Summary
Burada stabil sentetik LINE-1 ifade eden HepG2 hücre hatlarının kromozom yayılır tek çekirdek düzeyinde HAT-1 retrotransposition izlemek için FISH metodolojisini kullanır.
Introduction
İnsan Uzun Interspersed Nükleer Element-1 (Hat-1 veya L1) retrotransposition mekanizmasını bir geçiş genomu içinde yayılır "kopya ve yapıştır" özerk mobil unsurdur. Tipik bir insan L1 ~ 6 kb uzunluğundadır ve bir promoter olarak hizmet veren bir 5'UTR (çevrilmemiş bölgesinin) oluşur, iki açık okuma çerçevesi (ORF): L1 -ORF1 L1 -ORF2 ve polyA bir 3'UTR . bobin bobin alanı, bir RNA tanıma motif ve C-terminal sahası, L1 -ORF2 proteini endonükleaz sahipken, transkriptaz ve sistin zengin alanları 1,2,3,4,5 tersine: yükleme L1 -ORF1 proteini üç farklı etki vardır. L1 -ORF2 retrotransposition 1,2,6 için gerekli iki proteinler ile, enzimatik aktiviteleri sağladığına; L1 -ORF1, nükleik asit şaperon aktivitelerini sergiler.
L1 retrotransposition bir döngü L1 5'UTR transkripsiyon ile başlar L1 -ORF1 sergiler, ya diğer RNA paketleri kendi RNA paketleri sis bağlayıcı eksojen veya trans bağlayıcı eksojen (örneğin, sinüs / SVAS / sözde genlerin) L1 -ORF2p 7 olan bir ribonükleoprotein parçacık (RNP) oluşturmak için, 8. Bu ana ters transkriptaz tarafından kullanılan da gruptur, 9 ve 3 'ucundan DNA sentez RNA ters - RNP L1 -ORF2p çentik genomik DNA (gDNA) arasında endonükleaz aktivitesi, OH ortaya çıkarmak için çekirdek içine. Ters sentezi sırasında, DNA'nın ikinci şerit imzası L1 ekleme dizileri (örneğin, TTTTAA) olarak adlandırılan hedef site duplikasyonları (TSD) 9,10 oluşturmak için doldurulur sendeleyerek kesmeleri oluşturmak için orijinal nick sitesinden 7-20 bp nicked edilir. Bu işlem, hedef ana ters transkripsiyon (TPRT) olarak bilinir ve inserti neden olduğueklenen dizinin her iki ucunda TSDs L1 / diğer DNA'lar tam ya da tepe bölümü kesik kopya ile. L1 retrotransposition aracılığıyla da aracılık ettiği gösterilmiştir homolog olmayan uç birleştirme bazı hücre tiplerinde 11 TPRT benzeri.
Çalışmalarımızda kullanılan L1 retrotransposition vektör epizomal olmayan ve etiketli L1 -ORF1 ve 2p Birleştirilen CMV L1-5'UTR promoterler tarafından tahrik (şekil 1) 12 oluşur. Bu yapının önceki versiyonları maya ve insan hücre kültürleri 13,14,15 kullanıldığı çalışmalarda tarif edilmiştir. 3 'ucu yapıştırma ve entegrasyon sonrasında neomisin ekspresyonunu tahrik etmek için ters yönde yerleştirilmiş olan 5' ve 3 'yer alan iki ayrı CMV promoterler, vektörün sona erer. 3 'ucunda retrotransposition göstergesi kaseti L1 -ORFs bir neomisin geni yerleştirilmiş antisens oluşur ve topak iki parçaya ayrılması ile aktif olmayan haleeklenmiş verici (SD) ve eklenmiş alıcı (SA) siteleri (Şekil 1) introna, uygun olarak. Bir kromozom içine entegrasyon üzerine, L1 bir bicistronic mRNA ve inaktif neomisin mRNA oluşan bir mRNA üretmek için ortak promotör transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron tamamen işlevsel bir neomisin geni geri neomisin genin dışında birleştirilir. Hibrid mRNA cis bir RNP içine paketlenmiş ve TPRT kullanılarak tam uzunluklu ya da kesilmiş ya da sokulmasını genomuna entegre edilir çekirdeğe transloke edilmiştir.
