Abstract
Тело млекопитающего оснащен различными слоями механизмов, которые помогают защитить себя от патогена инвазий. Профессиональные фагоциты иммунной системы - такие , как нейтрофилы, дендритные клетки, макрофаги и - сохраняют врожденную способность обнаруживать и очистить такие вторжения патогенных микроорганизмов через фагоцитоза 1. Фагоцитоз включает в себя хореографию события мембранной реорганизации и актина ремоделирования на клеточной поверхности 2, 3. Фагоциты успешно усваивают и уничтожить чужеродные молекулы только тогда, когда все этапы фагоцитоза выполнены. Эти шаги включают в себя распознавание и связывание патогена распознающих рецепторов (РРСС), находящихся на поверхности клеток, образование фагоцитарной чашки через актина обогащенный мембранными выступам (псевдоподий), окружают частицы, и разрезка из фагосомы с последующим фаголизосому созревания, что что приводит к Подавлениюубивая возбудителя 3, 4.
Визуализации и количественного определения различных стадий фагоцитоза играет важную роль для выяснения молекулярных механизмов этого клеточного процесса. Настоящая рукопись сообщает методы для изучения различных фаз фагоцитоза. Описан подход микроскопа на основе визуализации и количественной оценки связывания, фагоцитарную образование чашу и интернализации частиц фагоцитами. Как фагоцитоз происходит , когда врожденные рецепторы фагоцитирующих клеток сталкиваются с лигандами на целевой частицы больше , чем 0,5 мкм, анализы приведем здесь включают применение патогенных грибков Candida Albicans и другие твердые частицы , такие как зимозана и бусами IgG , с покрытием.
Introduction
Несмотря на непрерывного воздействия патогенных микроорганизмов, таких как бактерии, вирусы и грибы, наш организм хорошо оснащен иммунный механизм, который обеспечивает защиту от инфекции. Врожденная иммунная система является первой линией обороны против вторжения патогенов и опирается в основном на фагоциты, которые распознают и интернализации внешних целей.
Фагоцитоз представляет собой эволюционно консервативны клеточный процесс, который включает в себя при полном охвате нежелательных частиц более 0,5 мкм. Фагоциты выражают широкий спектр иммунных рецепторов (также известные как рецепторы распознавания образов, РРСС) на клеточной поверхности , которые позволяют им распознавать патоген-ассоциированные молекулярные модели (PAMPs) , присутствующие на патогенные микроорганизмы , предшествующих охвате 3. Возбудитель связывание с последующим кластеризацию рецепторов на поверхности клетки и вызывает образование фагоцитарной чаши. Это приводит к актина приводом мембраны ремоделирования, выступающую вокругцель, в конечном счете , обволакивая его и щипать-офф , чтобы сформировать дискретный phagosomal вакуоль 2, 5. Фагосомы затем созревает и окисляется путем последующего слияния с поздних эндосом и лизосом , что образует фаголизосомы 6.
Несмотря на то, фагоцитоз описывается как рецептор-опосредованного и актина приводом случае, этот процесс также опирается на пространственно-временной модификации липидов, составляющих плазматическую мембрану, таких , как фосфоинозитидов (Pis) и сфинголипидов 7, 8. В то время как актин полимеризация диктуется локальным накоплением фосфоинозитол-4,5-бифосфата (PI (4,5) P 2) у основания фагоцитарной чаши, актин деполимеризации зависит от конверсии (PI (4,5) P 2 фосфоинозитол-3,4,5-бисфосфата (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Обе модификацииимеют важное значение в качестве первого приводит к успешному расширение подталкивателей вокруг цели и последний позволяет погружение частиц в цитозоле фагоцита 10.
Клетки , которые обладают способностью к фагоцитируют либо профессиональных фагоцитов, таких как макрофаги / моноциты, гранулоциты / нейтрофилы и дендритные клетки (ДК) или непрофессиональных фагоцитов, таких как фибробласты и эпителиальные клетки 11. Фагоцитоз в исполнении всех фагоцитов играет центральную роль в поддержании и ремоделирования ткани, в то время как фагоцитоз осуществляется профессиональными фагоцитами несет ответственность за координацию врожденной и адаптивной иммунной реакции против патогенов. Профессиональные фагоциты не только поглотит и убивать патогены, но также присутствуют антигены в лимфоидных клетках иммунной системы адаптивной. Это способствует освобождению провоспалительных цитокинов и зацеплению лимфоидных клеток, следовательно, приводит куспешная блокада инфекции 12.
