Abstract
בגופם של יונקים מצויד שכבות שונות של מנגנוני המסייעים להגן על עצמה מפני פלישות הפתוגן. פגוציטים מקצועי של המערכת החיסונית - כגון נויטרופילים, תאים הדנדריטים, מקרופאגים - לשמר את היכולת המולדת לזהות ולנקות כגון פתוגנים פולש דרך phagocytosis 1. Phagocytosis כרוך האירועים כוריאוגרפיה של ארגון מחדש הממברנה שיפוץ אקטין על שטח פני התא 2, 3. Phagocytes בהצלחה להפנים ולמגר מולקולות זרות רק כאשר כל שלבי phagocytosis מתמלאים. צעדים אלה כוללים הכרה ומחייבת של הפתוגן על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) המתגורר על פני התא, היווצרות של כוס phagocytic באמצעות בליטות קרומיות מועשר תקטנה (pseudopods) להקיף את החלקיקים, וכן פרדה של phagosome ואחריו התבגרות phagolysosome כי תוצאותהרג של הפתוגן 3, 4.
הדמיה וכימות של שלבים שונים של phagocytosis היא אינסטרומנטלית הבהרת המנגנונים המולקולריים של תהליך הסלולר זה. כתב היד הנוכחי מדווח שיטות ללמוד את השלבים השונים של phagocytosis. אנו מתארים גישה מבוססת מיקרוסקופ כדי לחזות ולכמת היווצרות הכוס המחייבת, phagocytic, והפנמת החלקיקים ידי פגוציטים. כפי phagocytosis מתרחשת כאשר קולטנים מולד על תאי phagocytic נתקלים הליגנדים על חלקיק יעד גדול מ -0.5 מיקרומטר, המבחנים אנו מציגים כאן מהווים את שימוש קנדידה אלביקנס פטריות פתוגניות וחלקיקים אחרים כגון zymosan וחרוזים מצופים IgG.
Introduction
למרות החשיפה הממושכת פתוגנים כגון חיידקים, וירוסים ופטריות, הגוף שלנו הוא מאובזר עם מנגנון החיסון המספקים הגנה מפני זיהום. מערכת החיסון המולדת היא קו ההגנה הראשון נגד פתוגנים פולשים והוא מסתמך בעיקר על תאי phagocytic שמזהים ולהפנים יעדים זרים.
Phagocytosis היא תהליך הסלולר שמור באבולוציה שמקיף לבליעת חלקיקים לא רצויים יותר מ -0.5 מיקרומטר. תאי Phagocytic להביע מגוון רחב של קולטני חיסון (הידוע גם בשם קולטנים זיהוי תבניות, PRRs) על פני התא המאפשרים להם לזהות דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) בהווה על פתוגנים לפני היבלעות 3. פתוגן כריכה ואחריו אשכולות קולטן על פני התא ומפעיל היווצרות כוס phagocytic. התוצאה היא שיפוץ קרום מונחה יקטין שבולט סביבהמטרה, בסופו של דבר שעוטפת אותו ולצבוט פעמיים לגבש vacuole 2 דיסקרטי phagosomal, 5. Phagosome אז מתבגר acidifies ידי ההיתוך הבא עם endosomes מאוחר lysosomes המהווה phagolysosome 6.
למרות phagocytosis מתואר אירוע קולטן בתיווך מונחה תקטין, תהליך זה מסתמך גם על שינוי מרחבית-טמפורלית של שומנים שמרכיבים קרום הפלזמה, כגון phosphoinositides (חוקרים פרטיים) ו ספינגוליפיד 7, 8. בעוד פילמור אקטין מוכתב על ידי הצטברות מקומית של phosphoinositol-4,5-biphosphate (PI (4,5) P 2) בבסיס של כוס phagocytic, depolymerization אקטין תלוי המרה של (PI (4,5) P 2 עד phosphoinositol-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. שני שינוייםהם חיוניים כמו המוביל לשעבר הרחבה מוצלחת של pseudopods סביב המטרה ואת האחרונה מאפשרת שוקעת של חלקיקי cytosol של תָא בַּלעָן 10.