Burada tek çekirdek düzeyinde L1 -retrotransposiition desen ve yerleştirme oranlarını izlemek için özel olarak eklenmiş neomisin geni (sneo) yönelik problar ile in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanan bir metodoloji tarif eder. verimlilik ve algılama özgüllüğü det yetkili retrotransposition ve beceriksiz yapıları ve problar kullanılarak teyit edildiEKT sneo veya intron kavşağı 16 globin neomisin ve. Bu metodoloji, çoklu eklemeler, koloni direnci ve olumlu klon genişleme olarak hücre kültürü temelli retrotransposition deneyleri, eksikliklerin bazıları oluşturmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Bireysel reaktifler nasıl hazırlanacağını ilgili ayrıntılar için Reaktifler bölümüne bakın.
1. Etiketleme L1 Probları
NOT: Sondalar kimyasal veya PCR etiketleme etiketli olabilir.
- kimyasal etiketleme
- etidyum bromür (0.5 ug / ml) ekleyin, sonra eriyene kadar, bir mikrodalga Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu, ısı 0.7-1% agaroz jeli yapmak jeli soğumasına izin verin ve. Jel tepsiye dökülür tarak ekleyin ve jel, oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar.
- üreticinin protokolüne uygun olarak, 1 saat boyunca 37 ° C'de CY3 ya FITC ile sneo probu (1-2 ug) etiketleyin.
Not: sneo S retrotransposition tam bir döngüsünden sonra ifade Neo Vankomisine geni pliced gösterir. prob boyutu ~ 1000 bp. Sneo PCR herhangi bir vektöre veya genom büyütülmüş edilebiliric DNA. Streptavidin-CY3 / FITC etiketleme reaktif hakkında bilgi almak için Malzemeler ve Reaktifler Tablo bakınız. - her kuyuya 1x DNA yükleme tamponu, yük ile etiketlenmiş sneo prob çözüm karıştırın ve 15-20 dakika boyunca 75-100 voltta çalışır.
- Ultra-Violet (UV) Aydınlatıcı kullanarak prob bandı gözünüzde canlandırın. Sneo prob boyutu ayarlanabilir olduğu ve Kilit çekirdekler asit (LNA) de (Şekil 2) eklenebilir kullanılabileceğine dikkat ediniz.
- Kesme çözündürülmesi ve imalatçının protokolüne göre, bir PCR Temizleme kiti kullanılarak jelden sneo prob saflaştırılması, temiz bir bıçak ile jelden sneo etiketlenmiş prob.
DİKKAT: Kapak koruma kalkanları (yani, laboratuvar mont ve UV şeffaf yüz maskesi) ile vücudun her maruz parçası görüntüleme ve jel keserken. PCR ürünleri arındırmak jel bilgi için Malzeme Tablosu ve Reaktifler bakın. - Yeniden çalışma sneo 5 ul% 0.7 agaroz jeli üzerinde un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob con (1.1.1 bakınız)firma büyüklüğü artışı ve sinyal yoğunluğu kaybı (Şekil 2).
- Nükleaz bilgilerini H2O içinde 260 nm'de absorbans ölçümü ile etiketlenmiş sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları -20 ° C'de saklayın alikotları.
- PCR Etiketleme (prob etiketleme için alternatif yöntem)
- Sneo spesifik primerler birleştirin (5'-ggatagcattgggagatatacct-3 've 5'-attgaacaagatg gattgcacgc-3'), tek bir tüp içine PCR ile: 13.6 ul nükleaz bilgilerini H2O; 0.1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0.05 ul dTTP (10 nM); 0.05 ul dUTP-biyotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul tampon 5x Tag git; 0.4 ul Etiket Polymerase git; 1 ul sneo şablonu (10 ng). PCR ile ilgili bilgi için Malzeme ve Reaktifler Tablo bakınız.
