génotypage des Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54623

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Hans U. Graber¹

¹Institute for Food Sciences IFS, Agroscope

Introduction

Staphylocoques (S. aureus) est connu comme le pathogène le plus important dans le monde responsable de l' infection intra - mammaire (IMI) chez les bovins ^1. L'étude menée par Fournier et al. ² démontré chez les vaches suisses, les études réalisées par Cosandey et al. ³ et Boss et al. ⁴ vaches de 12 pays européens que S. aureus isolé de bovin IMI est un groupe génétiquement hétérogène. Par amplification par PCR de la région d'espaceur intergénique 16S-23S ARNr (RS-PCR), un total de 17 génotypes ont été initialement détecté dans 101 isolats épidémiologiquement indépendants ^2. Génotype B et le génotype C (GTC) étaient les plus fréquentes (80%), tandis que les 15 autres génotypes (SMT) se sont produits rarement, chaque prise de 1 à 4% de tous les isolats. Au niveau européen ^3, GTB, GTC, GTF, GTI et GTR étaient les génotypes les plus importants , comprenant 76% de toutes les souches analysées (n = 456). GTB était situé en Europe centrale wconsidérant que les autres génotypes ont été largement diffusés. Les 24% restants des souches inclus 41 génotypes, beaucoup d'entre eux, cependant, ont été observés une seule fois.

Les études menées par Fournier et al. ^2, Cosandey et al. ^3, et Graber et al. ⁵ ont démontré en outre que les génotypes étaient fortement associés à leur modèle de gène de virulence, ainsi que le suisse au niveau européen. Les autres études ont révélé des différences massives dans la prévalence IMI chez S. aureus GTB, GTC et les autres génotypes ^2,5: compte tenu de GTB, jusqu'à 87% des vaches dans un troupeau ont été infectées par ce génotype. Dans le cas du GTC et des autres génotypes, cependant, l'IMI a été trouvé que dans 1 à 2 vaches d'un troupeau.

IMI causée par S. aureus, se traduit normalement par une inflammation des glandes mammaires correspondant et une augmentation des cellules inflammatoires dans le lait. En conséquence, la coopération de cellules somatiquesunts dans le lait (SCC), l'indicateur clé de la qualité du lait dans la plupart des pays, est augmenté conduisant à un prix du lait a diminué ou même l'arrêt de la livraison.

En plus de l'interface RS-PCR de Fournier et al. ^2, d' autres méthodes de typage ont été décrites pour le sous - typage des souches bovines de S. aureus ^8-11. Deux plus communs comprennent le typage spa ¹² et Multi Locus Sequence Typing (MLST) ^13. L'ancien est basée sur le séquençage d' ADN de la région d'espacement variable du gène codant spa pour la protéine A staphylococcique, alors que celui - ci nécessite une séquencement de 7 gènes de ménage. Cela signifie qu'un ¹² et ¹³ sept PCR, respectivement, doivent être réalisées, suivies d' une purification de l' amplicon, une réaction de séquençage et l' analyse en utilisant un équipement spécifique. Par rapport à RS-PCR, ces méthodes nécessitent un effort supplémentaire considérable dans le laboratoire résultant en un débit d'échantillons faibles et des coûts élevés. lele débit est particulièrement faible pour les ECP. Compte tenu de la résolution de ces méthodes pour les souches bovines de S. aureus, RS-PCR est au moins aussi bon que spa tapant ⁴ et mieux que MLST ⁴ ou ECP ^15.

Toutes ces méthodes , y compris la dactylographie binaire ¹³ ont démontré leur efficacité dans l' obtention d' un éclairage supplémentaire sur la pathogenèse de bovins IMI causée par S. aureus, mais à cause des restrictions mentionnées ils sont moins appropriés pour les grandes investigations cliniques. En outre, le génotypage par RS-PCR comme décrit par Fournier et al. ² permet la prédiction fiable de l'épidémiologie et le potentiel pathogène de S. aureus impliqué dans l' IMI bovine, deux valeurs clés de la médecine vétérinaire clinique.

Protocol

1. Staphylococcus aureus

1. Étaler 10 pi de S. aureus culture mère ou une colonie cultivée sur un milieu sélectif sur des plaques de gélose Columbia contenant du sang de mouton à 5% (BA).
2. Incuber aérobies à 37 ° C pendant 18 h à 24 h.

