Introduction
Staphylococcus (S. aureus) er kjent som den viktigste patogene verdensom ansvarlig for intramammary infeksjon (IMI) i storfe 1. Studien av Fournier et al. 2 viste i sveitsiske kuer og studier av Cosandey et al. 3 og Boss et al. 4 i kyr av 12 europeiske land som S. aureus isolert fra storfe IMI er en genetisk heterogen gruppe. Ved PCR amplifisering av 16S-23S rRNA intergeniske spacer region (RS-PCR), ble totalt 17 genotyper opprinnelig oppdaget i 101 epidemiologisk uavhengige isolater 2. Genotype B og genotype C (GTC) var mest vanlige (80%), mens de øvrige 15 genotyper (GTS) forekom sjelden, hver gjør 1-4% av alle isolater. På europeisk nivå 3, GTB, GTC, GTF, GTI, og GTR var de viktigste genotypene som omfatter 76% av alle analyserte stammer (n = 456). GTB befant seg i Sentral-Europa whereas de andre genotypene ble spres. De resterende 24% av stammene inkluderte 41 genotyper, mange av dem, men ble observert bare én gang.
Studiene av Fournier et al. 2, Cosandey et al. 3, og Graber et al., 5 videre demonstrert at genotypene ble sterkt forbundet med deres virulens-genet mønster, samt ved den sveitsiske som på europeisk nivå. Studiene videre avdekket store forskjeller i IMI-prevalens blant S. aureus GTB, GTC og de andre genotypene 2,5: vurderer GTB, opp til 87% av kuene i en flokk ble smittet av denne genotypen. I tilfelle av GTC og av de andre genotyper imidlertid IMI ble bare funnet i en til to kyr av en flokk.
IMI forårsaket av S. aureus, som normalt resulterer i betennelse av de tilsvarende brystkjertlene og en økning av inflammatoriske celler i melk. Som en konsekvens av den somatiske celle counts i melk (SCC), den viktig indikator på melkekvalitet i de fleste land, er økt som fører til en redusert melkepris eller levering stopp.
I tillegg til RS-PCR av Fournier et al. 2, har andre innskrivingsmetoder blitt beskrevet for inndeling i undergrupper storfe stammer av S. aureus 8-11. To vanligste er spa typing 12 og Multi Locus Sequence Typing (MLST) 13. Førstnevnte ene er basert på DNA-sekvensering av det variable avstandsområdet av stafylokokk-spa gen som koder for protein A, mens den sistnevnte ene krever sekvensering av 7 husholdningsgener. Dette betyr at man 12 og syv PCR 13, henholdsvis trenger å bli utført, etterfulgt av rensing amplikon, sekvenseringsreaksjon og analyse ved bruk av spesielt utstyr. Sammenlignet med RS-PCR, er disse fremgangsmåter krever et betydelig ekstra innsats i laboratoriet som resulterer i en lav prøver, og høye kostnader. Degjennomstrømning er spesielt lav for PFGE. Med tanke på oppløsning av disse metodene for storfe stammer av S. aureus, RS-PCR er minst like god som spa skrive fire og bedre enn MLST 4 eller PFGE 15.
Alle disse metodene inkludert binær typing 13 vist sin effektivitet i å få ytterligere innsikt i patogenesen av storfe IMI forårsaket av S. aureus, men på grunn av de begrensninger som er nevnt er de mindre egnet for større kliniske undersøkelser. I tillegg genotyping av RS-PCR som beskrevet av Fournier et al. 2 tillater pålitelig prediksjon av den epidemiologiske og den sykdomsfremkallende potensiale av S. aureus involvert i storfe IMI, to viktige verdier i klinisk veterinærmedisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Staphylococcus aureus isolater
- Spre 10 mL av S. aureus stamkultur eller en koloni dyrket på et selektivt medium på Columbia-agarplater inneholdende 5% saueblod (BA).
- Inkuberes aerobt ved 37 ° C i 18 timer til 24 timer.
2. DNA Extraction
- Fremstille TEL buffer inneholdende 10 mM Tris-HCl og 10 mM Na2EDTA, pH 8,5. Forbered alikvoter og autoklav ved 121 ° C i 15 min.
- Samle en koloni fra BA med en steril plast sløyfe eller et sterilt tre tann hakke og resuspender i 100 mL TEL. Bruk 1,5 ml rør med skrukork.