- Numunelerin toplam sayısı ile çarpılarak her reaktif maddenin miktarını ayarlayın.
- Aşağıdaki PCR bisiklet parametresini kullanıns amplifiye ve etiket sneo Probes: 2 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye, 30 saniye için 62 ° C, 60 sn için 72 ° C, 95 ° C 35 döngü; 2 dakika 72 ° C; belirsiz bir süre 4 ° C'de tutun.
Not: bağlanma sıcaklığı ayarlanabilir veya degrade PCR diğer problar için en uygun tavlama belirlemek için tamamlanabilir. - bölüm 1.1.1, yük gibi 0,7-1% jel yapmak ve bölüm 1.1.4 gibi sonda bandı görselleştirmek.
- Kes ve bölüm 1.1.5 gibi etiketlenmiş sneo probu arındırmak.
- Yeniden çalışma sneo 5 ul (bakınız Şekil 2) boyut artışı ve sinyal yoğunluğu kaybını doğrulamak için un etiketli sneo probu ile etiketlenmiş prob.
- Nükleaz bilgilerini H2O içinde 260 nm'de absorbans ölçebilecek etiketli sneo prob miktarını ölçmek ve 10 ng sneo prob seyreltik / ul alikotları
2. Hazırlama Kromozom Farkları
- vektör omurgası ifade stabil klonlar oluşturmak (controStandart bir seçim yöntemleri kullanılarak L) veya retrotransposition yetkin L1. epizomal olmayan muhabir transkripsiyon çalışmaları ile bağlantısının kullanıldı birlikte 12,16, epizomal vektörleri de kullanılabilir. Stabil kontrol veya L1 vektör tam büyüme ortamı (gerektiği gibi yapılmış plaka boyutu ayarlamaları ile 10 cm plaka başına 1 x 10 6 hücre) ifade eden hücreleri büyür. HepG2 hücreleri, RPMI-1600,% 10 FBS ve higromisin 200 ug / ml,. 37 ° C'de% 70 ortak akışa kadar büyümeye ve kültürler% 5 CO2.
Not: büyüme ortamının seçimi, hücre tipine bağlıdır. Burada kullanılan plazmidler higromisin ve neomisin hem seçim kaseti taşıyan göz önüne alındığında, klonların stabil bir seçim higromisin seçimi neomisin ile yapılabilir, ancak neomisin miktarı, her hücre türü için tolerans seviyelerinin tutturulması için optimize edilmesi gerekmektedir. - Kültür ortamına colcemid (0.4 ug / ml) ilave edin ve 90 dakika metaph hücreleri yakalamak için inkübease. Farklı hücre tipleri kullanıldığında, deneysel olarak uygun metafaz tutuklama colcemid ve maruz kalma süresi (60, 90 ve 120 dakika) optimal konsantrasyonunu belirlemek.
- Yıkama hücreleri, hücreler 3-5 mL% 0.25 tripsin solüsyonu eklenip hücreleri ayırmak için 5 dakika boyunca inkübe 1X Dulbecco PBS (DPBS), tripsinize 10 ml 2x. % 10 FBS ihtiva eden ortamın eşit miktarda tripsin inaktive.
- , 4 ° C'de 1000 x g'de 2 dakika süre ile hücreler santrifüj hücre topağından orta aspire ve DPBS ile yıkama hücreleri. hücrelerin yeniden askıya DPBS 200 ul bırakarak aspire tüm DPBS. Sağlamak hücreler iyice karıştırılır ve kümeleri dağılmış olduğu. mix ve kümeleri dağıtmak ve vorteks önlemek için titrek ve nazik pipetleme kullanın.
- Hipotonik çözelti 5 ml (yani, 75 mM KCI) yatay olarak 15 ml tüp dönerken 37 ° C'de damla damla önceden ısıtılmış ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Malzeme ve Reagen Tablosu görünelde edilir ve hipotonik bir çözüm nasıl yapılacağı hakkında bilgi almak için ts.