2. Extraction de l'ADN

1. Préparer un tampon contenant du Tris TEL-HCl 10 mM et 10 mM de _Na2EDTA, pH 8,5. Préparer des aliquotes et autoclave à 121 ° C pendant 15 min.
2. Collecter une colonie de BA à l'aide d'une anse stérile en matière plastique ou d'un cure-dent en bois stérile et remettre en suspension dans 100 ul TEL. Utiliser 1,5 ml tubes avec bouchons à vis.
3. Incuber à 95 ° C pendant 10 min. Ensuite, placez les échantillons immédiatement sur de la glace.
4. Diluer les échantillons 1: 100 dans H ₂ O approprié pour la PCR (= ADN matrice pour la PCR). Les échantillons non dilués et dilués peuvent être conservés à -20 ° C pendant 1 mois.

3. RS-PCR

2 O, 12,5 pi de Taq Master Mix, 2 ul G1 amorce 10 pM, 2 ul L1 amorce 10 pM, et 7 ul de l' ADN matrice qui correspond à environ 30 ng de pureté DNA ^2.
1. Exécuter le programme de cyclage suivant dans un thermocycleur standard de PCR: 15 min 95 ° C, suivie par 27 cycles comprenant 94 ° C pendant 1 min, suivie d'une rampe 2 min et recuit à 55 ° C pendant 7 min. Après encore 2 min rampe, étendre à 72 ° C pendant 2 min. Se terminer par PCR par une extension finale à 72 ° C pendant 10 min suivi par un refroidissement à 4 ° C.
   REMARQUE: Les produits de PCR peuvent être conservés à -20 ° C pendant 5 jours.
2. Pour chaque série de RS-PCR comprend un contrôle positif, à savoir, un échantillon avec un génotype connu (normalement GTB), et un contrôle négatif (H ₂ O).

4. Electrophorèse

1. Utilisez un kit commercial d'électrophorèse miniaturisé pour l'ADN (kit MED) ensembleavec un Bioanalyseur connecté à un PC et le logiciel installé. Étudier les manuels correspondants du fabricant avec soin.
2. Mettre en place la station d'amorçage de la puce et ajuster le clip de seringue selon le manuel du fabricant.
3. Préparer le mélange gel colorant selon le manuel du fabricant.
4. Chargement du mélange gel-dye (selon le manuel du fabricant).
   1. Equilibrer le mélange gel colorant à la température ambiante pendant 30 min avant utilisation.
   2. Mettez nouvelle puce à ADN sur la station puce d'amorçage. Pipette 9 pi de gel colorant dans le G. bien marqué
   3. Assurez-vous que le piston est positionné à 1 ml, puis fermer la station puce d'amorçage. Appuyez sur le piston jusqu'à ce qu'il soit maintenu par la pince de seringue. Attendre exactement pendant 30 secondes, puis relâchez le clip de la seringue.
   4. Attendre 5 sec. Tirez lentement le piston pour 1 ml poste.
   5. station d'amorçage Open puce et pipette 9 pi de gel colorant dans les deux puits marqués 'G'.
5. Chargement du Marker
   1. Pipette 5 pi de marqueur dans l'ensemble des 12 puits d'échantillon et à bien l'échelle. Ne laissez pas l'un de ces 13 puits vides.
6. Chargement du Ladder et les échantillons.
   1. Pipette 1 pi d'échelle d'ADN pour le bien-marqué du signe de l'échelle.
   2. 1 ul d'échantillon (puits utilisés) ou 1 pi d'eau déminéralisée (puits non utilisés).
   3. Mettre la puce horizontalement dans l'adaptateur et le vortex pendant 1 min à 2400 rpm.
   4. Exécutez la puce dans le Bioanalyseur à moins de 5 min.
7. Exécution de l'analyse
   1. Démarrez le Bioanalyseur et l'ordinateur connecté. Ouvrez le logiciel.
   2. Ouvrez le couvercle du Bioanalyseur et placez la puce dans le support de puce (la puce correspond à une seule façon). Fermez le couvercle avec précaution.
   3. Dans le cadre de l' instrument du logiciel sélectionnez "Electrophoresis"> "ADNdb"> "DNA 7500". Acceptez le préfixe du fichier en cours du logiciel ou de le modifier.
   4. Cliquez sur le bouton de démarrage présente dans le logiciel. Entrez les noms des échantillons dans le logiciel. Lorsque la course à puce est terminée (après environ 30 min) , la Fin du message Run apparaît dans le logiciel de Bioanalyseur.
   5. Retirer la puce et nettoyer les électrodes de la Bioanalyseur selon les instructions du fabricant.

