Introduction
المكورات العنقودية (S. المذهبة) كما هو معروف الممرض أهم المسؤولين في جميع أنحاء العالم للعدوى داخل الثدي (IMI) في الماشية 1. الدراسة التي فورنييه وآخرون. 2 موضح في الأبقار السويسرية والدراسات التي Cosandey وآخرون. (3) وبوس وآخرون. 4 في الأبقار من 12 دولة أوروبية أن س. العنقودية الذهبية المعزولة من الأبقار IMI هي مجموعة غير متجانسة وراثيا. بواسطة PCR التضخيم من 16S-23S الريباسي المنطقة فاصل بين الجينات (RS-PCR)، تم الكشف عن ما مجموعه 17 المورثات في البداية في 101 العزلات مستقلة وبائيا 2. كان النمط الجيني B و C التركيب الوراثي (GTC) الأكثر شيوعا (80٪)، في حين أن الأخرى 15 المورثات (GTS) وقعت نادرا، مما يجعل كل 1-4٪ من العزلات. على المستوى الأوروبي 3، GTB، GTC، GTF، كان GTI، وGTR التراكيب الوراثية أهم تضم 76٪ من جميع سلالات تحليلها (ن = 456). كانت تقع GTB في وسط أوروبا ثhereas وزعت على نطاق واسع في المورثات الأخرى. شملت 24٪ المتبقية من سلالات 41 المورثات، وكثير منهم، ومع ذلك، لوحظت مرة واحدة فقط.
أثبتت الدراسات التي فورنييه وآخرون. 2، Cosandey وآخرون. 3، وجرابر وآخرون. 5 أيضا أن المورثات كانت مرتبطة إلى حد كبير مع نمط الفوعة الجينات الخاصة بهم، وكذلك في سويسرا بصفتها ممثلة على المستوى الأوروبي. كشف مزيد من الدراسات اختلافات كبيرة في انتشار IMI بين س. أصيب النظر GTB، تصل إلى 87٪ من الأبقار في قطيع من هذا النمط الجيني: الذهبية GTB، GTC والمورثات الأخرى 2،5. في حالة GTC ومن المورثات الأخرى، ومع ذلك، IMI تم العثور فقط في 1-2 الأبقار من قطيع.
IMI التي تسببها س. الذهبية، يؤدي عادة إلى التهاب في الغدد الثديية المقابلة وبزيادة الخلايا الالتهابية في الحليب. ونتيجة لذلك، وشارك الخلايا الجسديةUNTS في الحليب (SCC)، المؤشر الرئيسي للجودة الحليب في معظم البلدان، وتزداد مما أدى إلى سعر الحليب انخفضت أو حتى توقف التسليم.
إلى جانب RS-PCR من فورنييه وآخرون. 2، وقد وصفت أساليب الكتابة الأخرى لعملية التصنيف الفرعي لسلالات الأبقار من S. الذهبية 8-11. تشمل اثنين من تلك الشائعة في الكتابة سبا 12 و متعدد الحالة رقم تسلسل الكتابة (MLST) 13. ويستند السابق واحد على تسلسل الحمض النووي في المنطقة هل المتغيرة من الجين الترميز سبا العنقودية للبروتين A، في حين أن واحدة الأخير يتطلب تسلسل 7 جينات التدبير المنزلي. هذا يعني أن واحدا 12 وسبعة تقارير إنجاز المشروعات 13، على التوالي، في حاجة إلى أن يقوم، تليها تنقية amplicon، رد فعل التسلسل والتحليل باستخدام معدات معينة. مقارنة RS-PCR، وهذه الأساليب تتطلب جهدا إضافيا كبيرا في المختبر مما أدى إلى سرعة عينة انخفاض وارتفاع التكاليف. الإنتاجية منخفضة بشكل خاص لPFGE. وبالنظر إلى قرار من هذه الأساليب لسلالات الأبقار من S. الذهبية، RS-PCR على الأقل جيدة كما سبا كتابة 4 وأفضل من MLST 4 أو PFGE 15.
