Introduction
황색 포도상 구균 (S. 구균) 소 1 유방 내 감염 (IMI)에 대한 전 세계적 책임을 가장 중요한 병원체로 알려져있다. 12 유럽 국가 그 소에 Cosandey 등. 3, 보스 등. (4)에 의해 푸르니에 등. 2 스위스 암소에서 설명하고 연구의 연구 S. 구균은 IMI는 유 전적으로 이질적인 그룹 소에서입니다. 16S-23S rRNA의 유전자 간 스페이서 영역 (RS-PCR)의 PCR 증폭에 의해, 17 유전자형 총 초기 101 역학적 분리 독립이 검출되었다. 다른 15 유전자형 GTS (가) 각 1 모든 균주의 % 4을 거의 발생하지 반면 유전자형 B 및 유전자형 C (GTC)는 (80 %) 가장 많았다. 유럽 레벨 3에서 GTB는 GTC는 GTF, GTI, 그리고 GTR은 분석 된 모든 균주 (N = 456)의 76 %를 포함하는 가장 중요한 유전자형이었다. GTB는 w 중부 유럽에 위치하고했다hereas 다른 유전자형 널리 전파되었다. 균주의 나머지 24 %는 그들 중 많은,하지만, 한 번만 관찰되었다 (41) 유전자형을 포함.
유전자형이 높은 유럽 수준으로 스위스에서뿐만 아니라, 그들의 독성 유전자 패턴과 연관되었는지 포니 외. 2 Cosandey 외. (3), Graber 외. (5)에 의한 연구는 또한 보여 주었다. 연구는 또한 S. 중 IMI 보급에 엄청난 차이를 밝혀 구균 GTB, GTC 다른 유전자형 2,5 : GTB 고려, 무리 암소의 87 %까지이 유전자형에 감염되었다. GTC의 다른 유전자형의 경우에, 그러나, IMI은 무리 1-2 소에서 발견되었다.
IMI S.에 의해 발생 구균은 일반적으로 해당 유방 동맥의 염증과 우유에서 염증 세포의 증가를 초래한다. 결과적으로, 체세포 CO우유에 unts (SCC), 대부분의 국가에서 우유 품질의 주요 지표는 감소 우유 가격 또는 납품 정지로 이어지는 증가한다.
포니 외. (2)의 RS-PCR 외에, 다른 입력 방법은 S.의 소 하위 유형 균주에 대해 기재 한 구균 8-11. 두 가지 일반적인 것들로는 스파 입력 (12)과 멀티 자취 그리기 순서 타이핑 (MLST) (13)를 포함한다. 후자 7 하우스 키핑 유전자의 염기 서열을 필요로하는 반면, 전 하나, 단백질 A에 대한 포도상 구균 스파 코딩하는 유전자의 가변 영역을 스페이서 DNA 시퀀싱에 기초한다. 이것은 하나의 12 일곱 PCR들 (13) 각각의 특정 장치를 사용하여 앰플 리콘 정화 시퀀싱 반응을 분석 한 후, 수행 될 필요가 있음을 의미한다. RS-PCR에 비해, 이러한 방법은 낮은 샘플 처리량과 높은 비용의 결과로 실험실에서 상당한 추가적인 노력이 필요합니다. 그만큼처리량은 PFGE 특히 낮습니다. S.의 소 균주에 대한 이러한 방법의 해상도를 고려 구균, RS-PCR 적어도 MLST 4 PFGE (15)보다 4 더 나은를 입력 스파만큼 좋은 것입니다.
바이너리 입력 (13)을 포함한 모든 이들 방법은 S.으로 인한 소 IMI의 발병에 더 통찰력을 얻기에 그 효과를 입증 구균,하지만 때문에 언급 제한으로 그들은 많은 임상 연구 덜 적합하다. 또한, RS-PCR에 의한 유전자형 포니 등에 의해 설명 된 바와 같이. 2 역학적 S.의 발병 가능성을 예측 신뢰성있게 구균, 소 IMI 임상 수의학에 두 개의 키 값을 포함했다.