תאים שיש להם את היכולת phagocytose הם או phagocytes מקצועי, כמו מקרופאגים / מונוציטים, גרנולוציטים / נויטרופילים, ותאים דנדריטיים (DCS) או phagocytes מקצועיים, כגון פיברובלסטים ותאי אפיתל 11. Phagocytosis מבוצע על ידי כל פגוציטים מלא תפקיד מרכזי תחזוקת רקמות שיפוץ, בעוד phagocytosis מבוצע על ידי פגוציטים מקצועי אחראי על התיאום של התגובה החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות נגד פתוגנים. פגוציטים מקצועי לא לבלוע רק ולהרוג את הפתוגן, אלא גם אנטיגנים ההווה אל תאי הלימפה של המערכת החיסונית אדפטיבית. זה תורם לשחרור הפרו דלקתי ציטוקינים להתקשרות של תאי הלימפה, ועל כך באהמצור המוצלח של זיהום 12.
טכניקות ביוכימיות קונבנציונליות כבר סייעו צובר ידע לגבי המנגנון המולקולרי של תהליכים תאיים שונים במהלך phagocytosis, כגון שלאחר translational שינויים ואגודים גבוהה זיקה שונה בין חלבונים. עם זאת, קשה לקבל מידע לגבי הדינמיקה במרחב ובזמן של אירועי phagocytic בשיטות ביוכימיות הקונבנציונליות. הדמית תא חי לא רק מאפשרת לנו לפקח אירועים הסלולר באופן בתקופה רגיש אלא גם מאפשרת לנו לקבל מידע ברמת תא בודד. כאן אנו מתארים שיטה לחקור את השלבים השונים של phagocytosis, וכן לנתח את התהליך כולו spatiotemporally באמצעות מיקרוסקופ confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת DC2.4 ו- RAW 264.7 שורות תאים
הערה: שורת התאים דמוי מקרופאג RAW 264.7 ואת DC2.4 שורת תאים דנדריטיים הוא ממוצא בעכברים, ואת התנאים הבאים שמשו לגדל את התאים.
- לגדול RAW 264.7 תאי DMEM (המדיום של הנשר המינימאלי של Dulbecco) בתוספת 10% בסרום שור עוברי מומת (FBS) על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified עם 5% CO 2.
- לגדל תאים DC2.4 בתנאים דומים לזה של תאי 264.7 RAW, למעט שימוש RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני בתוספת L- גלוטמין במקום DMEM.
2. הכנת חלקיקים מצומדת פלורסנט: ג אלביקנס, Zymosan, חרוזים IgG מצופה
- גידול קנדידה אלביקנס
- לחסן SC5314 זן ג אלביקנס ממלאי גליצרול קפוא ב 25 מ"ל של YPD השלימו עם אורי (2% Bacto-peptone, 1%תמצית שמרים, גלוקוז 2% ו -80 מיקרוגרם / מ"ל uridine) לילה ב 30 מעלות צלזיוס.
הערה: הימנע גדל בתרבות קנדידה יותר OD של 600 12. - קח 1 מ"ל של ג אלביקנס ומסובב אותו XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה עם 1 מ"ל של PBS.
- אסוף את הכדור על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב 2.1.4.
- חישוב ריבוי זיהום (משרד הפנים) של ג אלביקנס ביחס למספר פגוציטים והמשך עם assay phagocytosis כמתואר בסעיף 3. OD 600 של 1 שווה 2.5 x 10 7 קנדידה אלביקנס לכל 1 מ"ל.
הערה: הדור של קנדידה-BFP מתואר הפניה 13.
- לחסן SC5314 זן ג אלביקנס ממלאי גליצרול קפוא ב 25 מ"ל של YPD השלימו עם אורי (2% Bacto-peptone, 1%תמצית שמרים, גלוקוז 2% ו -80 מיקרוגרם / מ"ל uridine) לילה ב 30 מעלות צלזיוס.