5. Déduire le Génotype du profil Electrophoresis

1. Chargez le logiciel Mahal (logiciel est disponible gratuitement auprès des auteurs).
2. des données de référence à l'importation dans le logiciel Mahal: "Fichier"> "Importer des données de référence"
3. Ouvrez l'électrophorèse exécuter dans le contexte des données du logiciel Bioanalyseur. Sélectionnez un profil d'électrophorèse d'un échantillon.
4. Vérifiez les pics pertinents.
   1. Utilisez le logiciel Mahal pour vérifier les pics pertinents: "Outils"> "Fluorescence moyenne". Insérez dans la boîte "Fluorescence"les valeurs de fluorescence ont indiqué que les unités de fluorescence (FU), car ils peuvent être lus à partir du logiciel bioanalyser. Insérez les 4 (3) pics avec la plus haute fluorescence dans l'ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 126130132137.
      NOTE: Si tous ces pics FU sont indiqués par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle.
5. Appuyez sur le bouton «Calculer». Un pic est pertinent si la fluorescence observée dépasse la valeur indiquée dans la case «hauteur du pic Minimal".
6. Déduire le génotype.
   1. Insérer dans les textbox Mahal "Peaks d'entrée (pb)" les tailles pb de tous les pics pertinents dans l'ordre croissant et séparés par des virgules. Exemple: 440.462.519.579.637.
      NOTE: Si toutes ces dimensions maximales sont indiquées par le logiciel Bioanalyseur, ils doivent être estimés en les lisant à partir de la parcelle.
7. Appuyez sur le bouton «Calculer».
8. Dans la listeboîte, chercher le minimum carré Mahalanobis distance "D2M". Si la valeur de P droit correspondant à il est ≥0.05 alors la probabilité est ≥5% que l'hypothèse nulle H ₀ est rejetée (H _0: l'observé et le profil de référence sont identiques) ce qui signifie que le profil observé est accepté d'être identique à le profil de référence du génotype indiqué.
9. Si D2M est minime , mais le champ de la valeur P correspondant est vide, rejeter H ₀ avec une probabilité <5%.
   NOTE: Cela signifie que les profils sont inégaux bien D2M est minime. Un tel résultat peut résulter de conditions d'électrophorèse non-moyenne.
   1. Pour corriger ces écarts, insérer dans la zone de texte "Observé Peak (pb)" la valeur 395 et appuyez sur le bouton "Calculer". Vérifiez à nouveau pour D2M minimale et une ≥0.05 P de valeur correspondant. En cas d'échec, essayez les valeurs 405, 415, et 425.
      REMARQUE: Parfois, les petites étapes sont encoreindiqué. Si toujours pas réussi, le profil observé est pas présent dans les données de référence, il peut être un nouveau génotype ou variante.
10. Divers Profils
    1. Répéter les étapes 05.06 à 05.09 pour chaque profil d'électrophorèse séparément.

Representative Results

Définition d'un génotype et ses variants

Un profil électrophorétique différent dans plus d'une bande de tous les génotypes identifiés est considéré comme un nouveau génotype. Les nouveaux génotypes sont nommés et étendus selon Fournier et al. ⁵ conduisant à des génotypes de la RGT à la GTZ, suivis par les génotypes GTAA à GTAZ et GTBA à GTBZ et GTCA à GTCC à l' heure actuelle. Variation en un groupe est considéré comme une variante génotypique. Il est indiqué en chiffres romains en exposant après le nom du génotype (par exemple, GTRI, GTRII). Au total, il existe actuellement 141 génotypes et variantes dans la base de données de référence.

Dans les conditions décrites ci - dessus, RS-PCR par Fournier et al. ⁵ est hautement reproductible au génotype des souches de S. aureus. L'identification définitive d'ungénotype ou variante connue est toujours possible si les problèmes techniques peuvent être exclus. Un résultat typique est présenté à la figure 1 montrant l'électrophorèse sur 12 produits RS-PCR et présenté dans le mode de gel de pseudo par le logiciel de bioanalyser. Chaque voie est caractérisée par un motif de deux ou plusieurs bandes de PCR et d'une bande de marquage en avant et une bande de marqueur à la fin. Un double-clic dans une ruelle ouvre le profil électrophorétique correspondant, effectivement mesuré dans une fenêtre séparée. Le logiciel Bioanalyseur permet, entre autres possibilités, les pics observés en cours de lecture que la taille en unités fluorescentes FU (Figure 2) ou en pb (figure 3) dans lequel un pic correspond exactement à une bande dans le mode pseudo-gel. Lecture Peak FU est nécessaire pour évaluer les pics pertinents d'un profil dans le logiciel Mahal (figure 4), la lecture en pb pour inférer le génotype. pics Irrelevant sont définis dans le logiciel Mahal comme petit poisks dont la fluorescence observée FU est inférieure à 40% de la moyenne géométrique des 4 (3) avec des pics de fluorescence la plus élevée. Ils sont normalement observés lorsqu'il y a un excès d'ADN RS-PCR (> 30 ng de l' ADN pur / dosage) ^2.

