hipotónica para volver a suspender las células después de cada lavado. Asegúrese de que al final de los 3 lavados, el sedimento es visiblemente blanco e hinchado.
- Vuelva a suspender el precipitado en 200 l de solución de fijador Carnoy y hacer 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 diluciones en solución de Carnoy fijador. Caída de 10 l de cada dilución en un portaobjetos limpio y seco de aproximadamente 1 cm por encima y exponer inmediatamente el lado libre de la propagación de vapor caliente de agua hirviendo durante 30 segundos. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener una solución de fijador Carnoy.
- Secar los diferenciales a temperatura ambiente, mancha con 0,1 mg / ml Hoechst-33342 por inmersión durante 15-20 min en Coplin Jar y lavar 3 veces con DPBS. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo hacer que la solución Hoechst-33342. <li> Ver extiende en microscopio de fluorescencia / contraste de fase en un aumento de 40X. Después de optimizar la preparación de propagación, los diferenciales no necesitan ser teñidas con Hoechst-33342. Ver extiende en el microscopio de contraste de fase en un aumento de 10X para determinar la calidad de la propagación y la separación como se indica en la sección Resultados (ver Figura 3).
- Seleccione y el círculo buenos para untar con un punto de rotulador diamante en el lado opuesto de la corredera (es decir, difundir libre lateral).
- Tienda se extiende a -20 ° C durante un máximo de un mes. Evitar la exposición a la humedad.
3. La hibridación in situ con fluorescencia (FISH)
- La estabilización de los diferenciales y deshidratando
NOTA: Equilibrar el cromosoma en metafase se propaga a temperatura ambiente si se almacena a -20 ° C. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener y hacer que los reactivos.- Incubar cromosoma en metafase se extiende con 200 l de RNasa A para1 hora a 37 ° C.
- Lavar los portaobjetos en tampón 2x-SSC dos veces durante 5 minutos cada una, seguidas de un enjuague con una solución de HCl 10 mM.
- Incubar diferenciales con 1% de pepsina durante 10 min a 37 ° C, enjuague con H2O desionizada y se lava dos veces con tampón 2x-SSC durante 5 minutos cada uno.
- Incubar diferenciales con 4% de paraformaldehído durante 10 min y se lava en tampón SSC 2x dos veces durante 5 min cada uno.
- Deshidratar extendido por incubación durante 2 min en serie de etanol: 70%, 80% y 95% de etanol.
- diapositivas secar al aire.
- La hibridación se propaga con sondas L1 retrotransposition marcada con (es decir, SNEO)
PRECAUCIÓN: Para sondas directas marcado, mantenga lejos de la luz en todo momento. Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo obtener y hacer que los reactivos.- Añadir 30 ng de SNEO a tampón de hibridación, el calor a 72 ° C durante 10 min y enfriar durante 2 min a temperatura ambiente.
- Añadir 30 l de solución de sonda SNEO aeada propagación, cubrir con cubreobjetos y sellar los bordes con cemento de goma. Asegurar que no la formación de burbujas.
- Calentar el portaobjetos a 72 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor, deje caer gradualmente la temperatura hasta 37 ° C, y de incubar durante la noche en una cámara húmeda oscuridad a 37 ° C.
- Lavado y Visualización (o adición de anticuerpo secundario)
PRECAUCIÓN: Para sondas directas marcado, mantenga lejos de la luz en todo momento.
NOTA: Véase la Tabla de Materiales y Reactivos para obtener información sobre cómo prepararse. Se recomienda el uso de un volumen suficiente para cubrir toda la extensión de cromosomas. Recuerde que el exceso de volumen se pierde cuando se añade cubreobjetos.- Sumerja los portaobjetos en tampón SSC 2x para eliminar cubreobjetos.
- Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón 2x-SSC a 45 ° C durante 5 min.
- Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón de lavado a 45 ° C durante 5 minutos, 2 veces.
- Lavado de los portaobjetos por inmersión en tampón 0,1 x SSC a 45 ° C durante 10 min.
- Lavar los portaobjetos por inmersión en tampón SSC 2x a 45ºC durante 10 min.
NOTA: Coloque un vaso de Coplin que contiene tampón recomendado en un baño de agua, ajustar la temperatura a 45 ° C. - Super diapositivas a temperatura ambiente y se equilibran los portaobjetos en tampón de detección.
- Para sondas marcadas directos, vaya al paso 3.4.10.
- Para sondas marcadas indirectos, bloque en tampón de bloqueo durante 20-30 minutos y lavar 3 veces en DPBS.
- Incubar con 50 l de anticuerpo secundario (por ejemplo, 5 mg / ml de estreptavidina-FITC, o αCY3 en tampón de bloqueo) durante 1 hr.
- Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos dos veces.
- Contratinción con solución de Hoechst-33342 (0,1 mg / ml) durante 10 min.
NOTA: esta tinción se realiza para teñir cromosomas para co-localización con la sonda. - Lavar 3 veces en DPBS, añadir una gota de medio de montaje, colocar un cubreobjetos y sellar los bordes con esmalte de uñas.