أظهرت جميع هذه الطرق بما في ذلك الكتابة الثنائية 13 فعاليتها في الحصول على مزيد من التبصر في التسبب في الأبقار IMI التي تسببها س. الذهبية، ولكن بسبب القيود المذكورة هم أقل ملاءمة للتحقيقات سريرية واسعة النطاق. وبالإضافة إلى ذلك، التنميط الجيني عن طريق RS-PCR كما وصفها فورنييه وآخرون. 2 يسمح للتنبؤ موثوق لالوبائية واحتمال المسببة للأمراض من س. الذهبية تشارك في الأبقار IMI، قيمتين الرئيسية في الطب البيطري السريري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المكورات العنقودية الذهبية العزلات
- نشر 10 ميكرولتر من س. الذهبية ثقافة الأسهم أو مستعمرة واحدة نمت على وسيلة انتقائية على لوحات أجار كولومبيا تحتوي على 5٪ الدم الأغنام (BA).
- احتضان هوائيا على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة إلى 24 ساعة.
2. استخراج الحمض النووي
- إعداد عازلة هاتف تحتوي على 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك و 10 ملي نا 2 EDTA، ودرجة الحموضة 8.5. إعداد قسامات والأوتوكلاف على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- جمع 1 مستعمرة من BA باستخدام حلقة عقيمة البلاستيك أو اختيار الأسنان الخشبي المعقم و resuspend في 100 هاتف ميكرولتر. استخدام 1.5 مل أنابيب مع قبعات المسمار.
- احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. بعد ذلك، ضع عينات فورا على الجليد الرطب.
- تمييع عينات 1: 100 في H 2 O مناسبة لPCR (= قالب الحمض النووي للPCR). يمكن حفظ العينات غير المخفف والمخفف في -20 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
3. RS-PCR
- تشغيل برنامج الدراجات التالية في cycler على PCR القياسية: 15 دقيقة 95 درجة مئوية، تليها 27 دورات تضم 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها منحدر 2 دقيقة والصلب في 55 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. بعد 2 دقيقة منحدر آخر، تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. إنهاء PCR بواسطة ملحق النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تليها تهدئة إلى 4 درجات مئوية.
ملاحظة: منتجات PCR يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 5 أيام. - لكل شوط من RS-PCR تشمل مراقبة إيجابية، أي عينة مع النمط الجيني المعروف (عادة GTB)، والسيطرة السلبية (H 2 O).
4. الكهربائي
- استخدام عدة الكهربائي المنمنمة التجارية لالحمض النووي (مجموعة MED) معامع bioanalyzer متصلة بجهاز كمبيوتر والبرامج المثبتة. دراسة الأدلة المقابلة من الشركة المصنعة بعناية.
- إعداد محطة فتيلة رقاقة وضبط مقطع حقنة وفقا لدليل من الشركة المصنعة.
- تحضير مزيج هلام صباغة وفقا لدليل من الشركة المصنعة.
- تحميل مزيج هلام صباغة (وفقا لدليل من الشركة المصنعة).
- تتوازن مزيج هلام الصبغة لRT لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- وضع رقاقة الحمض النووي الجديد على محطة رقاقة فتيلة. ماصة 9 ميكرولتر من هلام الصبغة في G. جيدا ملحوظ
- تأكد من أن يتم وضع المكبس في 1 مل ثم قم بإغلاق محطة رقاقة فتيلة. الصحافة المكبس حتى يتم عقد من قبل مقطع حقنة. انتظر بالضبط لمدة 30 ثانية ثم حرر مقطع حقنة.
- الانتظار لمدة 5 ثوان. سحب ببطء مرة أخرى المكبس إلى 1 مل الموقف.
- فتح رقاقة محطة فتيلة وماصة 9 ميكرولتر من هلام الصبغة في كل من الآبار ملحوظ 'G'.
- تحميل Marker
- ماصة 5 ميكرولتر من علامة في جميع الآبار عينة 12 وفي سلم أيضا. لا تترك أي من هذه الآبار 13 فارغة.
- تحميل سلم والعينات.
- ماصة 1 ميكرولتر من سلم ال DNA إلى تميز جيدا مع علامة سلم.
- ماصة 1 ميكرولتر من عينة (الآبار المستخدمة) أو 1 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (الآبار غير المستخدمة).
- وضع رقاقة أفقيا في محول ودوامة لمدة 1 دقيقة في 2400 دورة في الدقيقة.
- تشغيل رقاقة في bioanalyzer خلال 5 دقائق.
- تشغيل تحليل
- بدء bioanalyzer وجهاز كمبيوتر متصل. فتح البرنامج.