- Her yıkamadan sonra hücrelerin yeniden askıya hipotonik solüsyon yaklaşık 200 ul bırakarak 2.5 3x - 5 4 ° C'de dakika ve yineleme için 120 xg'de Santrifüj hücreleri 2.4 adımları. 3 yıkar sonunda, pelet gözle görülür beyaz ve şişmiş olduğundan emin olun.
- Carnoy Sabitleme çözeltisi 200 ul pelet yeniden askıya artı 1: Carnoy Sabitleme çözeltisi içinde 8, 1:16 seyreltme: 2, 1: 4, 1. üzerinde yaklaşık 1 cm bir kuru, temiz slayt üzerine her seyreltme 10 ul damla ve hemen 30 saniye süreyle kaynar su sıcak buhara yayılmış serbest tarafını ortaya çıkarmak. Carnoy Sabitleme çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.
- 0.1 ug / ile, oda sıcaklığında, leke yayılır Kuru mi Hoechst-33342 Coplin kavanoza 15-20 dakika boyunca daldırma ile ve yıkama DPBS ile 3 kez. Hoechst-33342 çözüm yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız. <li> Görünüm 40X büyütmede floresan / faz-kontrast mikroskop yayılır. Yayılma hazırlık optimize sonra, formalar Hoechst-33342 ile boyanmış olması gerekmez. Görünüm Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi yayılmış kalite ve ayırma belirlemek için 10X büyütmede faz-kontrast mikroskop yayılır (Şekil 3).
- Seçip sürgünün karşı tarafında bir elmas noktası Marker iyi yayılır daire (örneğin, yayılabilir içermeyen tarafı).
- Mağaza bir aya kadar -20 ° C'de yayılır. neme maruz kalmaktan kaçının.
Yerinde Hibridizasyon 3. Floresan (FISH)
- Yayılır, stabilize edici ve dehidre
Not: -20 ° C'de muhafaza edildiğinde dengeye metafaz kromozom, oda sıcaklığına kadar yayılır. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.- Inkübe metafaz kromozom 200 ul RNaz A ile yayılır37 ° C'de 1 saat.
- Yıkama her biri 10 mm HCI çözeltisi ile durulama, ardından 5 dakika boyunca iki kez 2 x SSC tamponu-slaytlar.
- Deiyonize H2O ile yıkayın ve her biri 5 dakika için 2X-SSC tamponu ile iki kez yıkanır, 37 ° C'de 10 dakika süre ile% 1 pepsin ile yayılır inkübe edin.
- 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile yayılır inkübe ve her biri 5 dakika iki kez 2 x SSC tamponu içinde yıkayın.
- % 70,% 80 ve% 95 etanol: etanol seri 2 dakika süreyle inkübe edilerek yayılır dihidrat.
- Hava kuru slaytlar.
- Melezleme L1 -etiketli retrotransposition probları ile yayılır (yani, sneo)
DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun. elde etmek ve reaktifler yapmak için nasıl Malzeme ve bilgi için Reaktifler Tablo bakınız.- 10 dakika süre ile 72 ° C'de hibridizasyon tamponuna sneo 30 ng, ısıtılır ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca soğutulur.
- e sneo prob çözeltisi 30 ul ekleach yaymak, lamel ile kaplayın ve kauçuk çimento ile kenarları mühür. hiçbir kabarcık oluşumunu sağlamak.
- yavaş yavaş 37 ° C'ye kadar sıcaklık düşüşü ve 37 ° C de karanlık bir nemlendirilmiş oda içinde bir gece boyunca inkübe bir sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca 72 ° C'de slayt ısıtın.
- Yıkama ve Görüntüleme (veya İkincil Antikor ilavesi)
DİKKAT: Doğrudan etiketli problar için, her zaman ışıktan uzak tutun.
NOT: Malzeme ve nasıl hazırlanacağı konusunda bilgi almak için Reaktifler Tablo bakınız. tüm kromozom yayılmasını karşılamak için yeterli hacimde kullanılması tavsiye edilir. lamel eklendiğinde fazla hacim kaybolur unutmayın.- lamelleri kaldırmak için 2x SSC tamponu slaytlar daldırın.