- Analizar L1 retrotransposition usando microscopio de fluorescencia a 40X magnification.
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Representative Results
Un diagrama esquemático del vector retrotransposition L1 se presenta en la Figura 1. El vector consiste en un gen de la neomicina en la orientación antisentido con respecto a L1 ORFs que está interrumpido por un intrón de globina en la orientación sentido y emparedada por SD y SA sitios. Cuando se integra de forma estable en un cromosoma, L1 mRNA se transcribe a partir del CMV y el promotor combinado L1-5'UTR (Figura 1). Durante el procesamiento del ARN, el intrón de globina se empalma fuera del gen de la neomicina. La L1 ARN Neo- se empaqueta, transloca y se integra en el genoma, ya sea como una longitud completa o truncada de inserción. Como se ha indicado, L1 retrotransposition puede ser rastreado por FISH utilizando sondas específicas para la neomicina empalmado (Figura 1).
La figura 2 muestra una representación esquemática de la sonda de la neomicina, con el labeled sondeó que es más grande en tamaño y fluorescencia deficiente debido a las diferencias en las longitudes de onda de excitación. Tenga en cuenta que la Cy3 y FITC excitan a diferentes longitudes de onda que el ADN teñido con bromuro de etidio.
La densidad de las extensiones de cromosomas en metafase se determinó por dilución de la solución madre original en 1: 2, 1: 4, 1: 8 y 1:16 diluciones y cada pliego evaluado para la densidad, la distribución y la distancia de los diferenciales desde el núcleo a un aumento de 10X ( Figura 3A). Los resultados muestran una alta densidad, grumoso y se echaron a los diferenciales (Figura 3A-I-II), así como distribuye uniformemente y se extiende bien espaciadas (Figura 3A-III-IV). De baja densidad se extiende con una distribución uniforme se eligieron para su posterior análisis.
extensiones de cromosomas se tiñeron con colorante de calidad y la propagación Hoechst evalúa en función de la longitud de los cromosomas, la redondez de los spreads y la distancia entre el cromosoma (Figura 3B). Estos índices se vieron influidos por la cantidad de tiempo las células se trataron con colcemid, solución hipotónica, solución de Carnoy Fijador y / o la manera en que se rompieron las células para liberar los cromosomas. Si las células se incubaron durante un corto período en una solución hipotónica, las extensiones de cromosomas se hicieron firmemente anudado y los cromosomas individuales eran difíciles de visualizar (Figura 3B-i). Por otro lado, la incubación más larga en solución hipotónica resultó en la rotura de los núcleos, la dispersión de los cromosomas, y / o pérdida de cromosomas (Figura 3B-ii). Incubaciones más largas en colcemid aumentaron el número de células en metafase, sino que conducen a la condensación de los cromosomas (Figura 3B-iii). Como tal, una buena calidad cromosoma propagación requiere periodos de incubación óptimos en tanto colcemid y la solución de KCl hipotónica. En nuestras manos, de una incubación de 90 min en colcemid, 20 en solución hipotónica a 37° C y el uso de un vapor caliente para reventar las células se encontró que las condiciones óptimas para la generación de los diferenciales de alta calidad (Figura 3B-IV).
Las extensiones de cromosomas se tiñeron para L1 retrotransposition utilizando sondas que se dirigen a SNEO. La sonda se marcó con tanto FITC y Cy3 para mostrar que en ambos casos L1 retrotransposition se ve sólo en las células que expresan L1 de tipo silvestre (Figura 4). No se observó tinción en células que expresan la cadena principal del vector solo (Figura 4; comparar paneles superior e inferior para cada fluoróforo). En nuestras manos, no se detectó señal de la sonda en el 80-90% de los núcleos, con la inmensa mayoría de la señal que representa retrotransposition eventos individuales. Sólo nos marcamos retrotransposition en los núcleos con más de una inserción y la calidad propagación siempre fue examinado antes de FISH.