- فتح غطاء bioanalyzer ووضع رقاقة في حامل رقاقة (شريحة يناسب طريقة واحدة فقط). إغلاق الغطاء بعناية.
- في سياق صك البرنامج حدد "الكهربائي"> "dsDNA"> "DNA 7500". استعرض بادئة الملف الحالي من البرنامج أو تعديله.
- انقر على زر البداية موجودة في البرنامج. أدخل أسماء عينة في البرنامج. عندما يتم الانتهاء من تشغيل رقاقة (بعد حوالي 30 دقيقة) يظهر نهاية الرسالة تشغيل في البرنامج bioanalyzer.
- إزالة الشريحة وتنظيف الأقطاب من bioanalyzer وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
5. استنتاج التركيب الوراثي من الكهربائي الملف الشخصي
- تحميل البرنامج محل (البرنامج متاح بحرية من المؤلفين).
- بيانات الاستيراد إشارة إلى البرنامج محل: "ملف"> "استيراد بيانات المرجع"
- فتح الكهربائي تشغيل في سياق البيانات من البرنامج bioanalyzer. حدد ملف تعريف الكهربائي من عينة واحدة.
- تحقق من القمم ذات الصلة.
- استخدام البرنامج محل للتحقق من القمم ذات الصلة: "أدوات"> "يعني الإسفار". أدخل في مربع "الإسفار"وأشارت القيم مضان وحدات مضان (FU) لأنها يمكن أن تقرأ من برنامج bioanalyzer. إدراج 4 (3) قمم مع أعلى مضان في ترتيب تصاعدي ومفصولة بفواصل. مثال: 126130132137.
ملاحظة: إذا لم يكن كل هذه القمم FU بالرمز البرنامج bioanalyzer، فإنها تحتاج إلى أن يقدر من خلال قراءة لهم للخروج من هذه المؤامرة.
- استخدام البرنامج محل للتحقق من القمم ذات الصلة: "أدوات"> "يعني الإسفار". أدخل في مربع "الإسفار"وأشارت القيم مضان وحدات مضان (FU) لأنها يمكن أن تقرأ من برنامج bioanalyzer. إدراج 4 (3) قمم مع أعلى مضان في ترتيب تصاعدي ومفصولة بفواصل. مثال: 126130132137.
- اضغط على زر "حساب". الذروة هي ذات الصلة إذا تجاوز مضان احظ قيمة معينة في مربع "ذروة ارتفاع الحد الأدنى".
- استدلال على التركيب الوراثي.
- إدراج في محل النص "قمم الإدخال (بي بي)" أحجام في بي بي من كل القمم ذات الصلة في ترتيب تصاعدي ومفصولة بفواصل. على سبيل المثال: 440.462.519.579.637.
ملاحظة: إذا يشار ليس كل من هذه الأحجام الذروة من قبل البرنامج bioanalyzer، فإنها تحتاج إلى أن يقدر من خلال قراءة لهم للخروج من هذه المؤامرة.
- إدراج في محل النص "قمم الإدخال (بي بي)" أحجام في بي بي من كل القمم ذات الصلة في ترتيب تصاعدي ومفصولة بفواصل. على سبيل المثال: 440.462.519.579.637.
- اضغط على زر "حساب".
- في القائمةمربع، والبحث عن الحد الأدنى المربعة مسافة Mahalanobis "D2M". إذا كانت قيمة P المقابلة الحق في ذلك هو ≥0.05 ثم احتمال هو ≥5٪ أن فرضية H باطل 0 تم رفض (H 0: لوحظ والتعريف إشارة متطابقة) وهذا يعني أن الشخصية احظ قبلت أن تكون مطابقة ل البيانات الشخصية المرجعية من النمط الجيني المشار إليه.
- إذا D2M هو الحد الأدنى لكن الحقل من قيمة P المقابلة فارغة، رفض H 0 مع وجود احتمال <5٪.
ملاحظة: هذا يعني أن الشخصية هي غير متكافئة على الرغم من D2M هو الحد الأدنى. وقد يؤدي مثل هذه النتيجة من غير الظروف العادية الكهربائي.- لتصحيح هذه الانحرافات، أدخل في مربع النص "لوحظ الذروة (بي بي)" قيمة 395 واضغط على زر "حساب". التحقق مرة أخرى لأدنى D2M و≥0.05 قيمة P المقابلة. إذا لم يكن ناجحا، حاول القيم 405، 415، و 425.