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Protocol
1. 황색 포도상 구균 분리 된 균주
- S.의 10 μl를 확산 구균 재고 문화 또는 하나의 식민지가 5 % 양 혈액 (BA)를 포함 컬럼비아 아가 플레이트에 선택 배지에 성장.
- 24 시간에 18 시간 동안 37 ° C에서 기적 품어.
2. DNA 추출
- 10 mM 트리스 - 염산 10 밀리미터 나 2 EDTA, pH가 8.5를 포함 TEL 버퍼를 준비합니다. 15 분 동안 121 ° C에서 분취 및 오토 클레이브를 준비합니다.
- 100 μl의 전화에서 멸균 플라스틱 루프 또는 멸균 나무 이쑤시개와에 resuspend를 사용하여 BA 1 식민지를 수집합니다. 스크류 캡 1.5 ml의 튜브를 사용합니다.
- 10 분 동안 95 ° C에서 품어. 그 후, 젖은 얼음에 즉시 샘플을 배치합니다.
- PCR (PCR 용 = 주형 DNA)에 적합한 H 2 O 100 : 샘플 1을 희석. 비 희석하고, 희석 된 샘플을 1 달 동안 -20 ℃에서 보관 될 수있다.
3. RS-PCR
- 표준 PCR의 자전거 타는 사람에서 다음 사이클 프로그램을 실행 : 15 분 7 분 55 ° C에서 2 분 램프 및 어닐링 다음에 1 분 94 ° C를 포함하는 27주기, 다음 95 ° C는. 추가의 2 분의 램프 후, 2 분 동안 72 ℃에서 연장된다. 4 ℃로 냉각 한 다음 10 분 동안 72 ° C에서 최종 연장 PCR을 종료합니다.
주 : PCR 산물을 5 일 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. - 각 실행에 대한 RS-PCR, 즉 양성 대조군, 공지 된 유전자형 (일반적 GTB)와 샘플 및 대조군을 포함 (H 2 O).
4. 전기 영동
- 함께 DNA (MED 키트)에 대한 상용 소형 전기 키트를 사용하여PC와 설치된 소프트웨어에 연결된 bioanalyzer와. 조심스럽게 제조 업체의 대응 매뉴얼을 공부한다.
- 칩 프라이밍 스테이션을 설정하고 제조업체의 설명서에 따라 주사기 클립을 조정합니다.
- 제조업체의 설명서에 따라 젤 염색 믹스를 준비합니다.
- (제조자의 설명서에 따라) 젤 염색 믹스로드.
- 사용하기 전에 30 분 동안 실온으로 겔 염료 혼합물 평형.
- 칩 프라이밍 스테이션에서 새로운 DNA 칩을 넣습니다. 잘 표시 G.에서 젤 염료의 피펫 9 μl를
- 플런저 1 ml의에 위치되어 있는지 확인하고 칩 마중물 역을 닫습니다. 를 눌러 플런저은이 주사기 클립에 의해 개최 될 때까지. 30 초 후 주사기 클립을 해제에 대해 정확히 기다립니다.
- 5 초 동안 기다립니다. 천천히 1 ml의 위치로 플런저를 다시 잡아 당깁니다.
- 두 우물에서 열기 칩 프라이밍 스테이션과 젤 염료의 피펫 9 μl의는 'G'를 표시했다.
- 는 M로드arker
- 모든 12 샘플 우물에 잘 사다리에있는 마커의 피펫 5 μL. 빈이 13 우물 중 하나를 두지 마십시오.
- 래더 및 샘플을로드.
- 피펫 래더 기호 잘 표시에 DNA 사다리 1 μL.
- 샘플의 피펫 1 μl를 (사용 우물) 또는 탈 이온수 (사용하지 않는 우물) 1 μL.
- 2,400 rpm에서 1 분간 어댑터와 소용돌이에 수평으로 칩을 넣습니다.
- 5 분 이내에 bioanalyzer에서 칩을 실행합니다.
- 분석을 실행
- bioanalyzer와 연결된 컴퓨터를 시작합니다. 소프트웨어를 엽니 다.