Обычные биохимические методы играют важную роль в получении знаний о молекулярном механизме различных клеточных процессов во время фагоцитоза, таких как пост-трансляционных модификаций и различных высоким сродством ассоциаций между белками. Тем не менее, трудно получить информацию о пространственной и временной динамики фагоцитирующих событий с использованием обычных биохимических методов. Живая клетка изображений не только позволяет контролировать клеточные события во временной чувствительной манере, но и позволяет получить информацию на одном уровне клетки. Здесь мы опишем метод, чтобы исследовать различные стадии фагоцитоза, а также анализировать весь процесс spatiotemporally с помощью конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение DC2.4 и RAW 264,7 клеточных линий
ПРИМЕЧАНИЕ: макрофагами, как клеточная линия RAW 264.7 и дендритных клеток линии DC2.4 оба мышиного происхождения, а также следующие условия были использованы для выращивания клеток.
- Grow RAW 264.7 клеток в среде DMEM (минимальная среда Игла Дульбекко) , дополненной 10% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
- Рост клеток DC2.4 в подобных условиях с тем, что из клеток RAW 264.7, за исключением использования RPMI (Memorial Institute Roswell Park) среде с добавлением L-глутамина вместо DMEM.
2. Получение флуоресцентных сопряженными макрочастиц: Бисер C. Albicans, зимозаном, IgG-покрытием
- Выращивание Candida Albicans
- Инокулируйте C. Albicans штамм SC5314 из замороженного раствора в глицерине в 25 мл YPD , дополненной Uri (2% Васто-пептона, 1%дрожжевой экстракт, 2% глюкозы и 80 мкг / мл уридин) в течение ночи при 30 ° С.
Примечание: Избегайте выращивания культуры Candida более чем OD 600 от 12. - Возьмите 1 мл C. Albicans и спином вниз при 2000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 мл PBS.
- Собирают осадок центрифугированием при 2000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Повторите шаг 2.1.4.
- Вычислить множественности заражения (МВД) C. Albicans в зависимости от числа фагоцитов и продолжить анализа фагоцитоза , как описано в разделе 3. OD 600 1 эквивалентно 2,5 × 10 7 Candida Albicans на 1 мл.
Примечание: Генерация Кандида-БПС описан в работе 13.
- Инокулируйте C. Albicans штамм SC5314 из замороженного раствора в глицерине в 25 мл YPD , дополненной Uri (2% Васто-пептона, 1%дрожжевой экстракт, 2% глюкозы и 80 мкг / мл уридин) в течение ночи при 30 ° С.
- Получение зимозаном и шариков IgG-покрытием
Примечание: Зимозан представляет собой β-глюкана, содержащейгрибковый препарат углеводов в виде частиц , которые получают из Saccharomyces CEREVISIAE. Зимозан , как известно, вызывают воспалительные сигналы в макрофаги и дендритные клетки, и он широко используется в фагоцитозе исследованиях 13, 14, 15.- Кратко вихрь трубку, содержащую частицы, и аликвоту количество, достаточное для эксперимента в 1,5 мл пробирку.
Примечание: Обычно мы используем соотношение 1:10 (для одной ячейки, добавить 10 частиц зимозаном или шарики IgG-покрытием). - Добавляют 1 мл охлажденного льдом PBS, и собирают частицы при центрифугировании в течение 1 мин при 10000 х г.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл охлажденного льдом PBS.
- Повторите шаги 2.2.2-2.2.3
Примечание: перейти к этапу 2.2.5 или хранить трубку при температуре 4 ° С до использования. - Разрушать ультразвуком твердые частицы в течение 10 сек в ультразвуковой ванне для обработки ультразвуком (120 В, 50-60 кГц), с тем чтобы это неагрегация частиц пу.
- Кратко вихрь трубку, содержащую частицы, и аликвоту количество, достаточное для эксперимента в 1,5 мл пробирку.
3. Фагоцитоз
Примечание: Фагоцитоз представляет собой сложный процесс, который начинается с связывание частиц на поверхности клеток фагоцитов за счет взаимодействия PRRS с лигандами на поверхности частицы. Связывание с последующей сборкой актина и связанных с ней белков в месте контакта, а также образованием фагоцитарной чаши. Последующее актин разборки происходит на фагосому и приводит к полному охвате макрочастиц. Ниже мы рассмотрим различные этапы фагоцитоза.