A titre d'exemple, le génotype de l' échantillon 211 présente sur la figure 1 est déduite. L' analyse visuelle du profil électrophorétique sur la figure 2 (logiciel bioanalyser) et l' analyse avec le logiciel Mahal utilisant l'outil pour tester les pics pertinents ont révélé 6 pics pertinents ayant des dimensions maximales de 395 pb, 432 pb, 453 pb, 505 pb, 567 pb, et 622 pb (figure 3). Ces valeurs sont remplis et séparés par des virgules dans le champ "Peaks d'entrée (pb)" du logiciel Mahal (Figure 4). Pour corriger les écarts spécifiques à exécution, la valeur 415 a été inséré dans la zone de texte "Observé Peak (pb)" (Figure 4). Après avoir appuyé sur le "Cbouton alculez ", une liste est présentée ordonnée par le génotype avec le Mahalanobis D2M de distance au carré entre le profil génotypique demandées et indiquées. Faites défiler la liste à la recherche de D2M minimal. Dans le cas présent, D2M minimale est égale à 4.499 (Figure 4) une valeur de P ≥0.05, ce qui signifie que le profil demandées ne diffère pas sensiblement de celle du GTB.

Des variantes de génotypes sont indiqués comme _I à _XV dans le logiciel Mahal. Dans le cas du génotype B, il existe trois variantes GBT ^I, GBT ^II et ^III GBT indiqué comme b_i, B_II et B_III dans le logiciel (Figure 4).

Une puce de la trousse MED permet aux produits d'analyse de 12 RS-PCR à la fois. Si moins de produits sont disponibles, les puits restants doivent être chargés avec de l'eau déminéralisée. Les résultats peuvent être interprétés si les contrôles iNCLUS RS-PCR sont appropriés.

Figure 1. Pseudo-gel représentant 12 produits RS-PCR et leurs génotypes inférées. Douze souches différentes de S. aureus ont été analysés par RS-PCR en utilisant le kit MED conjointement avec un Bioanalyseur et le logiciel inclus. La voie sur le côté gauche montre le marqueur ou «échelle» pour la taille étalonnage du système en pb. Sur le haut des graphiques, les noms des échantillons et les génotypes correspondants sont inculpés qui ont été obtenus par le logiciel Mahal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. profil électrophorétique de sample 161 présente sur la figure 1. En plus des pics de la fluorescence mesurée est indiquée dans le FU. Pics visuellement distinguables qui ne sont pas détectés par la nécessité d' un logiciel de Bioanalyseur à estimer en les lisant à partir de l'intrigue comme effectué pour le pic avec une valeur de fluorescence estimée de 113 FU (en bleu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Le profil électrophorétique de l' échantillon 211 présente dans la figure 1. En plus des pics de leur taille est indiquée en pb. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Capture d' écran du logiciel Mahal. Dans la zone de texte "Peaks d'entrée (pb)" les tailles de pointe de l' échantillon 211 de la figure 3 sont remplis. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

L'étape la plus critique de toute la procédure est quand il y a un excès d'ADN dans RS-PCR (> 30 ng pur ADN / dosage) ^2. En général, la résolution d'un profil est optimale si tous ses sommets commencent et se terminent à la ligne de base. Si deux pics sont trop rapprochés, la résolution est incomplète. Dans ces conditions, le logiciel peut conduire à bioanalyser inappropriée identification des pics de telle sorte que l'identification manuelle est nécessaire.

Tous les pics visiblement séparés et pertinents exprimés en pb ou FU sont incluses pour d'autres analyses. ADN matrice Trop pour RS-PCR se traduit par des pics larges et donc à pic résolution chevauchement et une altération des pics. En outre, la migration est le plus important ralentissement au pic des tailles qui sont faussement augmenté de sorte que le génotype ne peut plus être déduite. Enfin, le nombre de pics pertinents est plus grand. Pour les profils de plus de 3 pics, le pic de fluorescence maximale ne devrait pas dépasser 150 FU.