- 5 dakika boyunca 45 ° C'de 2x SSC tamponu-batırılarak slaytlar yıkayın.
- 5 dakika sonra 2x 45 ° C'de yıkama tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
- 10 dakika boyunca 45 ° C'de 0.1X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
- 10 dakika boyunca 45 ° C 'de 2X SSC tamponu içine daldırma ile slaytlar yıkayın.
Not: Talep bir su banyosu içinde önerilen tamponu ihtiva eden bir Coplin Kavanoz, 45 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlanır. - Soğuk oda sıcaklığına kadar slaytlar ve algılama tampon slaytlar dengeye.
- direkt etiketli problar için, 3.4.10 adıma geçin.
- Dolaylı etiketli problar için, 20-30 dakika süreyle ve tampon engelleme blok DPBS 3x yıkayın.
- 1 saat boyunca (blokaj tamponu örneğin, 5 ug / ml streptavidin-FITC veya αCY3) ikincil antikor, 50 ul inkübe edin.
- iki kez 5 dakika süreyle 2x SSC slaytlar yıkayın.
- 10 dakika süre ile Hoechst-33342 solüsyonuna (0.1 ug / ml) ile karşıt.
NOT: Bu boyama prob ile eş-lokalizasyonu için kromozom leke yapılır. - , Montaj orta bir damla ekleyin, DPBS 3x yıkayın lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile kenarları mühür.
- 40X ma floresan mikroskop kullanılarak L1 retrotransposition analizgnification.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L1 retrotransposition vektörünün şematik bir diyagramıdır, Şekil 1 'de sunulmuştur. Vektörü sens yönlenmede bir globin intronu ile kesilmiş ve SD ve SA siteleri tarafından sandviç L1 ORF antisens yönlenmede bir neomisin geni içerir. Kararlı biçimde bir kromozomda entegre olduğunda, L1 mRNA Birleştirilen CMV ve L1-5'UTR promotörünün (Şekil 1) transkripsiyonu. RNA işlenmesi sırasında, globin intron neomisin genin dışında birleştirilir. Neo L1 RNA paketlenmiş transloke ve tam uzunluğu ya da tepe bölümü kesik ekleme ya da genom içine entegre edilir. Belirtildiği gibi, L1 retrotransposition spliced neomisin (Şekil 1) için spesifik problar kullanılarak FISH ile izlenebilir.
Şekil 2, labele ile neomisin prob şematik bir temsilini göstermektedird o nedeniyle uyarma dalga boyları farklılıklardan boyutu ve yetersiz floresan daha büyük olduğunu araştırdı. CY3 ve FITC etidyum bromür lekeli DNA'dan daha farklı dalga boylarında heyecanlandırmak unutmayın.
2, 1: 4, 1: 8 ve 1:16 seyreltileri ve 10x büyütmede çekirdekten yayılan yoğunluğu, dağıtım ve mesafe değerlendirilen her yayılması (metafaz kromozom yayılır yoğunluğu 1 orijinal stok çözelti seyreltilerek belirlenmiştir Şekil 3A). Sonuçlar yanı sıra eşit olarak dağıtılmış ve iyi aralıklı yayılır (Şekil 3A-iii-iv) clumpy yüksek yoğunluklu, gösterir ve yayılır (Şekil 3A-i ii) patlattı. eşit bir dağılım bir sonraki analiz için seçilmiştir sahip düşük yoğunluklu yayılır.