Figura 1. Diagrama esquemático del vector de L1 retrotransposition. Diagrama describe el proceso de transcripción inversa objetivo primordial que lleva a L1 inserciones completa o truncado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Etiquetada SNEO y sondas neomicina no marcados. La sonda marcada exhibe menos de fluorescencia y es más grande en tamaño en comparación con la sonda no marcada. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. contraste de fases (Campo Claro) y Hoechst mancha se extiende cromosómicas. A) muestra la dilución de los diferenciales para obtener preparaciones bien espaciadas. La barra de escala es de 50 micras. B) Hoechst cromosoma mancha que muestra la influencia de colcemid, solución hipotónica, solución de Carnoy Fijador y el estallido en la calidad propagación. La barra de escala es de 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis de FISH de L1 retrotransposition. La tinción de SNEO está ausente en las células control, pero presente en las células que expresan L1 vector de tipo salvaje. La barra de escala es de 10 micras.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Metodologías como la secuenciación del genoma completo, PCR inversa y transferencia de Southern se han empleado para estudiar L1 retrotransposition. A pesar de estas metodologías son extremadamente valiosos en la localización donde se producen L1 inserciones dentro de los genomas, un desafío de confusión para todos ellos es la necesidad de la programación en silico para volver a montar secuencias. La metodología FISH aquí descrito está diseñado para complementar estos métodos, especialmente en el caso de los estudios que requieren análisis de ectópico retrotransposition L1 en células cultivadas. El enfoque se puede utilizar tanto para la evaluación cuantitativa y cualitativa de retrotransposition eventos y se aplicó a los núcleos en interfase. Esta metodología cuenta con la exactitud de los métodos de alineación de secuencias posteriores en silico-empleadas para determinar los sitios de inserción L1 ectópicos 16. Alineación de las secuencias repetitivas puede ser ambiguo debido a la formación de homopolímeros, mientras Sequen repetitivoces se pueden perder durante la amplificación del cebador de plantilla que resulta en falta de representación de secuencias repetitivas. Metodología FISH puede superar estos problemas porque sondas FISH pueden hibridar con homopolímeros y es improbable que estar sesgada en contra de secuencias repetidas intactos 16. Además, en comparación con los ensayos de retrotransposition basados en cultivo celular, los peces pueden determinar las tasas de retrotransposition a nivel de núcleo único. Como tal, este enfoque evita tanto bajo y sobre estimación de las tasas de retrotransposición como múltiples inserciones pueden ocurrir en los núcleos individuales 16. Los datos recientes obtenidos de NGS han confirmado que las metodologías basadas en cultivo celular subestiman frecuencias retrotransposition 25.
Aún no está claro donde los jóvenes prefieren L1 para insertar y si existe un mecanismo de selección para dirigir estas inserciones dentro del genoma. Utilizando la metodología anteriormente hemos demostrado que L1 inserta preferentemente en el gen pobre reregiones del genoma 16. Otros han demostrado que la abundancia de secuencias de L1 es aumento de los cromosomas con una densidad de genes menor 17,18. En conjunto, estos resultados sugieren un modo regulado de inserción donde las amenazas a la célula se reducen al mínimo mediante la inserción de L1 en regiones "menores activos" del genoma. El patrón de movimiento elemento de transposición en los organismos inferiores, ha prestado apoyo a esta interpretación. Por ejemplo, la levadura de fisión retrotransposon, Tf1, integra 95% del tiempo aguas arriba de los promotores de genes y la mayoría de estos genes están implicados en la regulación del estrés 19,20. En células de levadura que carecen de acceso a nitrógeno, Ty5 se integra en los ORF en lugar de las regiones de heterocromatina 21. Los experimentos en maíz han demostrado que la integración de transposones de ADN conducen a fenotipos de color de maíz abigarradas y la integración de Hatvine1-RRM transposón de ADN en la región promotora del gen VvTFL1A se ha demostrado que influence el patrón de ramificación y el tamaño del fruto de la vid 22,23.
Los pasos críticos para el éxito de la metodología FISH se detalla aquí son la generación de buenas extensiones de cromosomas y el etiquetado adecuado, la purificación y la hibridación de las sondas. Si las sondas no se limpian correctamente, la alta señal de fondo resultante hará que sea más difícil la solución de unión a los cromosomas de la sonda. Preferiblemente, las sondas deben ser purificado en gel para eliminar la fluorescencia residual de dNTPs. Además, la cantidad de tiempo que los diferenciales se incuban en solución de Carnoy Fijador es importante preparar buenas extensiones de cromosomas. Si es demasiado largo, la membrana celular puede explotar prematuramente y causar la pérdida del cromosoma. Si es demasiado corto, puede ser difícil obtener diferenciales adecuados a causa de la rotura de membranas deficiente. La cantidad / concentración de formamida determina el foco de cromátidas y por lo tanto es importante optimizar empíricamente para mejores resultados. Todos los lavados deben ser a fondo para ensUre que todas las sondas no unidas y anticuerpos secundarios se eliminan mediante lavado.
En conclusión, la metodología FISH se describe aquí se puede usar para detectar tanto de longitud completa y retrotransposition eventos L1 ectópicos truncadas y se puede aplicar a otros vectores de retrotransposición utilizando la proteína de fluorescencia verde (GFP) como un casete indicador de retrotransposición. Aunque L1 inserciones de longitud completa pueden determinarse utilizando esta metodología, no va a discernir nuevas inserciones truncadas endógenos debido a la cantidad de truncado L1 s dentro del genoma. La accesibilidad de la sonda también puede estar limitado por la formación de heterocromatina aumento 16,24. Sin embargo, la inclusión de LNA dentro de sondas FISH se puede emplear para mejorar el recocido sonda. La detección de SNEO está supeditada a un ciclo completo de retrotransposition e inserciones más pequeña que la sonda / deleción se puede perder.
Para descripciones detalladas de los experimentos en which el uso de estos vectores y la expresión de las proteínas L1 y retrotransposition se caracterizan, por favor refiérase a las obras publicadas 12,16.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses en competencia potenciales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
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