- Inkuber ved 95 ° C i 10 min. Etterpå plassere prøvene umiddelbart på våt is.
- Fortynn prøvene 1: 100 i H 2 O egnet for PCR (= templat DNA for PCR). De ikke-fortynnede og fortynnede prøver kan oppbevares ved -20 ° C i 1 måned.
3. RS-PCR
- Kjør følgende sykkel program i en standard PCR-cycler: 15 min 95 ° C, fulgt av 27 sykluser bestående av 94 ° C i 1 minutt, etterfulgt av en 2 min rampe og annealing ved 55 ° C i 7 min. Etter ytterligere 2 min rampen, strekker seg ved 72 ° C i 2 min. Avslutte PCR ved en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter etterfulgt av avkjøling ned til 4 ° C.
MERK: PCR-produktene kan lagres ved -20 ° C i 5 dager. - For hver kjøring av RS-PCR inkluderer en positiv kontroll, dvs. en prøve med en kjent genotype (normalt GTB), og en negativ kontroll (H 2 O).
4. Elektroforese
- Bruk en kommersiell miniatyrisert elektroforese kit for DNA (MED kit) sammenmed en Bioanalyzer koblet til en PC og installert programvare. Studer de tilsvarende manualer av produsenten nøye.
- Sett opp chip priming station og justere sprøyten klippet i henhold til bruksanvisningen til produsenten.
- Forbered gel-dye mix henhold til bruksanvisningen til produsenten.
- Legge gel-dye mix (i henhold til bruksanvisningen for produsenten).
- Ekvilibrere den gel-fargestoff blandingen til romtemperatur i 30 min før bruk.
- Sett nye DNA-brikken på chip priming station. Pipetter 9 mL av gel-dye i godt merket G.
- Pass på at stempelet er plassert i 1 ml og deretter lukke chip priming station. Trykk stempelet inntil det er holdt av sprøyten klippet. Vent nøyaktig 30 sek og slipp sprøyten klippet.
- Vent i 5 sek. Sakte trekke tilbake stempelet til en ml posisjon.
- Åpne chip priming station og pipette 9 ul gel-fargestoff i begge brønnene merket "G".
- Lasting av MArker
- Pipetter 5 mL av markør i alle 12 prøvebrønner og i stigen godt. Ikke la noen av disse 13 brønnene tomme.
- Legge stigen og prøvene.
- Pipetter 1 mL av DNA stige til godt merket med stigen tegn.
- Pipetter en ul av prøven (brukt brønner) eller 1 mL deionisert vann (ubrukte brønner).
- Sett brikken horisontalt i adapteren og vortex i 1 min ved 2400 rpm.
- Kjør chip i Bioanalyzer innen 5 min.
- Kjøre Analysis
- Start Bioanalyzer og tilkoblet datamaskin. Åpne programvaren.
- Åpne lokket på Bioanalyzer og plassere chip i brikken holderen (chip passer kun en vei). Lukk lokket forsiktig.
- I Instrument sammenheng med programvaren velg "Elektroforese"> "dsDNA"> "DNA 7500". Godta gjeldende fil Prefix av programvaren eller endre det.
- Klikk på startknappen til stede i programvaren. Skriv inn prøvenavn i programvaren. Når brikken kjøringen er ferdig (etter ca. 30 min) End of Run melding i Bioanalyzer programvare.
- Ta av chip og rengjør elektrodene på Bioanalyzer i henhold til produsentens instruksjoner.
5. utlede Genotype fra elektroforese Profile
- Last inn Mahal programvare (programvare er fritt tilgjengelig fra forfatterne).
- Import referansedata inn i Mahal programvare: "Fil"> "Import referansedata"
- Åpne elektroforese kjøres i data sammenheng med Bioanalyzer programvare. Velge en elektroforese-profil av en prøve.
- Se etter de aktuelle toppene.
- Bruk Mahal programvare for å sjekke for de aktuelle toppene: "Tools"> "Mean Fluorescence". Sett inn i "Fluorescence" boksenfluorescens verdier angitt som fluorescens enheter (FU) som de kan leses ut fra Bioanalyzer programvare. Sett de 4 (3) topper med høyest fluorescens i stigende rekkefølge og adskilt med komma. Eksempel: 126130132137.