Kromozom yayılır Hoechst boyası ve yayılma kalite s kromozomların uzunluğuna, yuvarlaklık değerlendirilecektir ile boyandıpreads ve inter-kromozom mesafe (Şekil 3B). Bu endeksler hücreler colcemid, hipotonik bir solüsyon, Carnoy Sabitleme çözeltisi ve / veya hücre kromozomu serbest bırakmak için baskın edildiği şekilde tedavi edilen zamanın uzunluğu etkilenmiştir. Hücreler hipotonik bir solüsyon içerisinde kısa bir süre için kuluçkalanmıştır durumunda, kromozom yayılır sıkı dokunmuş ve bireysel kromozomlar (Şekil 3B-i) görselleştirmek için zor oldu. Öte yandan, hipotonik bir solüsyon içerisinde uzun inkübasyon, çekirdeklerin yırtılması sonuçlanan kromozom dağılma ve / veya kromozom kaybı (Şekil 3B-II) '. Colcemid bölgesindeki uzun inkubasyon metafaz hücrelerinin sayısı arttı, ama kromozom kondansasyonu yol (Şekil 3B-III). Bu nedenle, kaliteli kromozom yayılmış colcemid ve hipotonik KCl çözeltisi hem de optimum kuluçka dönemleri gerektirir. 37 ° C'de hipotonik bir solüsyon içerisinde colcemid, 20 Bizim ellerde, bir 90 dakika inkübasyonC ve hücreleri patlamaya sıcak buhar kullanımı, yüksek kaliteli sürülen (Şekil 3B-IV) üretimi için en uygun koşulların olduğu bulunmuştur.
Kromozom yayılır L1 retrotransposition sneo hedef problar kullanılarak boyandı. Prob her iki durumda da L1 retrotransposition vahşi tip L1'i ifade eden hücrelerde, sadece görülen olduğunu göstermek için FITC ve CY3 hem ile etiketlenmiştir (Şekil 4). Resim boyama, tek başına vektör omurgası ifade eden hücrelerde gözlendi (Şekil 4, her bir fluorofor için üst ve alt paneller karşılaştırın). Bizim ellerde, prob sinyali tek retrotransposition olaylarını temsil eden sinyalin ezici çoğunluğu, çekirdeklerin% 80-90 tespit edildi. Biz sadece birden fazla ekleme ile çekirdeklerinde retrotransposition attı ve yayılma kalitesi her zaman FISH önce incelenmiştir.
L1 retrotransposition vektörü Şekil 1. şematik diyagramı. Diyagram Tam veya kısaltılmış L1 eklemeler giden hedef asal ters transkripsiyon sürecini anlatıyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sneo ve etiketsiz neomisin sondalar Etiketli Şekil 2.. Etiketli prob az floresan sergiler ve etiketsiz sonda ile karşılaştırıldığında boyut olarak daha büyüktür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. Faz-kontrast (Parlak Field) ve Hoechst boyası kromozom yayılır rakam. A) yayılır seyreltme iyi aralıklı hazırlıklarını elde gösterir. Ölçek çubuğu colcemid, hipotonik solüsyon, Carnoy Sabitleme çözüm ve yayılma kalitesine patlama etkisini gösteren 50 mikron. B) Hoechst boyası kromozom olduğunu. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
L1 retrotransposition Şekil 4. FISH analizi. Sneo boyanması kontrol hücrelerinde yoktur, fakat L1 vahşi tip vektör ifade eden hücrelerde mevcuttur. Ölçek çubuğu 10 mm.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Böyle tüm genom dizileme, ters PCR ve güney blot olarak metodolojileri L1 retrotransposition incelemek için istihdam edilmiştir. Bu metodolojiler L1 eklemeleri genomları içinde meydana nerede yerini son derece değerli olmasına rağmen, hepsi için bir karıştırıcı zorluk dizileri yeniden birleştirmek için-siliko programlama için ihtiyaçtır. Burada açıklanan BALIK yöntemi, özellikle kültür hücrelerinde ektopik L1 retrotransposition analizleri gerektiren çalışma durumunda, bu yöntemleri tamamlayacak şekilde tasarlanmıştır. yaklaşım retrotransposition etkinlikleri nicel ve nitel değerlendirilmesi için kullanılan ve çekirdekler, fazlar arası uygulanabilir. Bu metodoloji ektopik L1 ekleme siteleri 16 belirlemek için kullanılan müteakip in-siliko dizi hizalama yöntemleri doğruluğunu sahiptir. dizilerin hizalanması nedeniyle homopolimerleri oluşumuna belirsiz olabilir tekrar sequen iseCES dizilerin underrepresentation sonuçlanan şablonun primer genişletilmesi sırasında kaybolabilir. BALIK sondalar homopolimer tavlama ve bozulmamış tekrar dizilerinin 16 karşı önyargılı olması olası değildir, çünkü BALIK metodolojisi bu sorunların üstesinden gelebilir. Buna ek olarak, hücre kültürü bazlı retrotransposition deneylerine kıyasla, balık tek bir çekirdek seviyesinde retrotransposition oranlarını belirleyebilir. Bu nedenle, bu yaklaşım çerçevesinde ve birden çok eklemeler tek çekirdekler 16 içine oluşabilir retrotransposition oranlarının tahmini üzerinde hem önler. NGS elde edilen son veriler, hücre kültürü tabanlı metodolojileri retrotransposition frekansları 25 hafife doğruladı.