- bioanalyzer의 뚜껑을 열고 (칩이 한 방향으로 만 맞는) 칩 홀더에 칩을 놓습니다. 조심스럽게 뚜껑을 닫습니다.
- 소프트웨어의 악기 맥락에서 "전기 영동을"> "dsDNA"> "DNA 7500"을 선택합니다. 소프트웨어의 현재 파일 접두사를 그대로 사용하거나 수정합니다.
- 소프트웨어에있는 시작 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어에서 샘플 이름을 입력합니다. 칩 실행이 완료되면 (후 약 30 분) 실행 메시지의 끝은 bioanalyzer 소프트웨어에 나타납니다.
- 제조자의 지시에 따라 bioanalyzer의 전극과 상기 칩을 제거하고 세정.
5. 전기 영동 프로필에서 유전자형을 유추
- (소프트웨어는 저자에서 자유롭게 사용할 수 있습니다)을 마 소프트웨어를로드합니다.
- > "가져 오기 참조 데이터", "파일"다음 마할 소프트웨어로 가져 오기 참조 데이터
- bioanalyzer 소프트웨어의 데이터 컨텍스트에서 실행되는 전기를 엽니 다. 하나의 샘플의 전기 영동 프로파일을 선택합니다.
- 관련 피크를 확인합니다.
- '도구'> '평균 형광 "관련 피크를 확인하기 위해 마 소프트웨어를 사용합니다. 은 "형광"상자에 삽입형광 값은 그들이 bioanalyzer 소프트웨어로부터 판독 될 수있는 형광 단위 (FU)로 나타내었다. 오름차순으로 가장 높은 형광 4 (3) 피크를 삽입하고 쉼표 (,)로 구분. 예 : 126,130,132,137.
참고 : 모든 이들 피크의 FU의이 bioanalyzer 소프트웨어로 표시하는 경우, 그들은 음모에서 그들을 판독하여 추정 할 필요가있다.
- '도구'> '평균 형광 "관련 피크를 확인하기 위해 마 소프트웨어를 사용합니다. 은 "형광"상자에 삽입형광 값은 그들이 bioanalyzer 소프트웨어로부터 판독 될 수있는 형광 단위 (FU)로 나타내었다. 오름차순으로 가장 높은 형광 4 (3) 피크를 삽입하고 쉼표 (,)로 구분. 예 : 126,130,132,137.
- 은 "계산"버튼을 누릅니다. 관찰 된 형광은 박스 "최소 피크 높이"에 소정의 값을 초과하면, 피크가 적합하다.
- 유전자형을 추론.
- 마할 텍스트 상자 "입력 봉우리 (BP)"를 오름차순으로 모든 관련 피크의 염기쌍의 크기와 쉼표 (,)로 구분으로 삽입합니다. 예 : 440,462,519,579,637.
주 : 이러한 크기의 피크는 모든 bioanalyzer 소프트웨어에 의해 지시되는 경우에, 플롯 그들을 판독하여 추정 될 필요가있다.
- 마할 텍스트 상자 "입력 봉우리 (BP)"를 오름차순으로 모든 관련 피크의 염기쌍의 크기와 쉼표 (,)로 구분으로 삽입합니다. 예 : 440,462,519,579,637.
- 은 "계산"버튼을 누릅니다.
- 목록에서상자, 최소 제곱 마할 라 노비스 거리 "D2M"를 찾습니다. 이 ≥0.05 인 오른쪽에 대응하는 P 값은 그 확률 귀무 가설 H 0이 거부되었는지 ≥5 % 인 경우 (H 0 : 관찰 기준 프로파일이 동일) 관찰 된 프로파일과 동일하도록 허용되는 것을 의미 지정된 유전자형의 기준 프로파일.
- D2M 최소화하지만 해당 P 값의 필드가 비어 있으면, 확률 <5 % H 0을 거부한다.