- Анализ связывания
Примечание: Целью данного эксперимента является наблюдение за первым шагом фагоцитоза, который включает взаимодействие между лигандами на частиц мишени и рецепторов на фагоциты.- Семенной около 5 х 10 4 клеток в камере ползуна таким образом , что они находятся на 60-70% сплошности во время эксперимента. Alternнительно, пластинчатые клетки на покровных стеклах (в 24- или 12-луночного формата) или стеклянным дном 96-луночных планшетах. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
Примечание: Клетки можно пересчитать с помощью гемоцитометра или подобную технику. - Поместите камеру слайд (или пластину) при 10 ° С в течение 10 мин.
- Аккуратно удалите среду из каждой лунки с помощью пипетки или аспиратора.
ВНИМАНИЕ: Выполните этот шаг тщательно, как и в каждую лунку патроннике системы покровного стекла мала; легко возмутить клетки с кончиком пипетки или сильного потока воздуха из аспиратора. - Смешайте флуоресцентно меченных частиц с клеточной культуральной среды (полученного, как описано выше). Добавить Кандида -BFP (при MOI 10), флуоресцентно-конъюгированное зимозан или латексные шарики кроличьего IgG-FITC (10 частиц на клетку) в клетки. С помощью конечного объема 200 мкл среды для одной камеры также, чтобы гарантировать, что все клетки покрыты.
- Спин вниз камеры слайд на 277XG в течение 3 мин при 10 ° С.
Примечание: Этот шаг центрифугирование помогает увеличить контакт между частицами и клетками, и она синхронизирует процесс привязки. - Немедленно передать камеру слайд в увлажненном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 5 мин.
- Снимите камеру слайд из инкубатора и аспирата средств массовой информации.
- Промыть клетки 3 раза охлажденным льдом PBS.
Примечание: Проверьте наличие несвязанных частиц с помощью оптического микроскопа и промыть несколько раз PBS при необходимости. Важно, чтобы удалить несвязанные частицы из скважины, чтобы минимизировать фоновый шум в процессе анализа. - Закрепить клетки путем добавления 500 мкл 4% параформальдегида (PFA), разведенного в PBS путем инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ: Этот шаг требует использования 4% PFA, который обладает высокой токсичностью, коррозионных, и потенциальный канцероген. Правильная осторожность следует проявлять осторожность при использовании этой жидкости. Кроме того, образцы защиты от света. - Повторите 3.1.9 шаг дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, пополнить каждый флакон сразу же после удаления предыдущей PBS. - Прекратить фиксацию путем инкубирования 500 мкл 50 мМ NH 4 Cl в PBS в течение 10 мин.
- Вымойте клетки дважды с PBS, как описано в стадии 3.1.10.
- Проницаемыми клетки путем добавления 250 мкл буфера для связывания (0,1% сапонина, 0,2% BSA в PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Пятно F-актина путем добавления флуоресцентно конъюгированного фаллоидина (разведенного 1: 500 в буфере для связывания). Инкубируйте клетки в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Мыть клетки три раза PBS, как описано в стадии 3.1.10.
- Захват изображений с помощью конфокальной микроскопии (объектив 63X и 402 нм и 488 нм лазер) и анализа изображений с помощью ImageJ 16.
Примечание: Успешным частица связывания характеризуется наличием фагоцитарной у.е.р на месте , где контакт частиц фагоцитарная клеток (рисунок 1). См шаг 3.2.5.
- Семенной около 5 х 10 4 клеток в камере ползуна таким образом , что они находятся на 60-70% сплошности во время эксперимента. Alternнительно, пластинчатые клетки на покровных стеклах (в 24- или 12-луночного формата) или стеклянным дном 96-луночных планшетах. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
- Фагоцитоз Усвоение Анализ
Примечание: Этот эксперимент предназначен для наблюдения полного интернализации флуоресцентно меченых частиц фагоцитами с помощью конфокальной микроскопии (рисунок 2).- Семенной около 5 х 10 4 клеток в камере ползуна таким образом , что они находятся на 60-70% сплошности во время эксперимента. В качестве альтернативы, пластина клетки на покровных стеклах (в 24- или 12-луночного формата) или стеклянным дном 96-луночных планшетах. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
Примечание: Клетки можно пересчитать с помощью гемоцитометра или подобную технику. - Держите камеры слайды (или пластины) при 10 ° С в течение 10 мин.