Genç L1S eklemek için tercih ve bir hedefleme mekanizması genomu içindeki bu eklemeleri doğrudan varolup olmadığını nerede belirsizdir. Yukarıdaki metodoloji kullanılarak biz L1 geni kötü yeniden içine tercihen ekler olduğunu göstermiştirgenomun 16 gions. Diğerleri L1 dizilerinin bolluğu daha az gen yoğunluğu 17,18 ile kromozom artışı olduğunu göstermiştir. Birlikte, bu bulgular hücreye tehditler genomun "daha az aktif" bölgeye L1 sokulmasıyla minimize edilmektedir yerleştirme düzenlenmiş modu öneririz. alt organizmalarda transpoze eleman hareketinin desen bu yorumuna destek vermiştir. Örneğin, bölünmüş maya retrotranspozon, Tf1 gen promoteri yukan zaman% 95 entegre ve bu genlerin çoğu stres düzenlenmesi 19,20 katılmaktadırlar. Azot ulaflamamaktad maya hücreleri, Ty5 yerine heterokromatin bölgelerin 21 ORF entegre. Mısırdaki deneyler, DNA transposon entegrasyonun influen gösterilmiştir alacalı mısır renkli fenotipleri ve VvTFL1A geninin promotör bölgesi içine Hatvine1-RRM, DNA transpozonun entegrasyonuna yol göstermiştirdallanma desen ve asma 22,23 meyve boyutunu ce.
Burada ayrıntılı BALIK metodolojisi başarısı için kritik adımlar iyi kromozom yayılır ve uygun etiketleme, arınma ve probların hibridizasyon nesil vardır. sondalar düzgün temizlenmiş değilse, ortaya çıkan yüksek arka plan sinyali zor kromozomlar bağlama prob çözmek için yapacaktır. Sondalar tercihen, jelle saflaştırıldı dNTP kalıntı floresan ortadan kaldırmak için olmalıdır. Ayrıca, fark Carnoy Sabitleme çözeltisi içinde inkübe edilmektedir süre iyi bir kromozom yayılır hazırlanması önemlidir. çok uzun olursa, hücre zarı erken patlama ve kromozom kaybına neden olabilir. çok kısa ise, bunun nedeni eksik membran rüptürü uygun yayılır elde etmek zor olabilir. formamid miktarı / konsantrasyon kromozomlardalerde odak tespit eder ve nedenle en iyi sonuçlar için deneysel olarak optimize etmek için önemlidir. Tüm yıkar ens için kapsamlı olmalıtüm ilişkisiz sondalar ve ikincil antikorlar yıkanır ure.