Génotypage par RS-PCR comme décrit est limitée par le fait que l'investissement dans les machines est nécessaire et le logiciel libre Mahal est nécessaire. En effet, une machine standard de PCR et le bioanalyseur sont nécessaires. Le premier est plutôt pas cher de nos jours, alors que le second est plus cher. La résolution de l'électrophorèse à base d'agarose ne suffit pas, même si haute résolution agarose est utilisé. Dans ces conditions, il est seulement possible de faire la distinction entre GTB, GTC, et tous les autres génotypes. Les coûts pour l'électrophorèse en utilisant le kit MED ou une électrophorèse sur agarose, cependant, sont similaires. Le kit MED avec le Bioanalyseur plus performant que l'électrophorèse agarose standard dans une manière que cette dernière méthode est pratique, simple, et les données obtenues est présent sous forme électronique qui simplifie le stockage et une analyse plus poussée considérablement. Principalement tous les bioanalyzers disponibles dans le commerce sont appropriés pour ce type d'analyse à condition que le electrophoretrésolution ic est adéquate et la taille obtenue des bandes est exacte et impartiale.

La résolution de RS-PCR pour les souches bovines de S. aureus est élevé. Il est aussi bon que spa dactylographie, et mieux que MLST et ECP ^4,14. En outre, par rapport à toutes les autres méthodes de typage couramment utilisés pour le sous - typage S. aureus (spa dactylographie, MLST, ECP), son débit d'échantillons est élevé: l' extraction d'ADN est facile et rapide, 96 échantillons peuvent être traités en un seul passage RCR (normalement O / N) et l' électrophorèse et le génotype inférant est simple. L'analyse complète des 96 échantillons nécessite une nuit pour la PCR et un jour pour l'électrophorèse et l'évaluation. D' autres avantages de RS-PCR par Fournier et al. ² sont les faibles coûts, en particulier par rapport à MLST qui nécessite sept gènes à séquencés dans les deux directions ^15. En outre, RS-PCR est la seule méthode prédire contagiosité et la pathogénicité des souches deS. aureus impliqués dans la mammite bovine ^2,5, prédicteurs clés en médecine vétérinaire clinique. Enfin, RS-PCR seul est suffisant pour étudier l'épidémiologie de S. bovine aureus ^3,4,5,14. L' interprétation des données est simple , même dans un contexte international en tant que quelques génotypes majeurs sont observés ^2,3. Pour les comparaisons épidémiologiques entre les bovins et les souches humaines, RS-PCR et le spa typage ensemble sont préférables car cette dernière méthode est largement utilisée pour le typage des souches humaines de sorte que beaucoup de données sont disponibles. MLST, cependant, est apte à évaluer la clonalité des souches ¹⁵ et pour les analyses phylogénétiques ^4.

Pour le dépannage concernant le cycleur PCR, kit MED et le Bioanalyseur, les manuels correspondants doivent être consultés. Dans le cas de la méthode RS-PCR, le dépannage est massivement simplifiée si les contrôles de PCR positifs et négatifs appropriés sont included dans chaque série. Si le contrôle positif est négatif, le mélange de PCR n'a pas été composé de manière adéquate et / ou l'ADN de contrôle a été dégradé. Si le contrôle négatif (H ₂ O) a généré une ou plusieurs bandes, le mélange de PCR a été contaminé par un peu d' ADN. Dans les deux cas, les profils ne doivent pas être interprétées et RS-PCR doit être répétée. Si l'interprétation est impossible en raison d'un problème électrophorétique, électrophorèse doit être répété en utilisant une nouvelle puce. problèmes électrophorétiques sont normalement caractérisés par la migration inadéquate et l'alignement de l'un ou les deux bandes de marqueur résultant de chargement inapproprié et la manipulation de la puce. Si le profil d'électrophorèse obtenu ne peut pas être interprété par le logiciel Mahal, le fichier de profil généré par le logiciel de Bioanalyseur est envoyé à l'auteur pour une évaluation plus poussée. Normalement, l'ADN matrice trop a été utilisé pour RS-PCR ou le profil représente un nouveau génotype ou variant génotypique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Merck	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
Titriplex III	Merck	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
Hydrochloric acid 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Columbia agar+5% sheep blood	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
Primer G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'