Примечание: охлаждение необходимо для того, чтобы блокировать эндоцитоза, а также нежелательную фагоцитоз, а затем, чтобы иметь синхронизированное фагоцитоз. - PerfORM шаги от 3.1.3 до 3.1.5
- Перенести камеры слайд в 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2, и инкубируют в течение различных временных точках. Закрепить клетки после того, как 30, 60 и 90 мин после заражения. Заметим , C. Albicans начинают формироваться гифы через 60 мин после заражения; фагоциты начинают проявлять гибель клеток (pyroptosis) через 90 мин 8.
Примечание: Это рекомендация, и оптимизация имеет важное значение в зависимости от типа клеток и частиц, используемых. - Выполните шаги от 3.1.7 до 3.1.15. Анализ изображений с помощью ImageJ 16.
Примечание: успешное поглощение характеризуется полной интернализации в виде частиц внутри цитоплазмы фагоцитом (рисунок 2). Окрашивание фагоциты с маркера клеточной поверхности, такие как фаллоидином помогает очертить контур клеток. Важно также, чтобы выполнить Z-стеки для того, чтобы определить, является ли частицы связаны с поверхностью клеток или комплetely усвоены.
- Семенной около 5 х 10 4 клеток в камере ползуна таким образом , что они находятся на 60-70% сплошности во время эксперимента. В качестве альтернативы, пластина клетки на покровных стеклах (в 24- или 12-луночного формата) или стеклянным дном 96-луночных планшетах. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
- Живая съемка фагоцитоза
Примечание: В этом протоколе мы опишем использование конфокальной микроскопии для захвата различных стадий фагоцитоза с использованием флуоресцентно конъюгированный зимозан. Мы используем дендритных клеток линии DC2.4 , которые стабильно экспрессирует mCherry-меченый F-актин 8, биосенсор , который показывает распределение нитчатых актина в живых клетках. Так как фагоцитоз процесс актина приводом живого изображения в этой камере не только позволяет захватить движение и динамику F-актина сети, но и визуализировать различные фагоцитоза события в живых клетках (рисунок 3, Movie 1).- Семенной около 5 х 10 4 клеток в камере горкой в концентрации таким образом , чтобы они на 60-70% сплошности во время эксперимента. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
Примечание: Клетки можно пересчитать с помощью гемоцитометра или ААналогичный метод. - Держите камере слайды на льду в течение 10 мин.
Примечание: охлаждение необходимо для того, чтобы блокировать нежелательный поглощение, и иметь синхронизированное фагоцитоз. - Выполните шаги с 3.1.3 до 3.1.5
- Предварительно нагреть предметный столик микроскопа до 37 ° С и уравновешивают камеру с 5% CO 2. Подождите 30-45 мин в зависимости от температуры и CO 2 для стабилизации перед началом обработки изображений.
Примечание: Поскольку СО 2 и температурные уровни имеют решающее значение для фагоцитоза, важно , чтобы включить нагреватель микроскопа до эксперимента для уравновешивания климатическую камеру. - Поместите камеру слайд , содержащий клетки в корпусе микроскопа инкубаторе , уравновешенном при 37 ° С и 5% CO 2.
- Выполнение живого изображения 17, 18.
Примечание: Параметры для мощности лазера (усиление, точечным и т.д.) может варьироваться в зависимости от типа йэлектронной микроскопии и флуоресцентный зонд, используемый. Поэтому, мы рекомендуем проконсультироваться с руководством по эксплуатации микроскопа для оптимального состояния для живого изображения 17,18.- С помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (и соответствующее программное обеспечение) для живого изображения. Используйте цель 63X 1.4NA масла с точечным из 1-1.1 единиц Эйри.
- Для запуска обработки изображений, используется яркое поле, чтобы найти репрезентативную область на камеру слайде. Затем выберите поле, щелкнув опцию Позиция на программное обеспечение. Для обнаружения GFP в Track 1 используется набор фильтров для 488 нм лазер с светоделителе на 582 нм для обнаружения длины волн между 488 и 582 нм.