Sonuç olarak, burada tarif edilen balık yöntemi, hem tam uzunluk ve tepe bölümü kesik ektopik L1 retrotransposition olayları tespit etmek için kullanılabilir ve retrotransposition göstergesi kaset olarak yeşil floresan protein (GFP) kullanan diğer retrotransposition vektörlerine uygulanabilir. Tam uzunluktaki L1 eklemeleri bu yöntemi kullanarak tespit edilebilir, ancak bunun nedeni genomu içerisinde kesik L1 s sayıda yeni endojen kesik eklemeleri ayırt olmaz. Prob erişilebilirlik da artış heterochromatin oluşumu 16,24 kısıtlanmış olabilir. Ancak, BALIK prob içinde LNA dahil prob tavlama geliştirmek için kullanılabilir. Sneo tespiti retrotransposition tam döngüsü üzerine şarta ve / silme kaçırılmaması gereken prob daha küçük Eklemeler.
yüklenebileceğini deney detaylı açıklamalar içingeçme, bu vektörlerin kullanımı L1 proteinleri ve retrotransposition ifadesi, özelliği, H, 12,16 çalışır bakınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar potansiyel rakip çıkarları beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labeling Probes | |||
| Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
| GO Tag 10x colorless buffer | Promega | M3178 | |
| Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2 mM and dTTP to 1.5 mM in nuclease free water. |
| dUTP-16-Biotin (0.5 mM) | Roche | 11093070910 | |
| dUTP-FITC (0.5 mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
| dUTP-CY3 (0.5 mM) | Sigma | GEPA53022 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
| MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
| NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
| PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Preparing chromosome Spreads | |||
| Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/ml |
| 1 M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1 M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
| Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Acetic acid | Sigma | 320099 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
| Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 min and inactive with equal volume of complete media. |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
| Beaker (600 ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
| Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
| Reagents and Materials for FISH | |||
| Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| Tween-20 | Sigma | F1379 | |
| Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
| HCl (N) | Sigma | 38283 | |
| Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| Rnase A | Sigma | R4642 | |
| Pepsin | Sigma | P6887 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/ml. |
| Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
| Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
| Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
| Cover slides | VWR | 48366067 | |
| Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
| Fluorescence Microscope | |||
| 20x Saline-Sodium Citrate (20x SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 ml of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
| 1 mg/ml of Rnase A | Dilute 20x SSC buffer to 2x SSC buffer. Dissolve RNase A in 2x SSC buffer to a final concentration of 1 mg/ml. Make fresh solution every time. | ||
| 1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1% solution. Make fresh every time. | ||
| 4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 ml of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 ml, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 ml aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
| Wash Buffer | Combine 100 ml of Formamide (20%) with 2.5 ml of 20x SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 ml with molecular grade H2O. | ||
| Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/ml Salmon Sperm DNA in 2x SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are; titrate the amount. | ||
| Detection Buffer | Dilute 20x SSC buffer to 4x and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
| Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4x SSC buffer. | ||
| Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. | ||
References
- Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. Reverse transcriptase encoded by a human transposable element. Science. 254, 1808-1810 (1991).
- Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition. Cell. 87, 905-916 (1996).
- Clements, A. P., Singer, M. F. The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).
- Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).
- Khazina, E., et al. Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition. Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).
- Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1. J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).
- Martin, S. L. Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).
- Hohjoh, H., Singer, M. F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. EMBO J. 15, 630-639 (1996).
- Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro. EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).
- Szak, S. T., et al. Molecular archeology of L1 insertions in the human genome. Genome Biol. 3, (2002).
- Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).
- Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1. Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).
- Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. Ty elements transpose through an RNA intermediate. Cell. 40, 491-500 (1985).
- Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses. PNAS. 85, 2219-2223 (1988).
- Moran, J. V., et al. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells. Cell. 87, 917-927 (1996).
- Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13. Genomics. 104, 96-104 (2014).
- Rozen, S., et al. Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes. Nature. 423, 873-876 (2003).
- Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. How the gene content of human sex chromosomes evolved. Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).
- Leem, Y. E., et al. Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators. Mol Cell. 30, 98-107 (2008).
- Guo, Y., Levin, H. L. High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe. Genome Res. 20, 239-248 (2010).
- Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin. Mol Cell. 27, 289-299 (2007).
- McClintock, C. B. The origin and behavior of mutable loci in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).
- Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine. Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).
- Garcia-Perez, J. L., et al. Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells. Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma. Nat Med. 21 (9), (2015).