ملاحظة: في بعض الأحيان خطوات أصغر، بل هيالمشار إليها. إذا كان لا يزال لم تكن ناجحة، والوضع احظ غير موجود في البيانات المرجعية، قد يكون من النمط الجيني الجديد أو البديل.
- لتصحيح هذه الانحرافات، أدخل في مربع النص "لوحظ الذروة (بي بي)" قيمة 395 واضغط على زر "حساب". التحقق مرة أخرى لأدنى D2M و≥0.05 قيمة P المقابلة. إذا لم يكن ناجحا، حاول القيم 405، 415، و 425.
- لمحات مختلفة
- كرر الخطوات من 5،6-5،9 لكل ملف على حدة الكهربائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعريف النمط الجيني ومشتقاته
ويعتبر ملف تعريف الكهربي مختلفة في الفرقة أكثر من واحد من كل المورثات التي تم تحديدها باعتبارها النمط الجيني الجديد. يتم تسمية المورثات جديدة وتمديد وفقا لفورنييه وآخرون. 5 المؤدية إلى المورثات GTA لGTZ، تليها المورثات GTAA إلى GTAZ، وGTBA إلى GTBZ، وGTCA إلى GTCC في الوقت الحاضر. ويعتبر الاختلاف في فرقة واحدة فقط بوصفها البديل الوراثي. يشار إلى أنه مع الأرقام الرومانية superscripted بعد اسم النمط الجيني (على سبيل المثال، GTRI، GTRII). في المجموع، هناك حاليا 141 المورثات والمتغيرات في قاعدة البيانات المرجعية.
وفقا للشروط المبينة أعلاه، RS-PCR بواسطة فورنييه وآخرون. 5 غير قابلة للتكرار للغاية لالوراثي سلالات س. الذهبية. تحديد نهائي لالنمط الجيني المعروف أو البديل من الممكن دائما إذا يمكن استبعاد المشاكل التقنية. ويرد نتيجة نموذجية في الشكل 1 يدل على الكهربائي من 12 المنتجات RS-PCR وقدم في وضع هلام الزائفة من قبل البرنامج bioanalyzer. تتميز كل حارة من وجود نمط من اثنين أو أكثر من العصابات PCR وفرقة علامة في الجبهة والفرقة علامة في نهاية المطاف. النقر المزدوج في ممر يفتح المقابل، لمحة الكهربي قياس الواقع في نافذة منفصلة. البرنامج bioanalyzer يسمح، من بين الاحتمالات الأخرى، قمم المرصودة قراءتها مثل حجم وحدات الفلورسنت FU (الشكل 2) أو في سنة مضت (الشكل 3) حيث تقابل قمة واحدة الفرقة بالضبط إلى واحد في وضع شبه هلام. مطلوب قراءة الذروة في FU لتقييم القمم ذات الصلة من التشكيل الجانبي في البرنامج محل (الشكل 4)، والقراءة في شركة بريتيش بتروليوم لاستنتاج التركيب الوراثي. يتم تعريف القمم غير ذات صلة في البرنامج محل كما البازلاء الصغيرةكانساس الذي FU مضان الملاحظ هو أقل من 40٪ من المتوسط الهندسي ل4 (3) قمم مع أعلى مضان. لوحظ أنها عادة عندما يكون هناك فائض من الحمض النووي في RS-PCR (> 30 نانوغرام النقي DNA / الفحص) 2.
وكمثال على ذلك، يستدل التركيب الوراثي للعينة 211 موجودة في الشكل 1. وكشف التحليل البصري للالشخصي الكهربي في الشكل 2 (البرمجيات bioanalyzer)، وتحليل مع البرنامج محل باستخدام أداة لاختبار قمم لا صلة لها بالموضوع 6 القمم ذات الصلة مع أحجام الذروة من 395 سنة مضت، 432 نقطة أساس و 453 نقطة أساس و 505 نقطة أساس، 567 سنة مضت، و 622 سنة مضت (الشكل 3). تمتلئ هذه القيم في ومفصولة بفواصل في مربع النص "قمم الإدخال (بي بي)" من البرنامج محل (الشكل 4). لتصحيح الانحرافات المدى محددة، تم إدراج قيمة 415 في مربع النص "لوحظ الذروة (بي بي)" (الشكل 4). بعد الضغط على "Calculate "الزر، يتم عرض قائمة بأمر من النمط الجيني جنبا إلى جنب مع D2M المسافة Mahalanobis المربعة بين الشخصي الوراثي الاستعلام والمشار إليها. انتقل قائمة تبحث عن الحد الأدنى D2M. في هذه الحالة، والحد الأدنى D2M يساوي 4.499 (الشكل 4) مع قيمة ف ≥0.05، وهذا يعني أن الشخصية الاستعلام لا يختلف كثيرا عن واحد من GTB.