- הכנת Zymosan וחרוזים מצופים IgG
הערה: Zymosan הוא β-גלוקן המכילהכנה חלקיקי הפחמימות פטרייתי כי נגזר שמר האפייה. Zymosan ידוע לעורר אותות דלקתיים מקרופאגים ותאים דנדריטיים, וזה כבר נעשה שימוש נרחב במחקרים phagocytosis 13, 14, 15.- בקצרה מערבולת הצינור שמכיל את החלקיקים, ו aliquot סכום מספיק עבור ניסוי לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
הערה: בדרך כלל אנו משתמשים 1:10 יחס (עבור תא אחד, להוסיף 10 חלקיקי zymosan או חרוזים מצופים IgG). - הוסף 1 מ"ל של קרח קר PBS, לאסוף את חלקיקי על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב g 10,000 x.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל קר כקרח PBS.
- חזור על שלבים 2.2.2-2.2.3
הערה: עבור לשלב 2.2.5 או לאחסן את הצינור ב 4 ° C עד השימוש. - Sonicate חלקיקים במשך 10 שניות ב sonicator באמבטיה קולי (120 וולט, 50-60 kHz) על מנת למנועאגרגציה NY.
- בקצרה מערבולת הצינור שמכיל את החלקיקים, ו aliquot סכום מספיק עבור ניסוי לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
3. Phagocytosis
הערה: Phagocytosis הוא תהליך מורכב שמתחיל המחייב של חלקיקים על פני התא של פגוציטים באמצעות אינטראקציה של PRRs עם ליגנדים על פני השטח של החלקיקים. כריכה ואחריו הרכבה של אקטין וחלבונים הקשורים אליו באתר של מגע, לבין היווצרות של כוס phagocytic. הפירוק יקטין העוקבות מתרחש בבית phagosome ותוצאות לבליעה המלאה של החלקיקים. להלן נתאר את השלבים השונים של phagocytosis.
- Assay כריכה
הערה: מטרת ניסוי זה היא לפקח על הצעד הראשון של phagocytosis המערב את האינטראקציה בין הליגנדים על חלקיקי היעד ואת הקולטנים על פגוציטים.- זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. Alternatively, תאי צלחת על תלושי לכסות (ב 24 או 12 גם בפורמט) או 96-גם צלחות זכוכית תחתונה. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: תאים ניתן לספור באמצעות hemocytometer או בטכניקה דומה. - מניח את השקף הקאמרי (או צלחת) ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- בעדינות להסיר את המדיום מבאר כל בעזרת פיפטה או aspirator.
זהירות: בצע פעולה זו בזהירות כמו גם כל מערכת coverglass חדרים קטן; קל לטרוד תאים עם קצה פיפטה או זרימת אוויר חזקה של aspirator. - מערבבים את חלקיקים שכותרתו fluorescently עם תרבית תאים בינוניים (מוכן כמתואר לעיל). להוסיף קנדידה -BFP (ב משרד הפנים של 10), fluorescently מצומדות-zymosan או לטקס חרוזים ארנב IgG-FITC (10 חלקיקים לכל תא) אל התאים. השתמש נפח סופי של 200 מדיה μl עבור תא אחד טוב על מנת להבטיח את כל התאים מכוסים.
- ספין במורד המגלשה הקאמרית ב 277XG 3 דקות ב C ° 10.
הערה: צעד צנטריפוגה זה עוזר להגדיל את הקשר בין חלקיקי התאים, והוא מסנכרן את התהליך המחייב. - מייד להעביר את השקופית הקאמרית חממת humidified 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 5 דקות.
- להסיר את השקופית הקאמרית מן החממה לשאוב התקשורת.
- שוטפים את התאים 3x עם PBS קר כקרח.
הערה: בדוק את הנוכחות של חלקיקים מאוגדים עם מיקרוסקופ אור ולשטוף יותר פעמים עם PBS במידת צורך. זה חיוני כדי להסיר חלקיקים מאוגדים מן הבאר כדי למזער את רעש ברקע במהלך הניתוח. - תקן תאים על ידי הוספת paraformaldehyde 500 μl 4% (PFA) מדולל PBS על ידי דוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
זהירות: שלב זה מחייב שימוש של 4% PFA שהוא מאוד רעיל, מאכל, ואת קרצינוגן פוטנציאלי. זהירות פרופר צריך לקחת בעת שימוש נוזל זה. כמו כן, להגן דגימות מן האור. - חזור 3.1.9 צעד פעמים.