참고 :이 D2M 최소한 있지만 프로파일이 동일하지 않은 것을 의미합니다. 이러한 결과는 비 평균 전기 영동 조건에서 발생할 수 있습니다.- 이러한 편차를 보정하려면 값 395을 "피크 (BP) 관찰"텍스트 상자에 삽입하고 "계산"버튼을 누릅니다. 최소한의 D2M와 대응하는 P 값 ≥0.05 다시 확인합니다. 성공하지 않으면, 값 405, 415 및 425을보십시오.
참고 : 때때로 작은 단계도 있습니다가리키는. 관찰 된 프로파일이 기준 데이터가 존재하지 여전히 성공적이지 않으면 새로운 유전자형 또는 변형 될 수있다.
- 이러한 편차를 보정하려면 값 395을 "피크 (BP) 관찰"텍스트 상자에 삽입하고 "계산"버튼을 누릅니다. 최소한의 D2M와 대응하는 P 값 ≥0.05 다시 확인합니다. 성공하지 않으면, 값 405, 415 및 425을보십시오.
- 다양한 프로필
- 반복 별도로 5.6 각 전기 프로파일 5.9에 단계를 반복합니다.
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Representative Results
유전자형과 그 변종의 정의
식별 된 모든 유전자형에서 하나 이상의 주파수 대역이 상이한 전기 영동 프로파일은 새로운 유전자형으로 간주된다. 새로운 유전자형은 이름과 확장 푸르니에 등에 따라. 5 GTAZ의 유전자형 GTAA 다음 GTZ의 유전자형 GTA, 선도 및 GTBA GTBZ, 그리고 GTCC에 GTCA 현재된다. 한 밴드의 변화는 유전자형 변형으로 간주된다. 그것은 유전자형 (예를 들어, GTRI, GTRII)의 이름 뒤에 상 첨부 로마 숫자로 표시됩니다. 총, 참조 데이터베이스에 141 유전자형 및 변형은 현재 존재한다.
푸르니에 등으로, RS-PCR. 5 위에 설명 된 조건에서 S.의 균주 유전자형하는 것이 매우 재현 구균. (A)의 최종 확인기술적 문제를 배제 할 수 있으면 공지의 유전자형 또는 변형은 항상 가능하다. 전형적인 결과는 12 RS-PCR 산물의 전기 영동을 보여주는도 1에 제시하며 bioanalyzer 소프트웨어에 의해 의사 겔 모드에서 제공된다. 각 레인은 끝에서 두 개 이상의 PCR 밴드 패턴과 앞의 마커와 마커 밴드 대역을 특징으로한다. 차선에 두 번 클릭하면 별도의 창에서 해당 실제로 측정 된 전기 영동 프로필을 엽니 다. bioanalyzer 소프트웨어는 관측 봉우리가 하나의 피크는 의사 젤 모드에서 정확히 하나의 대역에 해당된다 (그림 3) 형광 단위 FU와 같은 크기 (그림 2) 또는 혈압 읽는, 다른 가능성들, 수 있습니다. FU의 피크 독서는 마 소프트웨어의 프로파일의 관련 피크 (그림 4) 평가 유전자형을 추론하기위한 혈압 독서가 필요합니다. 무관 피크 작은 완두콩과 마 소프트웨어에 정의되어 있습니다그 관찰 된 형광 FU KS는 가장 높은 형광을 가진 4 (3) 피크의 기하 평균의 40 % 이하이다. RS-PCR에서 DNA의 과잉이 (> 30 순수한 DNA / 분석을 ng를)있을 때 그들은 일반적으로 관찰되는 2.