- В Track 2 выберите набор фильтров оптимальной для mCherry (RFP), используя расщепитель луча при 578 нм и обнаруживая длины волн между 578 и 600 нм. Используйте 488 нм и 578 нм лазеров с использованием 50% мощности лазерного излучения и выход усиления 600-700. Получение изображений каждые 30 сек в общей сложности 90 мин.
- Семенной около 5 х 10 4 клеток в камере горкой в концентрации таким образом , чтобы они на 60-70% сплошности во время эксперимента. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метод Микроскоп на основе для мониторинга различных стадий фагоцитоза представлена. Различные события во время фагоцитоза различных флуоресцентных частиц клетками DC2.4 показаны. Используя методы, описанные здесь, мы исследовали роль сфинголипидов на ранних стадиях фагоцитоза. Для этой цели DC2.4 дендритные клетки генетически дефицитные в Sptlc2, фермент, который катализирует первую и ограничивающую скорость шаг в пути биосинтеза сфинголипидов, были использованы. По сравнению с клетками дикого типа, Sptlc2 - / - DC2.4 клетки значительно сниженный уровень сфинголипидов включая керамидов, сфингомиелина и глюкозилцерамида 8. Sptlc2 - / - DC2.4 клетки являются дефектными в связывании, а также в поглощении C. Albicans, зимозаном и IgG латексными шариками 8. На рисунке 1, связывание флуоресцентно конъюгированных-зимозан частицы в клетках DC2.4 показано (см Sectioп 3.1 для более подробной информации). Sptlc2 - / - DC2.4 клетки значительно меньше показали связывание зимозаном чем контроль DC2.4 клеток (р = 0,0008; рис 1А). Число зимозаном частиц , связанных на клетку была значительно выше контрольных клеток , чем для Sptlc2 - / - DC2.4 клеток (р <0,0001; рис 1C). Далее мы исследовали способность Sptlc2 - / - DC2.4 клетки фагоцитируют C. альбиканс. Sptlc2 - / - DC2.4 клетки показали значительно меньше фагоцитоз C. Albicans (р <0,0005) по сравнению с контрольными клетками (рис 2А, 2В). Как и следовало ожидать, Sptlc2-дефицитные клетки показали значительно большее число не-фагоциты (р <0,05; рис 1C) и уменьшилось количество C. Albicans на ячейку (рис 1C, D). Эти результаты подчеркивают роль интактного сфинголипидов пути биосинтеза в связывании, а также в Тон поглощение частиц. На рисунке 3 показаны покадровой изображения , демонстрирующие ранние стадии фагоцитоза (см раздел 3.3 для детальной процедуры). Фильм 1 показывает живого изображения клеток , стабильно экспрессирующих DC2.4 F-актин, биосенсор , который показывает распределение нитчатых актина в живых клетках (см раздел 3.1 для получения более подробной информации).
Рисунок 1: Анализ на связывание зимозана в клетках DC2.4. (А) управления и Sptlc2 - / - DC2.4 клетки инкубировали с флуоресцентной конъюгированных зимозана, и их способность к связыванию частиц рассмотрены с помощью конфокальной микроскопии. Стрелки указывают на сайты связывания. Шкала бар = 100 мкм. (В, С) Количественное числа связанных зимозаном частиц (В) и числа зимозана частиц , связанных в CELL (С) показан. Связанные частицы были определены количественно и представлены как процент по отношению к контролю. Все графики отображения SD трех независимых экспериментов, и, по меньшей мере 200 клеток подсчитывали для каждого эксперимента. Непарное Т-тест был использован для анализа значимости наблюдаемых различий. ** Р <0,001. Шкала бар = 100 мкм. Перепечатка с разрешения Tafesse и др. , 2015 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Фагоцитоз C. Albicans в клетках DC2.4. (А) Клетки инфицировали C andida -BFP , как описано в шаге 3.2. Через 90 мин после инфицирования клетки фиксировали и окрашивали флуоресцентно конъюгированных phalloidв и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии. (Б - Д) Количественное определение числа усвоенных Кандида -BFP, не-фагоциты, а количество Кандида -BFP на ячейку показан. Все графики отображения SD трех независимых экспериментов, и, по меньшей мере 200 клеток подсчитывали для каждого эксперимента. Непарное Т-тест был использован для анализа значимости наблюдаемых различий. ** Р <0,001. Шкала бар = 100 мкм. Перепечатка с разрешения Tafesse и др. , 2015 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Покадровый визуализация C. Albicans поглощение визуализировать ранние стадии фагоцитоза. Дикого типа DC2.4 клетки, стабильно экспрессирующие F-актина -mCherry (F-актин) инкубировали с кандидозного -BFP (показаны красным цветом) и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии. Изображения, снятые в 30-секундными интервалами показаны. Звездочки показывают различные этапы актина ремоделирования в процессе фагоцитоза. Шкала бар = 100 мкм. Перепечатка с разрешения Tafesse и др. , 2015 8. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1: Живая съемка. Дикие клетки типа DC2.4 , стабильно экспрессирующие F-актин-mCherry (показаны зеленым цветом) были заражены Candida -BFP (показан красным цветом). Живая съемка была выполнена с использованием конфокальной микроскопии, как описано в шаге 3.3. Перепечатка с разрешения Tafesse и др. , 2015 8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите сюда, чтобы просмотреть это видео. (Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Профессиональные фагоциты, такие как макрофаги и дендритные клетки, поглотит и устранения вторжения патогенных микроорганизмов, поэтому делает фагоцитоз важным компонентом защитной системы хозяина. В ходе этого процесса фагоциты подвергаются Щирокий мембраны и цитоскелета перегруппировку на их клеточной поверхности 8, 19, 20. Чтобы лучше понять этот динамический процесс, визуализация различных стадий фагоцитоза имеет важное значение. Здесь мы описали метод микроскопа на основе, который был использован для мониторинга различных стадий фагоцитоза.
Основное значение методики живого изображения является то, что она обеспечивает замечательную возможность контролировать интерфейс хозяин-патоген на молекулярном уровне. Обеспечивая визуализацию ключевых этапов микробной инфекции, живой визуализации обеспечивает критическое понимание фундаментальной природы иммунного ответапротив патогенных микроорганизмов 8, 10, 21, 22. В дополнение к фагоцитозу, методы , описанные здесь , могут быть распространены на изучение других видов рецептор-опосредованного эндоцитоза, в том числе макропиноцитозом 10. Живая съемка также является ценным подход к изучению хозяин-патоген отношения внутриклеточных бактерий , таких как микобактерий туберкулеза и сальмонеллы брюшного тифа, а также паразитами , включающими Leishmania и токсоплазма 22, 23.
Есть несколько преимуществ ячейки изображения живой над другими методами, такими как обычные биохимические подходы. Изображений живых клеток позволяет контролировать пространственно-временной динамики клеточных процессов 8. Кроме того, живые изображения позволяет получить информироватьвания в одной резолюции 21 клеток. Фагоцитоз представляет собой динамический клеточный процесс , который включает в себя кластеризацию рецепторов, актина и мембранных липидов ремоделирования в течение нескольких минут 10. Живая съемка позволяет захватывать такую информацию во временной чувствительной манере, которая в противном случае трудно достичь.
Основным недостатком этого метода является то, что она требует тщательной оптимизации условий эксперимента и микроскопа установок. Есть несколько ключевых факторов, решающее значение для успешного получения изображений. Качества флуоресцентного белка (или биосенсора), используемые для визуализации фагоцитов (например, F-актин), а также природы красителя, используемого для обозначения частиц являются критическими аспектами визуализации. Для живого изображения, не менее важным является уравновешивание экологической камеры установки микроскопа. В зависимости от инструмента, уравновешивание может занять от 15 минут до нескольких часов. систь CO 2 питания предназначен для сохранения соответствующий рН в культуральной среде, необходимо , чтобы позволить достаточно времени выполнения перед постановке эксперимента. В тех случаях , когда подача СО 2 является недостаточным и / или неровный, цвиттерионных органический химический буферный агент , такой как HEPES , могут быть дополнены в ростовой среде. Длительное воздействие флуоресцентных частиц и живых клеток в конфокальной лазеры могут привести к фототоксичности и отбеливания. Оптимизация мощности лазера (меньше времени экспозиции, тем лучше) и убедившись, что ставни закрыты между приобретениями изображения может уменьшить эти проблемы. В целом, методы, описанные здесь, являются идеальными для изучения динамические взаимосвязи между патогенами и фагоцитов в процессе фагоцитоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Венди лососем и Nicki Уотсон объекта Кек на Уайтхеда института MIT для работы с изображениями.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D.
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