הערה: בשלב זה, למלא בקבוקון אחד מייד לאחר הסרת PBS הקודם. - עצור את קיבעון על ידי דוגרים עם 500 μl של 50 מ"מ NH 4 Cl ב PBS במשך 10 דקות.
- שטוף תאים פעמים עם PBS כמתואר בשלב 3.1.10.
- Permeabilize תאים ידי הוספת 250 μl חיץ מחייב (saponin 0.1%, 0.2% BSA ב PBS) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכתם F- אקטין על ידי הוספת phalloidin מצומדות fluorescently (מדולל 1: 500 במאגר מחייב). דגירה תאים עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS כמתואר בשלב 3.1.10.
- צלמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal (אובייקטיבי 63X, ו -402 ננומטר 488 ננומטר לייזר) ולנתח תמונות באמצעות ImageJ 16.
הערה: חלקיק מוצלח כריכה מאופיין בנוכחות של מ"ק phagocyticp באתר שבו קשר חלקיקי התא phagocytic (איור 1). ראה שלב 3.2.5.
- זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. Alternatively, תאי צלחת על תלושי לכסות (ב 24 או 12 גם בפורמט) או 96-גם צלחות זכוכית תחתונה. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- Phagocytosis Assay הספיגה
הערה: ניסוי זה נועד לפקח על ההפנמה המלאה של חלקיקים שכותרתו fluorescently ידי פגוציטים באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור 2).- זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. לחלופין, תאי צלחת על תלושי לכסות (ב 24 או 12 גם בפורמט) או זכוכית תחתונה 96-גם צלחות. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: תאים ניתן לספור באמצעות hemocytometer או בטכניקה דומה. - שמור את השקופיות הקאמריות (או צלחת) ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
הערה: הקירור הוא הכרחי על מנת לחסום אנדוציטוזה וכן phagocytosis הרצויה, ולאחר מכן יש phagocytosis מסונכרן. - Perfצעדי ORM מ 3.1.3 ל 3.1.5
- מעביר את השקופית הקאמרית חממת humidified 37 ° C עם 5% CO 2, דגירה במשך בנקודות זמן שונות. תקן תאים לאחר 30, 60 ו -90 דקות שלאחר זיהום. שים לב ג אלביקנס מתחיל להיוצר עובש בבית הזיהום שלאחר 60 דקות; פגוציטים מתחילים להראות מוות של תאים (pyroptosis) לאחר 90 דקות 8.
הערה: זוהי המלצה, ואופטימיזציה חיוני תלוי בסוג התא ואת החלקיקים בשימוש. - בצע צעדים מן 3.1.7 כדי 3.1.15. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ 16.
הערה: ספיגה מוצלחת מאופיינת הפנמה מלאה של חלקיקים בתוך הציטופלסמה של תָא בַּלעָן (איור 2). מכתים את פגוציטים בטוש פני התא כגון phalloidin מסייעת להתוות את קווי המתאר של תאים. כמו כן הוא חיוני לבצע ערימות z כדי לקבוע אם החלקיקים מאוגדים פני תא או Completely הפנים.
- זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. לחלופין, תאי צלחת על תלושי לכסות (ב 24 או 12 גם בפורמט) או זכוכית תחתונה 96-גם צלחות. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- הדמיה חיה של Phagocytosis
הערה: בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ confocal ללכוד את השלבים השונים של phagocytosis באמצעות fluorescently מצומדות zymosan. אנו משתמשים שורת תאים דנדריטיים DC2.4 ביציבות מבטא mCherry-tagged F- אקטין 8, biosensor כי התפלגות אקטין פילמנטיות בתאים חיים. מאז phagocytosis היא תהליך אקטין מונחה הדמיה חיה בתא הזה לא רק מאפשר לנו ללכוד את התנועה והדינמיקה של רשת ה- F- אקטין, אבל גם לדמיין את האירועים phagocytic שונים בתוך תאים חיים (איור 3, סרט 1).- זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית בריכוז כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: תאים ניתן לספור באמצעות hemocytometer אובטכניקה דומה. - שמור את השקופיות הקאמריות על קרח למשך 10 דקות.