يشار إلى المتغيرات من المورثات كما _I إلى _XV في البرنامج محل. في حالة النمط الجيني B، هناك بدائل ثلاثة أشارت GBT الأول، GBT الثاني، والثالث GBT كما B_I، B_II، وB_III في البرنامج (الشكل 4).
شريحة من عدة MED يسمح المنتجات تحليل من 12 RS-PCR في وقت واحد. إذا كانت أقل من المنتجات المتاحة، لا بد من تحميلها مع الماء منزوع الأيونات الآبار المتبقية. لا يجوز تفسير النتائج إلا إذا كانت الضوابط طncluded في RS-PCR هي مناسبة.
الشكل 1. الزائفة هلام يمثلون 12 المنتجات RS-PCR والمورثات المستنتجة. اثنا عشر سلالات مختلفة من S. وقد تم تحليل الذهبية من قبل RS-PCR باستخدام عدة MED جنبا إلى جنب مع bioanalyzer والبرامج المدرجة. الممر على الجانب الأيسر يظهر علامة أو "سلم" للمعايرة حجم النظام في بي بي. في الجزء العلوي من الرسومات، وجهت أسماء عينة وراثية المقابلة التي تم الحصول عليها بواسطة برنامج محل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التعريف الكهربائي للساmple 161 موجودة في الشكل 1. على أعلى قمم يشار إلى مضان قياس في FU. قمم تمييزها بصريا التي لم يتم الكشف عن الحاجة البرمجيات bioanalyzer أن يقدر من خلال قراءة لهم للخروج من هذه المؤامرة كما يؤديها للذروة مع قيمة مضان تقدر ب 113 FU (باللون الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3. الشخصي الكهربائي للعينة 211 الموجودة في الشكل 1. على أعلى قمم يشار حجمها في شركة بريتيش بتروليوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. لقطة من البرنامج محل في مربع النص "قمم الإدخال (بي بي)" تمتلئ أحجام ذروة العينة 211 من الرقم 3 في. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوة الأكثر أهمية الإجراء كله هو عندما يكون هناك فائض من الحمض النووي في RS-PCR (> 30 نانوغرام النقي DNA / الفحص) 2. بشكل عام، قرار من هذا التوصيف الأمثل إذا كان كل من مستويات الذروة التي بلغتها تبدأ وتنتهي عند خط الأساس. إذا قمتين متقاربة جدا، والقرار هو غير مكتمل. في ظل هذه الظروف، فإن البرنامج bioanalyzer قد يؤدي إلى تحديد الذروة غير مناسب بحيث يلزم تحديد اليدوي.
يتم تضمين كافة القمم فصل واضح وذات الصلة كما أعرب عن بي بي أو FU لمزيد من التحليلات. الكثير من قالب الحمض النووي للRS-PCR النتائج في القمم واسعة، وبالتالي إلى ذروته قرار التداخل وخلل في والقمم. وبالإضافة إلى ذلك، الهجرة أبطأ مما أدى إلى ذروتها الأحجام التي زادت زورا بحيث لم يعد من الممكن الاستدلال على النمط الجيني. وأخيرا، وعدد من القمم غير ذات صلة أكبر. لمحات مع أكثر من 3 القمم، قمة مع الحد الأقصى مضان وعادة لا يتجاوز 150 FU.