MERK: Hvis ikke alle disse toppene FU er merket med Bioanalyzer programvare, må de estimeres ved å lese dem ut fra tomten.
- Bruk Mahal programvare for å sjekke for de aktuelle toppene: "Tools"> "Mean Fluorescence". Sett inn i "Fluorescence" boksenfluorescens verdier angitt som fluorescens enheter (FU) som de kan leses ut fra Bioanalyzer programvare. Sett de 4 (3) topper med høyest fluorescens i stigende rekkefølge og adskilt med komma. Eksempel: 126130132137.
- Trykk på "Beregn" -knappen. En topp er relevant hvis den observerte fluorescens stiger verdien gitt i boksen "Minimal topphøyde".
- Antyde genotypen.
- Sett inn i Mahal TextBox "Inngangs Peaks (bp)" størrelser i bp av alle relevante topper i stigende rekkefølge og atskilt med komma. Eksempel: 440.462.519.579.637.
MERK: Hvis ikke alle disse peak størrelser er angitt av Bioanalyzer programvare, må de estimeres ved å lese dem ut fra tomten.
- Sett inn i Mahal TextBox "Inngangs Peaks (bp)" størrelser i bp av alle relevante topper i stigende rekkefølge og atskilt med komma. Eksempel: 440.462.519.579.637.
- Trykk på "Beregn" -knappen.
- I listenboksen, se etter minimal squared Mahalanobis avstand "D2M". Hvis den tilsvarende P-verdi rett til det er ≥0.05 så sannsynligheten er ≥5% at null-hypotesen H 0 blir avvist (H 0: observert og referanseprofilen er identiske) som betyr at den observerte profilen er akseptert å være identisk referanseprofilen av den angitte genotype.
- Hvis D2M er minimal, men feltet av den tilsvarende P-verdi er tom, avvise H-0 med en sannsynlighet <5%.
MERK: Dette betyr at profilene ikke er like, selv om D2M er minimal. Et slikt utfall kan skyldes ikke-gjennomsnittlig elektroforese forhold.- For å korrigere for disse avvikene, sette inn i tekstboksen "Observert Peak (bp)" verdien 395 og trykk på "Beregn" -knappen. Sjekk igjen for minimal D2M og en tilsvarende P-verdi ≥0.05. Hvis dette ikke lykkes, kan du prøve verdiene 405, 415 og 425.
MERK: Noen ganger mindre trinn er endaindikert. Hvis det fortsatt ikke er vellykket, er den observerte profilen ikke er tilstede i referansedata, kan det være en ny genotype eller variant.
- For å korrigere for disse avvikene, sette inn i tekstboksen "Observert Peak (bp)" verdien 395 og trykk på "Beregn" -knappen. Sjekk igjen for minimal D2M og en tilsvarende P-verdi ≥0.05. Hvis dette ikke lykkes, kan du prøve verdiene 405, 415 og 425.
- ulike profiler
- Gjenta trinn 5.6 til 5.9 for hver elektroforese profil separat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definisjon av en genotype og dens varianter
En elektro profil avviker i mer enn ett bånd fra alle identifiserte genotyper er ansett som en ny genotype. Nye genotyper er navngitt og utvidet i henhold til Fournier et al., 5 som fører til genotypene GTA til GTZ, etterfulgt av genotypene GTAA til GTAZ, og GTBA til GTBZ, og GTCA til GTCC i dag. Variasjon i bare ett band er å anse som et genotypisk variant. Det vises med romertall hevet skrift etter navnet på genotype (f.eks GTRI, GTRII). Totalt er det i dag 141 genotyper og varianter i referansedatabase.