הערה: הקירור הוא הכרחי על מנת לחסום ספיג רצוי, וכדי לקבל phagocytosis מסונכרן. - בצעו צעדים מן 3.1.3 כדי 3.1.5
- טרום לחמם את הבמה מיקרוסקופ כדי 37 מעלות צלזיוס, לאזן את החדר עם 5% CO 2. מתן 30-45 דקות עבור הטמפרטורה ואת CO 2 לייצב לפני תחילת ההדמיה.
הערה: מאז CO 2 רמות הטמפרטורה הן קריטיות עבור phagocytosis, חשוב להדליק את החימום מיקרוסקופ לפני הניסוי כדי לאזן את בתא סביבתי. - מניח את שקף התא המכיל את התאים במארז חממת מיקרוסקופ equilibrated על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- בהופעה חיה הדמיה 17, 18.
הערה: ההגדרות עבור כוח לייזר (רווח, חריר, וכו ') יכול להשתנות בהתאם לסוג של המיקרוסקופ אלקטרוני ו בדיקה ניאון בשימוש. לכן, אנו ממליצים להתייעץ במדריך של המיקרוסקופ למצב אופטימלי עבור הדמיה לחיות שלך 17,18.- השתמש מיקרוסקופ סורק לייזר confocal (ואת התוכנה הנלווית) עבור הדמיה לחיות. השתמש אובייקטיבי שמן 63X 1.4NA עם חריר של 1-1.1 יחידות אווריריות.
- כדי להפעיל את ההדמיה, השתמש בשדה הבהיר למצוא באזור נציג בשקופית הקאמרית. לאחר מכן, בחר את השדה על ידי לחיצה על אפשרות מיקום על התוכנה. כדי לזהות GFP ב Track 1 השתמשה במערכת סינון עבור לייזר 488 ננומטר עם קרן splitter ב 582 ננומטר, לגלות אורכי-גל בין 488 ו 582 ננומטר.
- במסלול 2 לבחור לסנן להגדיר אופטימלי עבור mCherry (RFP) באמצעות מפצל קרן 578 ננומטר גילוי באורכי גל שבין 578 ו -600 ננומטר. השתמש 488 ננומטר 578 nm לייזרים עם כוח לייזר 50% וכן פלט רווח של 600-700. להשיג תמונות כל 30 שניות עבור סכום כולל של 90 דקות.
- זרע על 5 x 10 4 תאי שקופית קאמרית בריכוז כך שהם ומחוברים 60-70% בזמן הניסוי. דגירה תאים לילה בשעה 37 חממה humidified מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשיטה המבוססת על מיקרוסקופ כדי לפקח על השלבים השונים של phagocytosis מוצגת. האירועים השונים במהלך phagocytosis של חלקיקים שונים ניאון על ידי תאי DC2.4 מוצגים. באמצעות הטכניקות המתוארות כאן, חקרנו את תפקיד ספינגוליפיד בשלבים המוקדמים של phagocytosis. לשם כך, תאים דנדריטים DC2.4 גנטית חסר Sptlc2, האנזים המזרז את הצעד הראשון ומגביל הקצב במסלול biosynthetic ספינגוליפיד, שימשו. לעומת תאי סוג ברים, Sptlc2 - / - תאי DC2.4 צמצמו באופן משמעותי רמת ספינגוליפיד כולל ceramide, ספינגומיילין ו glucosylceramide 8. Sptlc2 - / - תאים DC2.4 פגומים מחייב, וכן את הספיגה של ג אלביקנס, zymosan וחרוז לטכס IgG 8. באיור 1, עקידת fluorescently מצומדות-zymosan חלקיקים בתאים DC2.4 מוצג (ראה Section 3.1 לפרטים נוספים). Sptlc2 - / - תאי DC2.4 הראו באופן משמעותי פחות מחייבים של zymosan מאשר התאים המלאים DC2.4 (p = 0.0008; איור 1 א). מספר חלקיקי zymosan כבול לכל תא היה גבוה משמעותי עבור תאים מלאים מאשר Sptlc2 - / - תאי DC2.4 (p <0.0001; איור 1 ג). אנחנו הבאים בחנו את היכולת של Sptlc2 - / - תאי DC2.4 כדי phagocytose ג אלביקנס. Sptlc2 - / - תאי DC2.4 הראו באופן משמעותי פחות phagocytosis של ג אלביקנס (p <0.0005) בהשוואה לתאי הביקורת (איור 2 א, 2 ב). כצפוי, Sptlc2 מחסר תאים הראו מספר גבוה משמעותית של תאים שאינם phagocytic (p <0.05; איור 1 ג) וירידה במספר ג אלביקנס לכל תא (איור 1 ג ', ד'). תוצאות אלו מדגישות את התפקיד של מסלול biosynthetic ספינגוליפיד שלם מחייב, וכן לאהוא ספיג של חלקיקים. איור 3 מציג את הזמן לשגות התמונות הוכחת בשלבים המוקדמים של phagocytosis (ראה סעיף 3.3 עבור נוהל מפורט). סרט 1 מציג את הדמית החיה של תאי DC2.4 ביציבות להביע F- יקטין, biosensor החושף את החלוקה תקטין פילמנטיות בתאים חיים (ראה סעיף 3.1 לפרטים נוספים).