التنميط الجيني عن طريق RS-PCR كما هو موضح محدودة بسبب حقيقة أن الاستثمار في الآلات ضروري ومطلوب البرنامج محل مجانا. في الواقع، هناك حاجة إلى جهاز PCR القياسية وbioanalyzer. السابق رخيصة بدلا الوقت الحاضر في حين أن هذا الأخير هو أكثر تكلفة. حل الكهربائي القائم على الاغاروز لا يكفي حتى إذا تم استخدام عالية الدقة الاغاروز. في ظل هذه الظروف من الممكن فقط للتمييز بين GTB، GTC، وجميع المورثات الأخرى. تكاليف الكهربائي باستخدام عدة MED أو الكهربائي الاغاروز، ومع ذلك، هي مماثلة. عدة MED جنبا إلى جنب مع bioanalyzer مزيد يتفوق الكهربائي الاغاروز القياسية في هذه الطريقة أن الأسلوب الأخير هو مفيد، على التوالي إلى الأمام، والبيانات التي تم الحصول عليها موجودة في شكل الكتروني أن يبسط التخزين ومزيد من التحليل إلى حد كبير. أساسا كل bioanalyzers المتاحة تجاريا هي مناسبة لهذا النوع من التحليل شريطة أن يكون electrophoretقرار جيم كافية وحجم الحصول عليها من العصابات غير دقيقة وغير متحيزة.
حل RS-PCR لسلالات الأبقار من S. الذهبية هي عالية. انه لامر جيد مثل الكتابة ومنتجع صحي، وأفضل من MLST وPFGE 4،14. وبالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع جميع أساليب الكتابة الأخرى المستخدمة عادة لتصنيف الفرعي س. الذهبية (الكتابة سبا، MLST، PFGE)، من العينات التي هي عالية: استخراج الحمض النووي هو سهل وسريع، 96 عينات يمكن معالجتها في تشغيل واحد RCR (عادة O / N) والكهربائي وراثى استنتاج على التوالي إلى الأمام. تحليل كامل 96 عينة يتطلب يلة واحدة لPCR ويوم واحد لالكهربائي والتقييم. مزايا أخرى من RS-PCR بواسطة فورنييه وآخرون. 2 هي تكاليف منخفضة، لا سيما بالمقارنة مع MLST يتطلب سبعة الجينات لتكون متسلسلة في كلا الاتجاهين 15. وعلاوة على ذلك، RS-PCR هو الأسلوب توقع إعدائية والمرضية الوحيدة من سلالاتبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية تشارك في الأبقار التهاب الضرع 2،5، تنبئ الرئيسية في الطب البيطري السريري. وأخيرا، RS-PCR وحدها كافية للتحقيق في علم الأوبئة من الأبقار س. الذهبية 3،4،5،14. تفسير البيانات على التوالي إلى الأمام حتى في سياق دولي كما لوحظ سوى عدد قليل من المورثات الكبرى 2،3. لإجراء المقارنات وبائية بين الأبقار والسلالات البشرية، RS-PCR وكتابة سبا هي الأفضل معا كما يتم استخدام الأسلوب الأخير على نطاق واسع لعملية التصنيف الفرعي لسلالات الإنسان، حتى أن الكثير من البيانات المتاحة. MLST، ومع ذلك، هو مناسبة لتقييم قابلية التنسيل من السلالات 15 والنشوء والتطور تحليل 4.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها فيما يتعلق cycler على PCR، مجموعة MED، وbioanalyzer، كتيبات المقابلة هي أن يتم التشاور. في حالة طريقة RS-PCR، وتبسيط استكشاف الأخطاء وإصلاحها واسع إذا الضوابط PCR الإيجابية والسلبية المناسبة هي المؤتمر الوطني العراقيluded في كل شوط. إذا كان عنصر التحكم إيجابية سلبية، ومزيج PCR لا تتكون بشكل كاف و / أو كان الحمض النووي السيطرة المتدهورة. إذا كانت سيطرة سلبية (H 2 O) التي تم إنشاؤها واحد أو أكثر العصابات، كانت ملوثة مزيج PCR مع بعض الحمض النووي. في كلتا الحالتين، لا يجب أن تفسر على ملامح وRS-PCR أن تتكرر. إذا التفسير هو مستحيل بسبب مشكلة الكهربي، يحتاج الكهربائي إلى تكرار استخدام شريحة جديدة. تتميز مشاكل الكهربي عادة عدم كفاية الهجرة والمواءمة واحد أو كل من العصابات علامة الناتجة عن التحميل غير مناسب والتلاعب من الشريحة. إذا لا يمكن تفسير الشخصية الكهربائي التي حصل عليها البرنامج محل، يتم إرسال الملف الشخصي التي يولدها البرنامج bioanalyzer للمؤلف لمزيد من التقييم. عادة، تم استخدام الكثير من قالب الحمض النووي للRS-PCR أو التعريف يمثل النمط الجيني الجديد أو البديل الوراثي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al.
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