Under de ovenfor angitte betingelser, RS-PCR ved Fournier et al., 5 er meget reproduserbar å genotype stammer av S. aureus. Definitive identifikasjon av enkjent genotype eller variant er alltid mulig hvis tekniske problemer kan utelukkes. Et typisk resultat er vist i figur 1 som viser elektroforese av 12 RS-PCR-produkter og presenteres i den pseudo gelen modus ved den Bioanalyzer programvare. Hver kjørebane er karakterisert ved et mønster av to eller flere PCR-bånd og en markør bånd foran og en markør bånd ved slutten. Dobbeltklikke inn i et kjørefelt åpnes den tilsvarende, faktisk målt elektroforetisk profil i et separat vindu. Den Bioanalyzer programvare gjør det mulig, blant andre muligheter, de observerte topper som leses så størrelse som fluorescerende enheter FU (figur 2) eller i bp (figur 3) hvorved en topp tilsvarer nøyaktig til ett bånd i den pseudo-gel-modus. Topp avlesning i FU er nødvendig for å evaluere de aktuelle toppene av en profil i Mahal programvare (figur 4), lesing i bp for å utlede genotype. Irrelevante topper er definert i Mahal programvare som liten ertks hvis observerte fluorescens FU er under 40% av det geometriske gjennomsnittet av de 4 (3) topper med høyest fluorescens. De er normalt observeres når det er et overskudd av DNA i RS-PCR (> 30 ng rent DNA / analyse) 2.
Som et eksempel er genotypen av prøven 211 til stede i figur 1 utledes. Visuell analyse av elektro profilen i figur 2 (Bioanalyzer programvare) og analyse med Mahal programvaren ved hjelp av verktøy for å teste for irrelevante toppene avslørt 6 relevante topper med peak størrelser på 395 bp, 432 bp, 453 bp, 505 bp, 567 bp, og 622 bp (figur 3). Disse verdiene er fylt ut og atskilt med komma i tekstboksen "Input Peaks (bp)" av Mahal programvare (figur 4). For å korrigere for run-spesifikke avvik ble verdien 415 settes inn i tekstboksen "Observert Peak (bp)" (figur 4). Etter presset "calculate "-knappen, vises en liste presenteres bestilt av genotype sammen med squared Mahalanobis avstand D2M mellom spørres og indikerte genotypisk profil. Rull gjennom listen etter minimal D2M. I den foreliggende sak, er minimal D2M lik 4,499 (figur 4) med en verdi av P ≥0.05, noe som betyr at det spørres profilen ikke signifikant forskjellig fra en av GTB.
Varianter av genotypene er angitt som _I å _XV i Mahal programvare. I tilfelle av genotype B, er det de tre variantene GBT I, GBT II, og GBT III angitt som B_I, B_II, og B_III i programvaren (figur 4).
En brikke av den MED settet kan analysere produktene av 12 RS-PCR på en gang. Hvis færre produkter er tilgjengelig, de resterende brønnene må være lastet med avionisert vann. Resultater kan bare tolkes hvis kontrollene jegncluded i RS-PCR er hensiktsmessig.
Figur 1. Pseudo-gel som representerer 12 RS-PCR produktene og deres antydede genotyper. Tolv forskjellige stammer av S. aureus ble analysert ved RS-PCR der MED kit sammen med en Bioanalyzer og den medfølgende programvaren. Kjørefeltet på venstre side viser markør eller "stige" for størrelsen kalibrering av systemet i bp. På toppen av grafikk, prøve navnene og de tilsvarende genotyper er tiltalt som ble innhentet av Mahal programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Elektro profilen til SAmple 161 til stede i figur 1. På toppen av toppene den målte fluorescens er indisert i FU. Visuelt skjelnes topper som ikke ble oppdaget av Bioanalyzer programvare behovet for å bli estimert ved å lese dem ut fra tomten som utføres for toppen med en estimert fluorescens verdi av 113 FU (i blått). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Figur 3. Elektro profilen til prøven 211 til stede i figur 1. På toppen av toppene deres størrelse er indisert i bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Skjermbilde av Mahal programvare. I tekstboksen "Input Peaks (bp)" peak størrelser av prøven 211 fra figur 3 er fylt i. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest kritiske trinn i hele prosedyren er når det er et overskudd av DNA i RS-PCR (> 30 ng rent DNA / analyse) 2. Generelt oppløsning på en profil er optimal hvis alle sine topper starter og slutter ved baseline. Hvis to toppene er for nær hverandre, er oppløsningen ufullstendig. Under slike forhold kan det Bioanalyzer programvare føre til upassende topp identifikasjon slik at manuell identifisering er nødvendig.
Alle synlig skilt og relevante topper uttrykt som bp eller FU er inkludert for videre analyser. For mye mal DNA for RS-PCR resulterer i brede topper og derfor til topp overlapping og nedsatt oppløsning av toppene. I tillegg er migrasjon langsommere ledende til maksimal størrelse som er feilaktig økt slik at genotype ikke lenger kan utledes. Til slutt, er antall irrelevante topper større. For profiler med mer enn 3 topper, bør topp med maksimal fluorescens normalt ikke overskride 150 FU.