예를 들어, 그림 1의 시료 211 본의 유전자형이 추정된다. 관련이없는 봉우리를 테스트하기 위해 도구를 사용하여 마할 소프트웨어를 사용하여 전기 영동 그림 2의 프로필 (bioanalyzer 소프트웨어) 및 분석의 시각적 분석은 395 BP, 432 BP, 453 BP, 505 BP, 567 BP의 최대 크기 (6) 관련 피크를 밝혀 622 BP (그림 3). 이 값은 충전 및 텍스트 상자 "입력 봉우리 (BP)의"마 소프트웨어 (그림 4)에서 쉼표 (,)로 구분됩니다. 실행 별 편차를 보정하려면, 값 415 (그림 4) "피크 (BP) 관찰"텍스트 상자에 삽입 하였다. 은 "C를 누르면 한 후alculate "버튼이 목록은 쿼리 및 표시 유전자형 프로파일 사이의 제곱 마할 라 노비스 거리 D2M과 함께 유전자형의 지시 표시됩니다. 최소한의 D2M 찾고 목록을 스크롤합니다. 본 경우, 최소한의 D2M 함께 (그림 4) 4.499 동일하다 조회 된 프로필이 크게 GTB의 하나 다르지 않음을 의미 P ≥0.05의 값입니다.
유전자형의 변형은 마 소프트웨어에서 _XV하는 _i로 표시됩니다. 유전자형 B의 경우에, I GBT, GBT II 및 III GBT 소프트웨어 (도 4)에 B_I, B_II 및 B_III로 표시된 세 가지 변형들이있다.
클럽 메드 키트의 칩은 한 번에 12 RS-PCR의 분석 제품을 수 있습니다. 이하의 제품을 사용할 수있는 경우, 나머지 웰은 탈 이온수로로드 될 필요가있다. 결과는 컨트롤 경우 해석 될 수 난RS-PCR에 ncluded이 적합합니다.
S.의 그림 12 RS-PCR 제품과 유추 유전자형을 나타내는 1. 의사 젤. 십이 다른 균주 구균은 bioanalyzer 및 포함 된 소프트웨어와 함께 MED 키트를 사용하여 RS-PCR로 분석 하였다. 좌측의 레인은 혈압이 시스템의 크기가 교정 용 마커 또는 "사다리"를 나타낸다. 마 소프트웨어에 의해 획득 된 그래픽, 샘플 이름과 해당 유전자형이 기소되는의 상단에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SA 2. 전기 영동 프로파일 도표측정 된 형광 FU에 표시됩니다 피크의 상단에 그림 1 mple 161 본. bioanalyzer 소프트웨어의 필요에 의해 검출되지 않았다 시각적으로 구별 피크가 (파란색) (113) FU의 추정 형광 값이 피크에 대해 수행으로 플롯에서 그들을 읽어 추정 할 수 있습니다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
그림 3. 크기가 BP에 표시됩니다 피크의 상단에 그림 1에있는 샘플 (211)의 전기 영동 프로필. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 마 소프트웨어 4. 스크린 샷. 텍스트 상자 "입력 봉우리 (BP)"에서 그림 3의 샘플 (211)의 최대 크기는 채워집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
RS-PCR (> 30 순수한 DNA / 분석 겨)에서 DNA의 초과가있을 때 전체 공정의 가장 중요한 단계는이. 그 피크가 모두 기준선에서 시작 및 종료하는 경우 일반적으로, 프로파일의 해상도가 최적이다. 두 개의 피크가 서로 너무 가까이있는 경우, 해상도는 완전하지 않습니다. 수동 식별을 필요되도록 이러한 조건 bioanalyzer 소프트웨어 부적절한 피크 식별을 초래할 수있다.
BP 또는 FU로 표현 모든 눈에 띄게 분리와 관련 피크는 추가 분석을 위해 포함되어 있습니다. 너무 많은 템플릿 DNA RS는-PCR 넓은 피크가 발생하기 때문에 피크의 중복 및 장애 해결을 피크. 또한, 이동은 유전형이 더 이상 추론 수 없도록 잘못 증가 크기 피크 느려질 선도이다. 마지막으로, 관련성의 피크의 수가 크다. 3 개 이상의 봉우리와 프로파일의 경우, 최대 형광과 피크는 일반적으로 150 FU를 초과 할 수 없습니다.