איור 1: כריכת assay של zymosan בתאי DC2.4. (א) בקרת Sptlc2 - / - תאי DC2.4 הודגרו עם zymosan מצומדות פלורסנטי, ויכולת של כבילת החלקיקים נבדקו על ידי מיקרוסקופיה confocal. החצים מצביעים על אתרי הכריכה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B, C) כימות של מספר החלקיקים zymosan כבול (B) ומספר חלקיקים zymosan כבול לכל גell (C) מוצג. חלקיקי Bound כומתו ומוצגים יחסית האחוז לשליטה. כל הגרפים להציג SD של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולפחות 200 תאים נספרו עבור כל ניסוי. מבחן t מזווג שימש לנתח את המשמעות של ההבדלים שנצפו. ** P <0.001. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תדפיס באישור ואח Tafesse. 2015 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Phagocytosis של C. אלביקנס בתאי DC2.4. (א) תאים נדבקו C andida -BFP כמתואר שלב 3.2. בשעה 90 לאחר הפגיעה דקות, התאים קובעו ונצבעו עם phalloid מצומדות fluorescentlyב צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. (B - D) כימות של מספר התאים הפנימו קנדידה -BFP, הלא phagocytic, ומספר קנדידה -BFP לכל תא מוצגת. כל הגרפים להציג SD של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ולפחות 200 תאים נספרו עבור כל ניסוי. מבחן t מזווג שימש לנתח את המשמעות של ההבדלים שנצפו. ** P <0.001. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תדפיס באישור ואח Tafesse. 2015 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: זמן לשגות הדמיה של ג אלביקנס ספיגה לדמיין בשלבים המוקדמים של phagocytosis. סוג DC2.4 Wild תאים המבטאים F- אקטין ביציבות -mCherry (F- אקטין) הודגרו עם קנדידה -BFP (באדום) צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. תמונות שנתפסו ב 30 מרווחי שניות מוצגות. כוכביים להראות את השלבים השונים של שיפוץ יקטין במהלך phagocytosis. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תדפיס באישור ואח Tafesse. 2015 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1: הדמיה חיה. סוג DC2.4 Wild תאים המבטאים F- אקטין-mCherry ביציבות (מוצג ירוק) נדבקו קנדידה -BFP (באדום). הדמיה חיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופיה confocal כמתואר שלב 3.3. תדפיס באישור ואח Tafesse. 2015 8.s / ftp_upload / 54,646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פגוציטים מקצועי, כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים, לבלוע ולחסל פולשים פתוגנים ולכן עושה phagocytosis מרכיב חשוב של מערכת ההגנה המארחת. במהלך תהליך זה פגוציטים לעבור ארגון מחדש קרום נרחב התארגנות cytoskeleton ב פני התא שלהם 8, 19, 20. כדי להבין טוב יותר בתהליך דינמי זה, ויזואליזציה של השלבים השונים של phagocytosis חיונית. כאן אנו תארנו שיטה מבוססת מיקרוסקופ ששמש כדי לפקח על השלבים השונים של phagocytosis.