Genotyping av RS-PCR som beskrevet er begrenset av det faktum at investeringene i maskiner er nødvendig, og den fri Mahal programvare er nødvendig. Faktisk er en standard PCR maskin og Bioanalyzer nødvendig. Den førstnevnte er ganske billig i dag, mens den sistnevnte er dyrere. Oppløsningen av agarose-basert elektroforese er ikke tilstrekkelig, selv om høy oppløsning agarose anvendes. Under slike forhold er det bare mulig å skille mellom GTB, GTC, og alle de andre genotyper. Kostnadene for elektroforese ved hjelp av MED-kit eller agarose-elektroforese, men er like. MED-kit sammen med den Bioanalyzer ytterligere bedre resultater enn standard agarose elektroforese på en slik måte at den sistnevnte metode er nyttig, rett frem, og erholdte data er til stede i elektronisk form som forenkler lagring og videre analyse betraktelig. Prinsipielt alle kommersielt tilgjengelige bioanalyzers er egnet for denne type analyse forutsatt at electrophoretic oppløsning er tilstrekkelig, og det oppnådde størrelsen av bandene er nøyaktig og objektiv.
Oppløsningen på RS-PCR for storfe stammer av S. aureus er høy. Det er så godt som spa skrive, og bedre enn MLST og PFGE 4,14. I tillegg, sammenlignet med alle de andre innskrivings metoder som vanligvis benyttes for inndeling i undergrupper S. aureus (spa skrive, MLST, PFGE), er dens prøvekapasitet høy: DNA-ekstraksjon er enkel og rask, 96 prøver kan behandles i en RCR løp (normalt O / N) og elektroforese og genotype dedusere er rett frem. Den fullstendig analyse av 96 prøver krever en natt for PCR og en dag for elektroforese og evaluering. Andre fordeler med RS-PCR av Fournier et al. 2 er lave kostnader, spesielt i forhold til MLST som krever sju gener som skal sekvensert i begge retninger 15. Videre er RS-PCR den eneste metoden forutsi contagiosity og patogenitet av stammer avS. aureus involvert i storfe mastitt 2,5, sentrale prediktorer i klinisk veterinærmedisin. Til slutt, RS-PCR alene er tilstrekkelig til å undersøke epidemiologi av storfe S. aureus 3,4,5,14. Tolkning av data er rett frem, selv i internasjonal sammenheng som bare noen få større genotyper observert 2,3. For epidemiologiske sammenligninger mellom storfe og menneskelige belastninger, RS-PCR og spa typing sammen er å foretrekke som den sistnevnte metoden er mye brukt for inndeling i undergrupper menneskelige belastninger, slik at mye data er tilgjengelig. MLST, er imidlertid egnet for å vurdere klonalitet av stammene 15 og for fylogenetisk analyse fire.
For feilsøking om PCR cycler, MED kit, og Bioanalyzer, tilsvarende manualer er å bli konsultert. I tilfelle av RS-PCR-metoden blir feilsøking massivt forenkles hvis passende positive og negative kontroller er PCR økesluded i hvert løp. Dersom den positive kontrollen er negativ, ble PCR-blandingen ikke er tilfredsstillende sammensatt og / eller kontroll-DNA ble nedbrutt. Hvis den negative kontrollen (H 2 O) generert en eller flere band, PCR-miksen var forurenset med noe DNA. I begge tilfeller må profilene ikke tolkes og RS-PCR må gjentas. Ved tolkning er umulig på grunn av en elektro problem, må elektroforese for å bli gjentatt ved bruk av en ny chip. Elektroforetiske problemer er vanligvis kjennetegnet ved utilstrekkelig migrasjon og innretting av den ene eller begge markørbånd som følge av upassende lasting og manipulering av brikken. Hvis innhentet elektroforese profilen ikke kan tolkes av Mahal programvare, er profilfilen som genereres av Bioanalyzer programvare sendt til forfatteren for videre evaluering. Normalt vil for mye templat-DNA ble anvendt for PCR-RS eller profil representerer en ny genotype eller genotypisk variant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al.
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