기계에 대한 투자가 필요하고, 프리 마 소프트웨어가 필요하다는 사실에 의해 한정되는 바와 같이 RS-PCR에 의한 유전자형. 사실, 표준 PCR 시스템과 bioanalyzer가 필요하다. 전자는 후자보다 비싼 반면, 요즘은 오히려 싼. 아가 로즈 전기 영동 기반의 해상도는 고해상도 아가 로스 사용하더라도 충분하지 않다. 이러한 조건 하에서는 GTB, GTC, 모든 다른 유전자형을 구별하는 단 수있다. 클럽 메 키트 또는 아가 로스 전기 영동을 사용하여 전기 영동에 대한 비용은, 그러나, 유사하다. 더 bioanalyzer와 함께 MED 키트는 정직하고, 후자의 방법이 편리하는 방법으로 표준 아가 로스 전기 영동을 능가하는 성능, 얻어진 데이터는 상당히 저장 및 추가 분석을 단순화 전자 형태로 존재한다. 원칙적으로 모든 상업적으로 이용 가능한 bioanalyzers 분석이 유형에 적합한는 electrophoret 것을 제공IC 해상도가 충분하고 밴드 수득 크기는 정확한 바이어스이다.
S.의 소 균주에 대한 RS-PCR의 해상도 구균이 높다. 그것은 스파 입력만큼 좋은, 그리고 MLST 및 PFGE 4,14보다. 또한, 일반적으로 하위 유형 S. 사용될 모든 다른 타이핑 방법에 비해 96 샘플이 하나의 RCR의 (일반적으로 O / N) 실행 및 전기 영동에서 처리 할 수있는, DNA 추출이 쉽고 빠르게 및 유전자형 추론은 정직 : 구균 (스파 입력, MLST, PFGE)는, 그 샘플 처리량이 높다. 96 샘플의 완전한 분석은 PCR을위한 하나의 밤과 전기 및 평가에 대한 일일 필요합니다. 포니 외. (2)에 의한 RS-PCR의 다른 장점은 두 방향 (15)에서 서열화되는 일곱 유전자를 필요 MLST에 비해 특히 낮은 비용이다. 또한, RS-PCR은 균주의 유일한 방법 예측 contagiosity 및 병원성입니다소에 관여하는 황색 포도상 구균은 임상 수의학에 2,5, 주요 예측 인자를 유선염. 마지막으로, RS-PCR 단독 소 S.의 역학을 조사하기에 충분한 구균 3,4,5,14. 몇 주요 유전자형이 2, 3을 관찰로 데이터의 해석도 국제적인 맥락에서 정직이다. 후자의 방법이 널리 많은 양의 데이터를 사용할 수 있도록 인간 균주를 하위 유형을 위해 사용되는 소와 인간 균주, RS-PCR 및 스파 입력 사이의 역학 비교를 위해 함께 바람직하다. MLST 그러나 균주 15 clonality 평가에 적합하며 계통 4를 분석한다.
PCR을 클러 관한 문제, MED 키트 및 bioanalyzer 경우, 해당 매뉴얼 협의하여야한다. 적합한 양성 및 음성 PCR 컨트롤 INC하는 경우에는 RS-PCR 법의 경우, 문제가 대규모 간략화각 실행에 luded. 양성 대조군이 부정적이면, PCR 믹스 적절히 구성된 및 / 또는 제어 DNA가 분해되는 않았다. 음성 대조군은 (H 2 O), 하나 이상의 밴드를 생성, PCR 믹스 일부 DNA로 오염 된 경우. 두 경우 모두에서, 상기 프로파일 해석 RS-PCR 반복되어야해서는 안된다. 해석 인해 전기 문제 불가능하면, 전기는 새로운 칩을 사용하여 반복해야한다. 전기 문제는 일반적으로 부적절한 마이그레이션 및 하나의 정렬 또는 부적절한 적재 및 칩의 조작으로 인한 두 마커 대역을 특징으로한다. 얻어진 전기 영동 프로파일이 마 소프트웨어에 의해 해석 될 수없는 경우, bioanalyzer 소프트웨어에 의해 생성 된 프로파일 파일이 상기 평가 작성자에게 전송된다. 일반적으로는 너무 주형 DNA는 RS-PCR에 사용 된 프로파일 또는 새로운 유전자형 또는 유전자형 변형을 나타낸다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw = 121.14 g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24 g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5 mol/L | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
References
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