המשמעות העיקרית של טכניקת ההדמיה לחיות היא בכך שהוא מספק יכולת יוצאת דופן כדי לפקח על ממשק מארח הפתוגן ברמה המולקולרית. בכך שהוא מאפשר הדמיה של השלבים העיקריים של זיהום מיקרוביאלי, הדמית חיה מספקת תובנה מעמיקות לגבי הטבע הבסיסי של התגובה החיסוניתנגד פתוגנים 8, 10, 21, 22. בנוסף phagocytosis, הטכניקות המתוארות כאן ניתן להרחיב ללמוד סוגים אחרים של אנדוציטוזה קולטן בתיווך, כולל macropinocytosis 10. הדמיה חיה גם גישה רב ערך כדי ללמוד את הקשר בין מאכסן לפתוגן של חיידקים תאיים כגון שחפת Mycobacterium ו typhi סלמונלה, כמו גם טפילים כולל לישמניה Toxoplasma gondii 22, 23.
ישנם מספר יתרונות של הדמית תא חייה מעל הטכניקות האחרות כגון גישות ביוכימיות קונבנציונליות. הדמית תא חייה מאפשרת לנו לפקח על הדינמיקה במרחב ובזמן של תהליכים תאיים 8. יתר על כן, הדמיה לחיות מאפשרת לנו להשיג ליידעation ברזולוציה תא בודד 21. Phagocytosis הוא תהליך הסלולר דינמי המערב את האשכולות של קולטנים, תקטין שיפוץ שומני קרום בתוך כמה דקות 10. הדמיה חיה מאפשרת לנו ללכוד מידע כזה באופן רגיש זמן, וזה אחר קשה להשיג.
המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו היא שהיא דורשת אופטימיזציה זהיר של תנאי ניסוי והגדרות מיקרוסקופ. ישנם מספר מפתח גורמים מכריעים לקבלת תמונות בהצלחה. האיכויות של חלבון פלואורסצנטי (או biosensor) מנוצל כדי להמחיש את פגוציטים (כגון F- יקטין), כמו גם את האופי של הצבע המשמש לתייג את החלקיקים הם היבטים קריטיים של הדמיה. הדמיה חיה, חשוב לא פחות הוא האיזון של חדר הסביבה של התקנת מיקרוסקופ. בהתאם המכשיר, האיזון יכול להימשך בין 15 דקות לכמה שעות. סִיNCE CO 2 אספקה נועדה לשמר pH מתאים בתוך התקשורת והתרבות, יש צורך לאפשר מספיק זמן ריצה לפני הקמת הניסוי. במקרים כאשר אספקת CO 2 אינה מספיקה ו / או לא אחידה, סוכן חציצה כימית אורגני zwitterionic כגון HEPES ניתן להוסיף לאמצעי תקשורת הצמיחה. חשיפה ארוכת טווח של חלקיקים פלורסנט בתאים חיים כדי confocal לייזרים יכול להוביל phototoxicity הלבנה. אופטימיזציה כוח לייזר (זמן החשיפה פחות כן ייטב) ולוודא כי התריסים סגורים בין רכישות התמונה יכולה להפחית את הבעיות הללו. בסך הכל, הטכניקות המתוארות כאן הן אידיאליות עבור בחינת הקשר הדינמי בין פתוגנים ואת פגוציטים במהלך phagocytosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים וונדי סלמון וניקי ווטסון של מתקן קק בבית וייטהד מכון MIT הדמיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D.
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
